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《细胞生物学》实验教学大纲教学单位：植物科学学院课程名称：细胞生物学英文名称：Cell Biology课程代码：08282115课程类别：学科基础课程课程性质：必修课学时数：课程38学时，实验12学时课程学分：3.0学分面向专业：生物技术专业(植物方向)一、实验教学目的与任务《细胞生物学》实验课程是生物技术专业的一门必修课，课程主要目的是通过本课程的讲授和操作，理解细胞生物学研究的一些基本方法的原理，掌握细胞生物学基本方法和实验操作技能，为开展生命科学相关研究打下基础。
课程的任务是通过具体实验使学生掌握细胞生物学基本方法和实验操作技能，如：细胞的形态学观察、细胞器的提取和分离、信号分子如ABA等引起的细胞信号转导过程、细胞的原代培养、基因转化技术，细胞融合技术等，有效地提高理论课的教学效果，并培养学生树立独立设计实验的思考观念和独立处理问题、解决问题的能力。
二、实验教学基本要求1、进入无菌室应该换无菌室内专用的实验服和拖鞋后方可进入。
2、实验前，无菌室及无菌操作台用紫外灯照射30-60分钟灭菌，用70%精擦拭无菌操作台面，并开启无菌操作台风机运转10分钟后，才可开始实验操作。
3、实验用品要用70%酒精擦拭后才能带入无菌操作台内。
4、实验结束后，将所有实验物品带出生物安全柜。
如需要继续进行下一个实验，则用70%酒精擦拭无菌操作台面，再让无菌操作台风机运转10分钟后，才可进行下一个实验操作。
5、实验操作时应注意自身的安全，必须穿戴实验服与手套后才进行实验6、要独立完成符合规范要求的实验报告，做好实验记录并及时总结实验结果三、学生应掌握的实验技术及基本技能1.掌握细胞培养物品及试剂的灭菌方法。
2.掌握细胞培养所需无菌技术的操作要领，注意事项和基本要求，培养和提高独立实验的能力。
3.掌握细胞的形态观察、细胞计数技术、细胞的原代培养技术、传代培养技术、细胞器分离技术，细胞融合技术技术等内容。
4. 培养和提高学生独立操作的能力，使学生较为系统全面地掌握运用细胞生物学研究的技术和方法。
细胞生物学实验指导编者梁亦龙张继承生物信息学院2004年9月前言细胞是一切生物(包括人类)最基本的结构和功能单位。
生命科学中的各个学科领域，甚至非生命科学的许多学科领域中的学者们，越来越多地投入到对细胞生命现象的研究。
细胞是生命的载体，不理解细胞就不理解生命。
在现代生命科学教学中，不设置细胞生物学课，所培养出来的学生就称不上是完全的生命科学家。
在细胞生物学放学中，实验课不可或缺。
实验课的基本任务是，让学生学习细胞生物学基本技术，使他们具有一定的实验操作技能，并培养他们树立独立设计实验的思考观念和进行科研的基本素质。
我们借鉴兄弟院校的经验编写了这本《细胞生物学实验指导》•，供我院开设的各专业选用。
由于我们主客观条件所限，而且编写时间仓促，肯定会有不少缺点和错误，请提出批评意见，帮助我们不断改进教学。
编者梁亦龙2004年9月目录实验是规则与操作要求 (1)实验一细胞形态及大小的观测 (2)实验二相差和暗视野显微镜的原理、使用及标本观察 (5)实验三荧光显微镜原理及应用 (9)实验四电镜参观 (12)实验五植物细胞骨架的显示及光镜观察 (14)实验六人淋巴细胞染色体标本制作 (15)实验七人淋巴细胞姐妹染色体区分染色 (17)实验八碱性磷酸酶的显示 (19)实验九叶绿体的制备及其对染料的还原 (22)实验十人体细胞核型图的制作 (24)实验十一线粒体的分离及活性测定 (27)实验十二联会复合体的染色与观察 (32)实验十三细胞融合 (33)实验十四死、活细胞鉴别 (39)实验十五细胞固定染色法 (41)实验十六早熟染色体凝集（PCC） (43)实验十七细胞同步化 (46)实验十八动物染色体分带技术 (48)实验十九线粒体的显示 (50)实验二十植物愈伤组织培养以及再分化 (52)实验二十一肿瘤细胞培养实验步骤 (57)实验二十二细胞器的分离 (62)实验二十三石蜡切片的制作 (66)实验室规则与操作要求为获得较好的实验结果，避免发生差错与意外事故，特制定以下规则与要求，希望实验者能严格遵守。
细胞生物学实验教案实验一：特殊显微镜的使用及显微摄影术一、实验目的：1、掌握暗视野显微镜、相差显微镜的原理、构造及其使用方法。
2、掌握显微摄影装置及其操作技术，独立完成显微摄影全过程。
二、实验原理：暗视野显微镜应用丁达尔现象，装配暗示场聚光器，是入射光从聚光器斜向照明被检样品。
暗视野显微镜利用样品的散射光和放射光进行观察，只能观察物体的存在与运动而不能辨清其细微结构。
暗视场照明是照明光线仅照亮被检样品而不能进入物镜，使视场背景暗黑，样品明亮的照明方法。
相差显微镜利用被检物体的光程之差进行镜检，通过衍射和干涉现象，将肉眼看不到的相差，变为明暗的振幅差而能看到。
相差显微镜应用于生物学的主要价值，在于对透明的活体进行直接观察，无需采用是细胞致死的固定和染色的方法。
0lympus BH系列的BHS和BHT型显微镜有摄影装置，通过摄影装置，拍摄显微视场中被检样品。
三、实验仪器与试剂1、材料：洋葱鳞茎、人口腔细胞；2、器材：暗视场显微镜、相差显微镜、Olympus显微镜、活体生物样品、擦镜纸、消毒牙签、镊子、滴管、纱布、吸水纸、载玻片、盖玻片3、试剂：生理盐水（0.9%）、2%碘液、香柏油、二甲苯。
