透射电镜样品制备固定液配方

透射电镜生物样品制作过程透射电镜生物样品制作过程大致经过取材、固定、脱水、浸透、包埋、切片及染色等步骤。

一. 取材取材时要注意的要点是：快、小、冷、净、准、避免机械损伤。

取材方法：将固定液滴在冰台上的卡片上，在麻醉后的动物身上快速用剪刀剪取一块组织，用预冷的过的缓冲液将剪下的组织洗净，迅速放到卡片上的固定液中，用刀片切去被镊子夹到和剪刀剪过的组织，后按实验的目的将组织切成0.5~1mm2的立方或横截面为1mm2的长方体。

用牙签将切好的组织块转移到装有固定液的小瓶中，贴好标签并置于4℃的冰箱中。

二．固定以下操作尽可能在4℃的环境下，使用的溶液也要保存在4℃的冰箱中。

1、戊二醛固定：用镊子轻轻的将组织块从固定液中取出，放在卡片上的固定液中，利用双面刀片把组织块切成小块状，放进盛有1~1.5ml的0.1%的戊二醛的固定液的细管中，将吸管放进真空箱中，将大气压抽到760托后取出，使组织块在戊二醛溶液中固定1小时。

2、漂洗：经戊二醛固定的组织块要用1~1.5ml的0.1%PBS缓冲溶液漂洗，漂洗的次数为5次，在漂洗到第四次时可以将组织留在PBS漂洗液中过夜，放入4℃的冰箱中。

第二天早晨再进行第五次漂洗。

3、四氧化锇固定：向漂洗过的组织中加入0.5ml的0.1%四氧化锇固定液，固定时间为2个小时。

由于四氧化锇具有毒性，因此操作在通风橱里进行。

4、漂洗四氧化锇：用0.1%PBS缓冲溶液漂洗剩余的四氧化锇，然后再漂洗两次，其时间间隔为10min。

三．脱水为了保证包埋介质完全渗入组织内部，必须事先将组织内的水分驱除干净，即用一种和水及包埋剂均能相混溶的液体来取代水，常用的脱水剂是乙醇和丙酮。

1、酒精脱水:用浓度梯度依次为30%、50%、70%、90%的酒精，依次浸泡组织，其浸泡的时间一般为10min。

当在70%梯度的酒精时，样品可以放置过夜。

2、丙酮脱水：用浓度梯度为90%、100%的丙酮浸泡组织，在纯丙酮中浸泡三次。

包埋剂：环氧树脂（不易与乙醇相溶） 固化剂：十二烷基琥珀酸酐（DDSA）和六甲酸酐（MNA） 增塑剂：邻苯二甲酸二丁酯（DBP） 加速剂：2、4、6-三（二甲氨基甲基）苯酚。（DMP—30）
（2）浸透、包埋具体步骤：
① 浸透： a、包埋液与环氧丙烷1：1，37℃或常温1小时。 b、包埋液与环氧丙烷3：1，37℃或常温5小时或过夜。 c、纯包埋液37℃5小时，摆床或振荡器上浸透。
② 包埋与固化： 组织块用牙签挑入包埋管中，注满包埋液，置温箱
中 固 化 。 37℃ 、 12 小 时 后 ， 移 入 45℃ ， 24 小 时 ， 60℃，24小时。
5．超薄切片
（1）制备超薄切片的准 备
1）金属载网：
耐高温，无磁性；平整； 网孔大小合适，孔间距小， 价格便宜。 (一般直径3mm， 内有网孔200～300个)
50%→70%→80%→90%→无水乙醇（或丙酮）（2～3次） 每步10～20分钟（培养细胞时间可短些，致密组织时间长些）， 除无水乙醇（或丙酮）在室温下进行外，其余均应在4℃下进行。
可在70%乙醇中加2%铀盐块染：电子染色。
4．浸透与包埋：
是将组织块制成能进行超薄切片的硬块。
（1）包埋液的组成：
捞片——染色
6．超薄切片染色（正染）
染色的目的： 利用重金属盐与组织细胞的不同成份呈不同程
度的结合或吸附，从而造成这些成份对电子散射 能力的差异，散射电子多的结构在荧光屏上的图 像深暗，称电子密度高;反之即为浅亮，电子密度 低，从而起到增强图像反差的作用。
6．超薄切片染色（正染）
重金属盐有铀盐（如醋酸双氧铀）和铅盐（枸 椽酸铅）等。
【2】常用固定剂的特点
（1）戊二醛（Glutraldehyde） 1）2.5%戊二醛固定液的配制（见书） 2）固定原理及优缺点

戊二醛最终浓度2.5% 7.2
固定方法：现在磷酸戊二醛固定液中固定24小时，然后换用新的磷酸戊二醛缓冲液永久固定
工具：手术刀两把，镊子两把，锋利的刀片，100ml蓝盖瓶8个
根茎叶取样：最后成熟稳定期取野生型和突变型的根茎叶组织
根：野生型和突变型取相同部位根的相同部位，根尖偏上部位
茎：野生型和突变型取茎相同节间的中间部位（例如第5节茎中间部位），用锋利的刀片切成1cm×0.2cm方块
叶：野生型和突变型取相同叶片的相同部位（例如第5片叶的中间部位），3cm×1cm
磷缓戊二醛固定液：以下两步配成
一、磷酸盐缓冲液配方
A液：0.2M磷酸氢二钠贮备液
磷酸氢二钠Na2HPO4·2H2O 35.61g
或Na2HPO4·7H2O 53.65g
或Na2HPO4·12H2O 71.64g
加双蒸水至1000ml
籽粒取样:
大粒野生型和小粒突变型授粉后分三个时期取样：5天，15天，35天
取样部位：野生型和突变型三个时期各自选取三株，每株取穗轴中部籽粒5-10粒
取样方法：将各个时期所取籽粒的左右两侧和上下两头切掉一部分，留中间部位，切成0.5cm×0.2cm大小（另外可以将各个时期取的样品保留3-5粒种子完整不切开存放在固定液）
B液：0.2M磷酸二氢钠贮备液
磷酸二氢钠NaH2PO4·H2O 27.60g
或NaH2PO4·2H2O 31.21g
加双蒸水至1000ml
C液：0.2M磷酸盐缓冲液:
pH(25℃)
A液
B液
7.2
36ml
14ml
二、磷缓戊二醛固定液配方
C液50mlPH
25%戊二醛溶液10ml 7.2
ห้องสมุดไป่ตู้加蒸馏水至100ml 7.2

透射电镜生物样品制备步骤

一．取材： 组织块小于1立方毫米 二．固定： 2.5%戊二醛，磷酸缓冲液配制固定2小时或 更长时间。 用0.1M磷酸漂洗液漂洗 15分 三次 1%锇酸固定液固定 2-3小时 用0.1M磷酸漂洗液漂洗 15分 三次





三．脱水： 50%乙醇 15-20分 70%乙醇 15-20分 90%乙醇 15-20分 90%乙醇 90%丙酮（1：1） 15-20分 90%丙酮 15-20分 以上在4度冰箱内进行 100%丙酮 室温 15-20分三 纯丙酮+包埋液（2：1）室温 3-4小时 纯丙酮+包埋液（1：2）室温 过夜 纯包埋液 37度 2-3小时 五．固化： 37度烘箱内 过夜 45度烘箱内 12小时 60度烘箱内 24小时 六．超薄切片机切片 50-60 nm 七．3%醋酸铀-枸橼酸铅双染色 八．透射电镜观察。拍片
包埋剂
环氧树脂(Epon)包埋剂: Epikote812 (Epon 812) 162ml DDSA(十二烷基琥珀酸酐)100ml(软化剂) MNA(甲基丙次甲基邻苯二甲酸 酐)89ml(硬化剂) DMP ～30(2,4,6,二甲氨基甲基苯酚) 3～ 4滴 60℃条件下,聚合48小时.