四、实验步骤与方法（一）口腔上皮细胞的制备及染色1、把载玻片和盖玻片擦拭干净；2、用滴管在载玻片的中央滴一滴生理盐水；3、用消毒牙签在自己漱净的口腔内壁轻轻地刮几下；4、把牙签上的碎屑放在生理盐水中轻涮几下；5、盖上盖玻片；6、在盖玻片的一侧滴一滴稀碘液；7、用吸水纸吸引,使染液浸润标本的全部。
（二）洋葱鳞茎内表皮装片制作1、把载玻片和盖玻片擦拭干净；2、用滴管在载玻片的中央滴一滴蒸馏水；3、用镊子撕取洋葱鳞茎内表皮置于蒸馏水中；4、盖上盖玻片；5、在盖玻片的一侧滴一滴稀碘液；6、用吸水纸吸引,使染液浸润标本的全部。
（三）分别用暗视场显微镜和相差显微镜观察（四）显微摄影的使用将装片置于显微摄影镜下,选一清晰的视野进行拍摄并打印出来。
实验一普通光学显微镜的结构及其使用一、实验目的1、了解普通光学显微镜的工作原理，掌握光学显微镜的使用方法。
2、熟悉光学显微镜细胞的形态与结构。
二、实验用品普通光学显微镜、生物制片标本、擦镜纸。
三、实验原理和方法1、普通光学显微镜的构造从构造上，主要分三部分：①光学放大系统，为两组玻璃透镜：目镜和物镜；②照明系统：光源、折光镜和聚光镜，有时另加各种滤光片以控制光的波长范围；③机械和支架系统：主要保证光学系统的准确配制和灵活调控。
显微镜的质量主要取决于物镜，物镜是显微镜最主要的光学部件。
物镜的种类很多。
2、显微镜的能力显微镜的能力是质量和性能的标志。
能力包括分辨率、放大率、焦点深度和视场宽度等，其中最重要的是分辨率。
物镜分辨力是指分辨被检样品微细结构的能力。
通常以能清晰地分辨两个物体点的最短距离来表示。
其公式如下：R=0.61λ/N.A.R：分辨率（两点的最短距离）λ：照明光线波长N.A.：物镜数值孔径分辨率以分辨两个点的最短距离表示，R值愈小，分辨能力愈大。
物镜的分辨率与照明光线的波长成反比，与物镜的数值孔径成正比。
3、显微镜的使用①聚光器的调节②光阑的调节③工作距离④油镜的使用4、观察标本注意观察下列结构：①细胞核及核仁：不同细胞的核及核仁――蚕豆根尖切片、兔肝切片（Unna试剂染色）多核及多核仁现象――蛙卵切片、肌肉切片染色体――蚕豆根尖切片、玉米花粉母细胞切片（Giemsa,地衣红或洋红染色）。
②中心体：蝗虫精巢切片（巴西木素染色）。
③线粒体：蚕豆根尖切片、兔肝切片。
④高尔基体：兔肝切片、蚕豆根尖切片（硝酸银或四氧化锇染色）。
四、实验结果简述显微镜的主要结构和操作要领；绘制细胞显微结构图。
实验二线粒体和液泡系的超活染色与观察一、实验目的1、观察植物活细胞内线粒体、液泡系的形态、数量与分布。
2、学习一些细胞器的超活染色技术。
二、实验原理活体染色是指对生活有机体的细胞或组织能着色但又无毒害的一种染色方法。
细胞生物学实验指导2009 年11 月目录前言 (1)细胞生物学实验守则 (2)实验一：动物细胞的基本形态观察和细胞计数 (3)实验二：细胞凝集反应和细胞膜通透性的观察 (6)实验三：聚乙二醇（PEG）介导的细胞融合 (8)实验四：线粒体和液泡系的超活染色与观察 (9)实验五：植物细胞微丝束的光学显微镜观察 (10)实验六：叶绿体的分离与荧光观察 (13)实验七：DNA的显示——Feulgen反应 (15)实验八：小鼠腹腔巨噬细胞吞噬现象的观察 (18)实验九：小鼠骨髓染色体标本的制备与观察 (20)实验十：染色体C-带技术 (23)实验十一：细胞内化学成分的显示方法——酸性磷酸酶的显示 (25)实验十二：开放性实验——蚕豆（Vicia faba）根尖细胞微核监测技术 (27)细胞生物学实验考试大纲····························································错误！未定义书签。
实验考试试题示例········································································错误！未定义书签。
细胞生物学实验指导细胞生物学的发展总是依赖于技术和实验手段的进步，所以学习细胞生物学的技术和方法至关重要。
实验一普通显微镜及其使用（装片观察）一、目的要求：1、掌握显微镜的构造、油浸系的原理、使用方法、保护要点。
2、参观了解其他各类显微镜。
二、材料：普通光学显微镜及其他显微镜、细菌标本片、香柏油、二甲苯、擦镜纸。
三、方法和步骤：1、介绍普通光学显微镜的构造机械部分：镜座、镜臂、镜筒、转换器、载物台、调焦螺旋。
光学部分：接目镜、物镜、反光镜、聚光器。
2、油镜的原理及使用方法原理：油镜头的晶片细小，进入镜中的光线亦少，光线经聚光器，通过载玻片进油镜时，由于空气介质和玻璃介质的折射率不一样，光线因折射而损失，使视野更暗。
在载玻片和油镜之间加上和玻璃折光系数相同的香柏油，光线直接进入镜头，不发生折射，视野明亮，便于观察。
3、如何维护显微镜：机械部分的维护，光学部分的维护。
4、注意事项：（1）观察油镜载片时，先在载片上有菌影的地方滴1-2滴香柏油，然后放载物台中央，眼侧面看，慢慢降低油镜浸入香柏油中，镜头几乎接触标本。
再用左眼在接目镜观察，同时慢慢旋动粗螺旋提起镜筒至能模糊看到物象时，再转动微调螺旋，直至看清晰为止。
注意镜头离开油，就不能看清，重新按刚才的步骤进行。
（2）油镜使用过后，立即用擦镜纸擦拭镜头，如油渍己干，则可用香柏油粘二甲苯擦拭镜头，再用干净擦镜纸擦去二甲苯。
5、观察几种细菌标本片。
6、示教看相差显微镜和荧光显微镜。
四、作业及思考题：1、油镜的原理是什么？2、光线强弱如何调节？与哪些部件有关？实验二、细胞膜的渗透性实验目的了解细胞膜的渗透性及各类物质进入细胞的速度。
实验原理将红细胞放入数种等渗溶液中，由于红细胞对各种溶质的透性不同，有的溶质可以渗入，有的不能渗入，渗入的溶质能够提高红细胞的渗透压，所以促使水分进入细胞，引起溶血，由于溶质透入速度互不相同，因此溶血时间也不相同。
实验用品一、器材50ml烧杯，试管(1〜10cm) ,10ml移液管,试管架。
实验一普通光学显微镜的构造和使用一、目的要求1了解显微镜的基本构造和使用方法2 掌握油镜的原理和使用方法二、显微镜的基本结构及油镜的工作原理1．显微镜的基本构造光学部分：接目镜、接物镜、照明装置（聚光镜、虹彩光圈、反光镜等）。
机械部分：镜座、镜臂、镜筒、物镜转换器、载物台、载物台转移器、粗调节器、细调节器等部件。
2．显微镜的放大倍数和分辨率放大倍数=接物镜放大倍数×接目镜放大倍数显微镜的分辨率：表示显微镜辨析物体（两端）两点之间距离的能力3．油镜的使用原理当光线由反光镜通过玻片与镜头之间的空气时，由于空气与玻片的密度不同，使光线受到曲折，发生散射，降低了视野的照明度。
若中间的介质是一层油（其折射率与玻片的相近），则几乎不发生折射，增加了视野的进光量，从而使物象更加清晰。
三、器材1．永久切片2. 溶液或试剂：香柏油、二甲苯。
3. 仪器或其他用具：显微镜、擦镜纸等。
四、操作步骤1．观察前的准备（1）显微镜的安置，检查零件是否齐全，镜头是否清洁。
（2）调节光源2．显微镜观察（1）低倍镜观察（2）高倍镜观察（3）油镜观察：高倍镜下找到清晰的物象后，提升聚光镜，在标本中央滴一滴香柏油，使油镜镜头浸入香柏油中，细调至看清物象为止。
3．显微镜用毕后的处理观察完毕，上升镜筒，用擦镜纸和二甲苯清洗镜头，后将镜体全部复原。
五、思考题1．用油镜观察时应注意哪些问题？在载玻片和镜头之间滴加什么油？起什么作用？2．为什么在使用高倍镜及油镜时应特别注意避免粗调节器的误操作？实验二胞间连丝的观察一、实验目的观察植物细胞的胞间连丝，加深对胞间连丝功能的认识．二、实验原理植物细胞的细胞壁上有许多原生质的细丝，称胞间连丝。
相邻细胞的胞间连丝相互联接，在细胞间的物质运输与信息传递中起桥粱作用，并使细胞的各种生理活动协调一致，使植物体成为统一的有机体。
用合适的植物细胞为材料，经简单处理，即能方便地看到胞间连丝。
三、实验材料红辣椒表皮细胞临时装片、柿胚乳细胞间胞间连丝切片四、实验步骤1.剪取一小块红辣椒．用小刀小心刮除果肉．2.将上述刮除果肉后极薄的表皮放在载玻片上，滴一滴水，盖上盖玻片，即可往显微镜下观察。
细胞生物学实验教学指导书有丝分裂实验一、实验目的学习植物根尖压片方法的基本技术。
熟悉细胞有丝分裂各个时期的形态特征及染色体的变化，并学会染色体简易永久片的制片技术。
二、实验原理有丝分裂是体细胞分裂的主要方式，一般发生在植物根尖或茎尖的分生组织中。
在有丝分裂时，细胞核与细胞质有很大的变化，但以细胞核内染色体的变化最为明显，而且是有规律地进行。
各种生物染色体在数目上和形态上是相对恒定的，并随科属种的不同而具有一定的特征。
洋葱体细胞中有8对共16条染色体，在有丝分裂过程中，每个染色体能复制一份，然后分配到两个子细胞中，所以两个子细胞与母细胞所含的染色体在数目、形态和性质上都是相同的。
在细胞遗传学研究中，人们常常需要了解某一物种的染色体数目，而最有效的方法就是观察细胞有丝分裂的中期，这样能得到较为准确的结果。
三、实验材料洋葱(Aillum cepa)根尖蚕豆(Vicia faba)根尖四、实验器具和药品试剂显微镜、培养箱、恒温水浴锅、温度计、镊子、解剖针、刀片、载玻片、盖玻片、烧杯、量筒、滴瓶、切片架、切片盒、凹面玻片、青霉素瓶、大培养皿、纱布、吸水纸、铅笔、吸管。
卡诺氏固定液(甲醇或95%乙醇3份，冰醋酸1份)、改良苯酚品红染色液(见附录:实验试剂的配制)、0.002M8-羟基喹啉水溶液、0.05—0.2%秋水仙素溶液、对二氯苯饱和水溶液、1N HCl、95%乙醇、正丁醇、加拿大树胶。
五、实验方法和步骤(一)材料准备选取蚕豆(或小麦、玉米等)种子放在烧杯中，放清水浸泡过夜，使种子吸水胀大后倒出，再用清水洗几次，用多层纱布包好种子，放进20,25?培养箱内培养。
当根尖长1,3cm 时，即可以进行预处理。
(二)预处理为了有利于对有丝分裂中染色体的观察和计数，在固定之前应用理化因素进行预处理，这样可以改变细胞质的粘度，抑制或破坏纺锤丝的形成，促使染色体缩短和分散等。
一般是在分裂高峰前处理1.5小时以上。
处理的方法如下: 1(秋水仙素水溶液常用浓度为0.05,0.2%，室温下处理2,4小时。