制刀机
半薄切片机
超薄切片机
透射电镜

透射电镜样品制备过程
组织取材（60s内），体积<1mm3，之后进行如下步骤
1）前固定：3%戊二醛2h或过夜。

2）漂洗：磷酸缓冲液，3次，10min/次。

3）后固定：1%锇酸固定液，2h。

4）漂洗：（同上）。

5）梯度脱水：50%丙酮，70%丙酮，80%丙酮，90%丙酮两次，各10min 。

100%丙酮两次，各15min。

6）渗透：丙酮/包埋剂（1:1,1:2），室温各1h。

丙酮/包埋剂1:3, 4度过夜。

纯包埋剂，4度过夜。

7）包埋：纯包埋剂（37度,45度,60度各24h）。

取出包埋块，进行超薄切片，片厚70nm。

分别采用醋酸双氧铀对切片进行染色30min，双蒸水漂洗3-5次，之后用柠檬酸铅
染色10min，双蒸水漂洗3-5次。

待切片干燥后，透射电镜观
察。

切片机型号：Leica UC7 超薄切片机，速度1mm/s.
透射电镜型号：日立高新HT7700，电压80kv 电流10μa.。

固定液配方一、戊二醛固定液:市售戊二醛为25%or50%水溶液，一般用磷酸缓冲液或二甲砷酸盐溶液配制成所需浓度的固定液0.1mol/L 二甲砷酸钠缓冲液 A 液：二甲砷酸钠•3H 2O 4.28g加双蒸水至100ml B 液：HCL(36-38%) 1.66ml 加双蒸水至100ml按下表比例混合A 、B 液以配制0.2M 二甲砷酸钠母液（在通风橱配制），加1倍双蒸水即得0.1M 二甲砷酸钠缓冲液0.1mol/L 磷酸缓冲液 A 液：Na 2HPO 4溶液 2.84g Na 2HPO 4 / 3.161g Na 2HPO 4 •H 2O / 3.56g Na 2HPO 4 •2H2O /5.363g Na 2HPO 4 •4H2O / 7.164g Na 2HPO 4 •7H2O加双蒸水至100mlB 液：NaH 2PO 4溶液 2.40g NaH 2PO 4/ 2.76g NaH 2PO 4 •H 2O/ 3.121g NaH 2PO 4 •2H 2O 加双蒸水至100ml按下表比例混合A 、B 液以配制0.2M 磷酸缓冲液，加1倍双蒸水即得0.1M 磷酸缓冲液二、四氧化饿固定液 1、2%四氧化饿水溶液将0.5 or 1.0g 装四氧化饿安踣瓶充分洗净，放入棕色试剂瓶，在排毒柜内将安瓿瓶敲破，立刻加入双蒸水，配制成2%四氧化饿水溶液，盖上盖子，溶解1d. 2、用0.1M 磷酸缓冲液配制成四氧化饿固定液 0.1M 磷酸缓冲液 5ml2%四氧化饿水溶液 5ml 三、karnovsky 2%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定液 1、10%多聚甲醛水溶液 多聚甲醛 2g 双蒸水 20ml 2、固定液配制0.2M 磷酸缓冲液 50ml25%戊二醛 10ml 双蒸水加至100ml 10%多聚甲醛水溶液 20ml染色液配方一、 透射电镜正染色液1、柠檬酸铅（Re ynolds’）溶液 硝酸铅 1.33g 柠檬酸三钠 1.76g 切片染色时间5-10min 双蒸水 30mlNOTICE:该溶液易与空气中CO 2作用而产生沉淀，故使用与保存时，应尽量减少与空气接触，若稍有白色沉淀即舍弃 2、醋酸双氧铀-50%饱和溶液 醋酸双氧铀 2g 50%乙醇 100ml 切片染色时间15-30min （室温），延迟时间or 提高温度可加反差 NOTICE:溶液呈鲜黄色，若变淡则表示失效。