《细胞生物学》实验指导书（不太全供参考）适用专业:生物科学、生物技术实验目录实验一植物原生质体的分离与融合•••]实验二动物细胞原代培养•••3实验三细胞传代培养…彳实验四植物细胞骨架的光学显微镜观察••Y实验五细胞凋亡的诱导、观察与检测“I实验六环境因素诱变染色体改组的观察实验七红细胞膜蛋白的分离及其电泳检测 (11)实验一植物原生质体的分离与融合实验项目类型:综合性所属课程名称：《细胞生物学》实验计划学时：7学时一、实验目的1.掌握原生质体分离的原理与技术；2.了解细胞融合的基本原理及应用；3.初步掌握PEG融合法和电融合法.二、实验原理植物原生质体是去除了细胞壁的裸露的细胞.原生质体可以从培养的单细胞、愈伤组织和植物器官（叶等）获得.但一般认为从叶肉组织分离原生质体是理想的材料，其优点是材料来源方便，供应及时，而且遗传性较为一致.原生质体的分离通常采用酶解法，对细胞壁成分进行降解后获得.原生质体培养的条件和对营养的要求与组织、细胞相似.但原生质体由于除去了细胞壁,所以需要一定浓度的渗透压稳定剂来保持原生质体的稳定.常用的渗透压稳定剂包括甘露醇、山梨醇、蔗糖等. 其次，还应当考虑取材、酶的种类和纯度、酶液的渗透压、酶解时间及温度等因素对分离原生质体的影响.2个或2个以上的细胞合并成为1个细胞的现象称为细胞融合.细胞融合的主要方法有病毒法、聚乙二醇(PEG)法和电融合3种方法，其原理基本相同，都是两细胞接触点的膜分子发生重组,然后由于表面张力作用,形成一个球形细胞. 原生质体分离融合和培养的意义：1.除去了细胞壁为植物细胞之间的融合扫平了障碍，为制造新杂种开辟了道路.植物原生质体融合和培养在植物遗传工程和育种研究上具有广阔的应用前景.它是植物同源、异源多倍体获得的途径之一，它不仅能克服远缘杂交有性不亲和障碍，也可克服传统的通过有性杂交诱导多倍体植株的麻烦，最终将野生种的远缘基因导入栽培种中，原生质体融合技术可望成为作物改良的有力工具之一.2.原生质体可摄入外源DNA,细胞器、细菌或病毒颗粒,这些特性与植物全能性相结合为高等植物的遗传饰变打下基础.3.获得细胞无性系和选育突变体的优良起始材料.三、实验仪器与材料1.材料:油菜叶子、白菜花2.溶液或试剂:(1)洗涤液:甘露醇0.7mol/L,CaC12 • 2H2O3.5mmol/L,KH2PO4 0.7mmol/L(pH 5.6),高压灭菌；(2)混合酶液:1.5%纤维素酶,1%果胶酶溶于洗涤液中(pH 5.6).(3)50%PEG(4)高pH高钙稀释液：(5)20%蔗糖溶液(6)DPD培养基：3.仪器或其他用具:超净工作台、灭菌锅、显微镜、恒温培养箱、镶子、解剖刀、剪子、接种针、铝饭盒、锡箔纸、记号笔、橡皮筋、试剂瓶、三角瓶移液管、培养皿、酒精灯等.四、实验步骤(一)原生质体的制备：1.取材:取新鲜油菜叶和白菜花瓣自来水洗净，再用70%乙醇浸泡30S,0.5%次氯酸钠消毒lOmin,无菌水冲洗5次.2.酶解：材料切成1mm宽细丝，加入适量酶液，置摇床上(60〜70rpm),在25〜28°C黑暗条件下，酶解5〜7h.3.分离：用200目网过滤除去未完全消化的残渣，在lOOOrpm条件下离心5分钟,弃上清.加入3〜4ml洗涤液，相同条件下离心2-5分钟，弃上清，留1ml洗液.用滴管将混有原生质体的1ml洗液吸出，轻轻铺于20% 蔗糖溶液上(5ml离心管装3ml 20%蔗糖溶液)，在lOOOrpm条件下离心5-10分钟，由于密度梯度离心的作用，生活力强状态好的原生质体漂浮在20%的蔗糖与洗涤液之间，破碎的细胞残渣沉入管底.用200 u 1移液器轻轻将状态好的原生质体吸出（注意尽可能不要吸入下层的蔗糖溶液），放入另一干净的离心管中，加4ml洗涤液,1000rpm离心2-5分钟, 弃上清.（二）原生质体融合：1.将原生质体用DPD调节浓度为1*105个/mL.2.将原生质体混合物滴入小培养皿，静置8〜10分钟.3.然后滴入50%的PEG溶液，静置2分钟.4.依次间隔5分钟加入0.5ml、1 ml和2 ml高钙高pH洗涤液.注意在第二、三次洗液加入前,用移液器轻轻吸走部分溶液，但不能吸干，否则原生质体破碎死亡;最后用液体培养基洗1〜2次.制片，镜检.五、实验报告画出观察到的融合细胞，并计算融合率.六、思考题1.你认为要获得数量多、生活力强的原生质体，在实验中应注意那些问题？增多数量的方法:多取材且尽量切碎，增加酶浓度，提高酶解温度，延长酶解时间，操作轻柔，勿使原生质体破碎等.提高生活力的方法:取新鲜材料,采用合适的酶浓度、作用温度和时间2.举例说明原生质体融合的应用价值.实验二动物细胞原代培养实验项目类型:基础性所属课程名称：《细胞生物学》实验计划学时：4学时一、实验目的1.掌握动物细胞原代培养的基本方法和操作过程；2.熟悉原代培养细胞观察方法.二、实验原理用直接从机体获取的细胞进行的培养称为原代培养.原代培养是建立各种细胞系的第一步，该技术可以在体外进行各种类型细胞的增殖、遗传、变异、分化和脱分化、恶变与去恶变等研究.分为组织块培养法和消化法两种.三、实验仪器与材料1.材料:小鼠心、肝、脾、肾等2.溶液或试剂：(1)RPMI-1640培养基、小牛血清.(2)0.25%胰蛋白酶、(pH 5.6).(3)Hanks液3.仪器或其他用具:CO2培养箱、倒置显微镜、超净工作台、高压锅、水浴锅、解剖器械、培养瓶、微量加样器、吸管、移液管、酒精灯、酒精棉球等.四、实验步骤1.处死小鼠:将小鼠用颈椎脱臼法处死，放入75%酒精种浸泡消毒.2.取材:在超净工作台中用灭菌的解剖器械剖开小鼠腹腔，辨认并取下肝脏、脾脏和肾脏，放入灭菌的培养皿中，加入Hanks液清洗，然后加入2mL胰蛋白酶液,研磨并过滤.3.将液体转移到离心管,1200rpm离心5min收集细胞,加入适量培养液,C02培养箱培养.4.观察:逐日在倒置镜下观察细胞生长情况.五、实验报告画出细胞贴壁前和贴壁后的形态.六、思考题试述细胞原代培养成功的条件？实验三细胞传代培养实验项目类型:基础性所属课程名称：《细胞生物学》实验计划学时：3学时一、实验目的1.熟练掌握贴壁细胞传代的培养方法；2.观察传代细胞贴壁、生长、繁殖过程中细胞形态的变化.二、实验原理离体培养的细胞群体增殖达到一定密度时，细胞的生长和分裂速度就会减慢甚至停止，如不及时分离传代培养,细胞将逐渐衰老死亡.传代培养是指细胞从一个培养瓶以1:2或其它比率转移，接种到另一培养瓶的培养.贴壁培养细胞的传代通常采用胰蛋白酶消化,把细胞分散成单细胞再传代.三、实验仪器与材料1.材料:原代培养的小鼠细胞或Hela细胞2.溶液或试剂：(1)RPMI-1640培养基、小牛血清.(2)0.25%胰蛋白酶、(pH 5.6).(3)Hanks液3.仪器或其他用具:CO2培养箱、倒置显微镜、超净工作台、高压锅、水浴锅、培养瓶、微量加样器、吸管、移液管、酒精灯、酒精棉球等.四、实验步骤1.将长成单层的细胞从二氧化碳培养箱中取出,在超净工作台中倒掉瓶内的培养液，加入少许消化液.(以液面盖住细胞为宜)，静置5~10分钟.2.在倒置镜下观察被消化的细胞，如果细胞变圆,相互之间不再连接成片，这时应立即在超净台中将消化液倒掉，加入3〜5ml新鲜培养液,吹打, 制成细胞悬液.3.将细胞悬液吸出2ml左右，加到另一个培养瓶中并向每个瓶中分别加3ml 左右培养液，盖好瓶塞，送回二氧化碳培养箱中，继续进行培养.五、实验报告分别画出贴壁生长的小鼠细胞和Hela细胞,并说明二者的不同.六、思考题写出细胞传代培养成功的条件？实验四植物细胞骨架的光学显微镜观察实验项目类型:基础性所属课程名称：《细胞生物学》实验计划学时：3学时一、实验目的了解细胞骨架的结构特征及其制备技术二、实验原理细胞骨架是由蛋白质丝组成的复杂网状结构，根据其组成成分和形态结构可分为微管、微丝和中间纤维.它们对细胞形态的维持，细胞的生长、运动、分裂、分化，物质运输，能量转换，信息传递，基因表达等起到重要作用.用适当浓度的Triton X-100处理细胞时，可将细胞质膜和细胞质中的蛋白质和全部脂质溶解抽提，但细胞骨架系统的蛋白质不受破坏而被保存，经戊二醛固定，考马斯亮蓝R250染色或间接免疫荧光标记以后，可在显微镜下观察到细胞骨架结构.三、实验仪器与材料1.材料:洋葱鳞茎和口腔上皮细胞2.溶液或试剂：(1)M-缓冲液(2)6mmol/L(pH 6.8)磷酸缓冲液(3)l%Triton X-100(用M-缓冲液配制)(4)0.2%考马斯亮蓝R250(5)3%戊二醛3.仪器或其他用具:光学显微镜、50ml烧杯、玻璃滴管、容量瓶、试剂瓶、载玻片、盖玻片、镶子、小剪刀、吸水纸、擦镜纸等.四、实验步骤1.撕取洋葱鳞叶内表皮若干片,大小约lcm2,置于青霉素小瓶或小烧杯中.2.用磷酸缓冲液(PBS)浸泡片刻.3.吸去磷酸缓冲液，用1% TritonX-100处理20分钟抽提细胞骨架以外的蛋白质,从而使骨架图像更加清晰.4.吸去TritonX-100,用M-缓冲液洗3次，每次3分钟.M-缓冲液有稳定细胞骨架的作用.5.用3%戊二醛固定15-20分钟6.用PBS洗3次，每次3分钟7.考马斯亮蓝染色15分钟8.蒸馅水洗2次9.置于载玻片上，盖上盖玻片，在光学显微镜下观察.五、实验报告绘出植物细胞骨架微丝结构图.六、思考题说出各步骤的目的和一些重要试剂的在此处的作用.实验五细胞凋亡的诱导、观察与检测实验项目类型:创新设计性实验所属课程名称：《细胞生物学》实验计划学时：9学时一、实验目的1.了解细胞凋亡的概念和原理;2.掌握细胞凋亡诱导的方法;3.认识细胞凋亡的特征.二、实验原理人体内的细胞注定是要死亡的，目前人们已经知道细胞的死亡起码有两种方式，即细胞坏死与细胞凋亡.坏死是细胞受到强烈理化或生物因素作用引起细胞无序变化的死亡过程.表现为细胞胀大，胞膜破裂，细胞内容物外溢，核变化较慢,DNA降解不充分，引起局部严重的炎症反应.凋亡是细胞受到内、外因子刺激后发生的由基因调控的生理性死亡行为.其细胞及组织的变化与坏死明显不同.细胞凋亡的形态学变化: 首先细胞体积缩小，连接消失，与周围的细胞脱离，然后胞质密度增加, 核质浓缩，核膜核仁破碎,DNA降解,胞膜形成小泡，最终为为几个凋亡小体，无内容物外溢,因此不引起周围的炎症反应，凋亡小体可迅速被周围专职或非专职吞噬细胞吞噬.凋亡细胞DNA的有控降解是一种内源性核酸内切酶作用的结果,该酶在核小体连接部位切断染色体DNA,这种降解表现在琼脂糖凝胶电泳中就呈现特异的梯状Ladder图谱,而坏死呈弥漫的连续图谱.三、实验仪器与材料1.鸡血细胞2.溶液或试剂：生理盐水,20mmol/LCaC12顺伯，姬姆萨染色剂，Tris.HCl,SDS, EDTA,乙醇，甲醇，蛋白酶K.3.仪器或其他用具:超净工作台、灭菌锅、显微镜、恒温培养箱、镶子、解剖刀、剪子、接种针、铝饭盒、锡箔纸、记号笔、橡皮筋、试剂瓶、三角瓶移液管、培养皿、酒精灯等.四、实验步骤（一）细胞凋亡的诱导：1.采鸡血10ml,加0.85%的生理盐水混匀,1200r/min离心5min,弃上清液（重复三次），制备红细胞悬液，然后加入50ml血细胞保存液混匀放于4°C冰箱中备用.2.取4个试管，各加入鸡血细胞保存液2ml,在1号管中加入2ml生理盐水作为阴性对照,2号试管加入2ml 10ug/ml的顺伯溶液作为阳性对照;3号试管中加入2ml 20mmol/L的CaC12溶液进行胁迫处理;4号试管不加任何物质，实验时煮沸5 min使细胞坏死.（二）细胞凋亡的形态学观察：1.处理4h取样，用生理盐水稀释5倍，各取50ul细胞悬液均匀涂布于5 片载玻片上,晾干.2.用甲醇固定2min,然后在载玻片上滴加适量姬姆萨染液染色lOmin.3.用蒸馅水轻轻洗去染液，室温晾干，在光学显微镜下观察细胞形态变化.4.照相，并对试验组细胞进行凋亡计数统计.（三）DNA梯状条带的检测：1.离心收集鸡血细胞，弃上清.2.加入1ml的细胞裂解缓冲液重悬，转入1.5ml离心管中，加入蛋白酶K （500ug/ml）20 n 1,混匀.3.在65°C恒温水浴锅中水浴30min（也可转入37°C水浴12〜24h）,间歇振荡离心管数次.4.于台式离心机以12000 rpm离心5min,取上清液入另一离心管中.5.加2倍体积异丙醇，倒转混匀后，可以看见丝状物，用100ul吸头挑出, 或12,000转/分离心5分钟，弃上清,晾干.6.用50ulTE 缓冲液(pH8.0)溶解沉淀,并加入RNase A(10ug/ul)5ul,于37 °C 保温10〜15分钟.7.1.2 %琼脂糖凝胶,75 V电压，电泳45 min左右，8.紫外灯下观察并照相.(琼脂糖凝胶电泳:称取 1.2克琼脂糖加入100ml1*TBE),加热使之溶解，取一个凝胶模子，两端用胶布封好，水平放置.将制孔器(即梳子)放在模子一侧约0.5cm处，其底部距模子约1mm.待琼脂冷至约70°C时，加入10ul 0.5mg/ml EB,混匀，倒入模子，待冷却凝固后，取下梳子，撕去两端胶布,放入电泳槽中，使有加样孔的一端放在负极一端.在电泳槽中加入1*TBE至超过凝胶表面约1mm.加入DNA 电泳样:1.5ul DNA 。
细胞生物学实验实验一不同显微镜的使用及细胞一般形态结构的观测[实验目的]通过本实验，使学生巩固普通光学显微镜的使用，学习相差显微镜、暗视野显微镜和荧光显微镜的使用方法，学习显微测量及显微摄影的操作方法，增强对细胞的形态和真实大小的感性认识。
通过本实验操作，要求学生掌握细胞形态结构的基本观测方法与技术，为进一步的细胞生物学研究打好基础。
[实验原理]应用显微镜的成像原理(详见翟中和等主编《细胞生物学》，第三章第一节)，同时借助显微镜的镜台测微尺和目镜测微尺，两尺配合使用，进行测量和运算，观察细胞形态，得出细胞的大小。
该实验完成需时6学时。
[实验材料、试剂和仪器]一、仪器普通光学显微镜、相差显微镜、暗视野显微镜、荧光显微镜、显微拍摄系统、37℃温箱、镜台测微尺、目镜测微尺等。
二、材料洋葱根尖切片标本，念珠藻永久装片，兔肝细胞标本，夹竹桃花丝毛细胞，人口腔上皮细胞等。
三、试剂生理盐水，10µg/mL罗丹明123染液（溶于甲醇，避光于4℃保存）[实验步骤]一、暗视野显微镜观察夹竹桃花丝毛细胞1、取一张清洁的载玻片，滴上一滴生理盐水。
用镊子轻轻夹下一根夹竹桃花丝，置生理盐水中，盖上盖玻片，略微压片，用滤纸条吸去盖玻片四周多余的水分。
2、将上述装片置于显微镜载物台上，在10×物镜下找到夹竹桃花丝毛细胞清晰的图像。
3、换上暗视野聚光器，调节至最佳位置，通过聚光器上的调中螺旋调节聚光器的中心位置，得到最好的暗视野图像效果。
4、观察夹竹桃花丝毛细胞内部的显微结构和细胞质环流现象，并拍照。
5、换用高倍物镜观察时，要换用与高倍镜相匹配的暗视野聚光器，重复以上调节步骤。
二、相差显微镜观察夹竹桃花丝毛细胞1、取一张清洁的载玻片，滴上一滴生理盐水。
用镊子轻轻夹下一根夹竹桃花丝，置生理盐水中，盖上盖玻片，略微压片，用滤纸条吸去盖玻片四周多余的水分。
2、将装片置于载物台上，在明视野用聚焦螺旋聚焦样品，将观察到的夹竹桃花丝毛细胞移到视野中央。
实验一普通光学显微镜的结构及其使用一、实验目的1、了解普通光学显微镜的工作原理，掌握光学显微镜的使用方法。
2、熟悉光学显微镜细胞的形态与结构。
二、实验用品普通光学显微镜、生物制片标本、擦镜纸。
三、实验原理和方法1、普通光学显微镜的构造从构造上，主要分三部分：①光学放大系统，为两组玻璃透镜：目镜和物镜；②照明系统：光源、折光镜和聚光镜，有时另加各种滤光片以控制光的波长范围；③机械和支架系统：主要保证光学系统的准确配制和灵活调控。
显微镜的质量主要取决于物镜，物镜是显微镜最主要的光学部件。
物镜的种类很多。
2、显微镜的能力显微镜的能力是质量和性能的标志。
能力包括分辨率、放大率、焦点深度和视场宽度等，其中最重要的是分辨率。
物镜分辨力是指分辨被检样品微细结构的能力。
通常以能清晰地分辨两个物体点的最短距离来表示。
其公式如下：R=0.61λ/N.A.R：分辨率（两点的最短距离）λ：照明光线波长N.A.：物镜数值孔径分辨率以分辨两个点的最短距离表示，R值愈小，分辨能力愈大。
物镜的分辨率与照明光线的波长成反比，与物镜的数值孔径成正比。
3、显微镜的使用①聚光器的调节②光阑的调节③工作距离④油镜的使用4、观察标本注意观察下列结构：①细胞核及核仁：不同细胞的核及核仁――蚕豆根尖切片、兔肝切片（Unna试剂染色）多核及多核仁现象――蛙卵切片、肌肉切片染色体――蚕豆根尖切片、玉米花粉母细胞切片（Giemsa,地衣红或洋红染色）。
②中心体：蝗虫精巢切片（巴西木素染色）。
③线粒体：蚕豆根尖切片、兔肝切片。
④高尔基体：兔肝切片、蚕豆根尖切片（硝酸银或四氧化锇染色）。
四、实验结果简述显微镜的主要结构和操作要领；绘制细胞显微结构图。
实验二线粒体和液泡系的超活染色与观察一、实验目的1、观察植物活细胞内线粒体、液泡系的形态、数量与分布。
2、学习一些细胞器的超活染色技术。
二、实验原理活体染色是指对生活有机体的细胞或组织能着色但又无毒害的一种染色方法。
它的目的是显示生活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以致引起细胞的死亡。
活染技术可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理、病理状态。
詹纳斯绿B和中性红两种碱性染料是活体染色剂中最重要的染料，对于线粒体和液泡系的染色各有专一性。
三、实验用品1、器材显微镜、恒温水浴锅、镊子、双面刀片、载玻片、盖玻片、吸管、吸水纸2、试剂①Ringer溶液氯化钠 0.85g氯化钾 0.25g氯化钙 0.03g蒸馏水 100ml②1％、1／3000中性红溶液称取0.5g中性红溶于50ml Ringer溶液，稍加热（30～40℃）使之很快溶解，用滤纸过滤，装入棕色瓶于暗处保存，否则易氧化沉淀，失去染色能力。
临用前，取已配制的1％中性红溶液1ml，加入29mlRinger溶液混匀，装入棕色瓶备用。
③1％、1／5000詹纳斯绿B溶液称取50mg詹纳斯绿B溶于5ml Ringer溶液中，稍加热（30～40℃）使之溶解，用滤纸过滤后，即为1％原液。
取1％原液1ml加入49mlRinger溶液，即为1／5000工作液,装入瓶中备用。
最好现用现配，以保持它的充分氧化能力。
3、材料洋葱鳞茎内表皮细胞、黄豆幼根根尖。
四、实验方法1、洋葱鳞茎内表皮细胞线粒体的超活染色观察线粒体是细胞进行呼吸作用的场所，其形态和数量随不同物种、不同组织器官和不同的生理状态而发生变化。
詹纳斯绿B是毒性较小的碱性染料，可专一性地对线粒体进行超活染色，这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态（即有色状态），显蓝绿色；而线粒体周围的细胞质中，这些染料被还原为无色的色基（即无色状态）。
①用吸管吸取1／5000詹纳斯绿B染液，滴一滴于干净的载玻片上，然后撕取一小块洋葱鳞茎内表皮，置于染液中，染色10～15分钟。
②用吸管系去染液，加一滴Ringer液，注意使内表皮组织展平，盖上盖玻片进行观察。
③在高倍镜下可见洋葱表皮细胞中央被一大液泡所占据，细胞核被挤至一侧贴细胞壁处。
仔细观察细胞质中线粒体的形态与分布。
2、黄豆根尖细胞液泡系的中性红超活染色与观察中性红为弱碱性染料，对液泡系（即高尔基体）的染色有专一性，只将活细胞中的液泡系染成红色，细胞核与细胞质完全不着色，这可能是与液泡中某些蛋白质有关。
①实验前，把黄豆培养在培养皿内潮湿的滤上，使其发芽，胚根伸长到1cm以上。
②用双面刀片把初生的黄豆幼苗根尖（约1～2cm长）小心切一纵切面，放入载玻片上的1／3000中性红染液滴中，染色5～10分钟。
③吸去染液，滴一滴Ringer液，盖上盖玻片，并用镊子轻轻地压盖玻片，使根尖压扁，利于观察。
④在高倍镜下，先观察根尖部分的生长点的细胞，可见细胞质中散在很多大小不等的染成玫瑰红色的圆形小泡，这是初生的幼小液泡。
然后，由生长点向伸长区观察，在一些已分化长大的细胞内，液泡染色较浅，体积较大，数目变少。
在成熟区细胞中，一般只有一个淡红色的巨大液泡，占据细胞的绝大部分，将细胞挤到细胞一侧贴近细胞壁处。
五、实验结果实验三植物细胞骨架的光学显微镜观察一、实验目的观察植物细胞骨架的形态。
二、实验原理当用适当浓度的TritonX—100处理时，可将细胞蛋白质破坏，但细胞骨架系统的蛋白质却被保存，后者用考马斯亮蓝R250染色，可在光学显微镜下观察到细胞骨架的网状结构。
二、实验用品1、材料洋葱鳞茎2、器材显微镜，50ml烧杯，玻璃滴管，容量瓶，试剂瓶，载玻片，盖玻片，镊子三、试剂1、M—缓冲液：50m mol/L咪唑、50m mol/L KCl、0.5m mol/L MgCl2、1m mol/L EGTA[乙二醇双（α-氨基乙基）醚四乙酸]、0.1m mol/L EDTA、1m mol/L巯基乙醇或DTT（二硫苏糖醇）。
2、6m mol/L pH6.8磷酸缓冲液（用NaHCO3调pH）。
3、1﹪Triton－X100，用M－缓冲液配制。
4、0.2﹪考马斯亮蓝R250，其溶剂是：甲醇46.5ml、冰醋酸7ml、蒸馏水46.5ml。
5、3﹪戊二醛，用2液配制。
四、实验方法1、撕取洋葱鳞茎内的表皮细胞（约1c㎡大小若干片）置于装有pH6.8磷酸缓冲液的50 ml 烧杯中，使其下沉。
2、吸去磷酸缓冲液，用1﹪Triton－X100处理20～30分钟。
3、吸去1﹪Triton－X100，用M－缓冲液洗三次，，每次10分钟。
4、3﹪戊二醛固定0.5～1小时。
5、pH6.8磷酸缓冲液洗三次，每次10分钟。
6、0.2﹪考马斯亮蓝R250染色20～30分钟。
7、用蒸馏水洗1～2次，细胞置于载玻片上，加盖玻片，于普通光学显微镜下观察。
五、实验结果实验四叶绿体的分离与荧光观察叶绿体是植物细胞所特有的能量转换细胞器，光合作用就是在叶绿体中进行的.。
由于具有这一重要功能，所以它一直是细胞生物学、遗传学的重要研究对象。
叶绿体是植物细胞中较大的一种细胞器，利用低速离心即可分离集中进行各种研究。
一、实验目的1、通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法。
2、观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，并熟悉荧光显微镜的使用方法。
二、实验原理将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。
一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的粘度有关。
在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同。
依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管的底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。
叶绿体的分离应在等渗溶液{0.35mol/L氯化钠或0.4mol/L蔗糖溶液}中进行，以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。
将匀浆液在1000r/min的条件下离心2min，以去除其中的组织残渣和一些未被破碎的完整细胞。
然后，在3000r/min的条件下离心5min，即可获得沉淀的叶绿体{混有部分细胞核}。
分离过程最好在0~5℃的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。
荧光显微术是利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行观测的一种技术。
某些物质在一定短波长的光{如紫外线}的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光{如可见光}，这种光就称为荧光。
若停止供能荧光现象立即停止。
有些生物体内的物质受激发光照射后可直接发出荧光，称为自发荧光{或直接荧光}，如叶绿素的火红色荧光和木质素的黄色荧光等。
有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光，这种荧光称为次生荧光{或间接荧光}，如叶绿体吸附吖啶橙后可发桔红色荧光。
利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行检测时，将受到许多因素的影响，如温度、光、淬灭剂等。
因此在荧光观察时应抓紧时间，有必要时立即拍照。
另外，在制作荧光显微标本时最好使用无荧光载片、盖片和无荧光油。
三、实验用品（一）器材1、主要设备：普通离心机、组织捣碎机、粗天平、荧光显微镜。
2、小型器材：500ml烧杯2个，250ml量筒1个，滴管10支，10ml刻度离心管20支，纱布若干，无荧光载片和盖片各4片。
（二）材料新鲜菠菜。
（三）试剂0.35mol/L氯化钠溶液，0.01%吖啶橙{acridine orange}。
四、实验方法（一）叶绿体的分离和观察1、选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗及粗脉，称30g于150ml 0.35mol/L NaCl溶液中，装入组织捣碎机。
2、利用组织捣碎机低速{5000r/min}匀浆3~5min。
3、将匀浆用6层纱布过滤于500ml烧杯中。
4、去滤液4ml在1000r/min下离心2min。
弃去沉淀。
5、将上清液在3000r/min下离心5min。
弃去上清液，沉淀即为叶绿体{混有部分细胞核}。
6、将沉淀用0.35mol/L NaCl溶液悬浮.7、取叶绿体悬液一滴滴于载片上，加盖片后即可在普通光镜和荧光显微镜下观察。
①在普通光镜下观察。
②在荧光显微镜下观察。
③取叶绿体悬液一滴滴于载片上，再滴加一滴0.01吖啶橙荧光染料，加无荧光盖片后即可在荧光显微镜下观察。
（二）菠菜叶手切片观察用剃须刀将新鲜的菠菜叶切削一斜面置于载片上，滴加1~2滴0.35mol/L NaCl溶液，加盖片后轻压，置显微镜下观察。
①在普通光镜下观察。
②在荧光显微镜下观察。
③用同样方法制片，但滴加1~2滴0.01%吖啶橙染液染色1min，洗去余液，加盖片后即可在荧光显微镜下观察。
五、实验结果（一）叶绿体的分离和观察1、普通光镜下，可看到叶绿体为绿色橄榄型，在高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色小颗粒，即基粒。
2、加入吖啶橙染色后，叶绿体可发出桔红色荧光，而其中混有的细胞核则发绿色荧光。
（二）菠菜叶手切片观察1、在普通光镜下可看到三种细胞。