电镜样品制备步骤1、取材：放入2.5%戊二醛溶液中固定2-4h(4℃可保存1-2周，冷冻可保存2年)注：不可用自来水冲洗，被钳、镊夹取造成机械损伤的组织不可部分可取较大面积，但厚度必须小于1mm（戊二醛固定能力小于0.5mm）2、漂洗：牙签取出样品至新的1.5ml离心管，用0.1M pH7.0磷酸缓冲液（PBS）漂洗样品三次（摇床），每次15min3、锇酸固定与再漂洗：1%锇酸溶液固定样品1-2h（临用前计算用量≤50ul/样，用0.1M PBS将2%锇酸稀释至1%，通风橱操作），吸出固定液，用0.1M pH7.0 PBS漂洗样品三次，每次15min注：漂洗以清除固定液，避免产生沉淀物干扰结构观察4、脱水剂梯度脱水：用梯度浓度（50%，70%，80%，90%和95%）乙醇溶液对样品进行脱水处理，每个浓度处理15min再用100%乙醇处理20min （乙醇细胞内抽提少，但与包埋剂相容性差）最后用纯丙酮处理20min（若包埋剂为Epon改用环氧乙烷置换）注：脱水以清除游离水以便包埋剂均匀渗透；脱水剂易吸收空气中水分，密封，置换时应该迅速由低到高逐级脱水而不能急剧脱水，更换溶液时应迅速，以免组织内外产生气泡。

5、包埋剂梯度渗透：①用包埋剂丙酮混合液（V/V=1/1）处理样品1h：计算用量80ul/样再配制(参考样品大小)②用包埋剂丙酮混合液（V/V=3/1）处理样品3h：计算用量80ul/样再配制(参考样品大小)③纯包埋剂渗透样品过夜：将样品移至干燥的新离心管中，常温过夜(所用器具均应干燥)注：样品周围不能有气泡6、加热聚合：牙签取出经渗透处理的样品至0.5ml干燥离心管（预先装入约300ul包埋剂），加热聚合仪70℃加热过夜。

7、莱卡EM UC 7超薄切片仪修快、切片（50-70nm）8、正染色：塑料包埋模具（刀划几道缝隙），染色时温度低影响染色效果，冬天空调醋酸双氧铀50%乙醇饱和溶液100ul染色（15min-1h），双蒸水冲洗柠檬酸铅100ul染色15min（极易吸收空气中CO2产生PbCO3,染色时毋对着说话、呼吸，同时放置数块NaOH）9、日立H-7650透射电镜观察spurr包埋剂配制：ERL 2.5gNSA 5.2 g 混合均匀后再加入催化剂DMAE，搅拌30min；低温干燥保存DER 2.5 gDMAE 0.1g宜新鲜配制但由于使用期限长(3-4天)，混合物可在使用前一天制备。

透射电镜制样流程
透射电镜制样流程如下：
组织取材（60s内），体积<1mm3，之后进行如下步骤：
1、前固定：3%戊二醛2h或过夜。

2、漂洗：磷酸缓冲液，3次，10min/次。

3、后固定：1%锇酸固定液，2h。

4、漂洗：（同上）。

5、梯度脱水：50%丙酮，70%丙酮，80%丙酮，90%丙酮两次，各
10min。

100%丙酮两次，各15min。

6、渗透：丙酮/包埋剂（1:1,1:2），室温各1h。

丙酮/包埋剂1:3, 4度过夜。

纯包埋剂，4度过夜。

7、包埋：纯包埋剂（37度,45度,60度各24h）。

取出包埋块，进行超薄切片，片厚70nm。

分别采用醋酸双氧铀对切片进行染色30min，双蒸水漂洗3-5次，之后用柠檬酸铅染色10min，双蒸水漂洗3-5次。

待切片干燥后，透射电镜观察。

透射电镜样品制备方法透射电镜的样品制备方法，需要经过取材、固定、脱水、渗透、包埋聚合、切片及染色等步骤。

一．取材的基本要求组织从生物活体取下后，如果不立即进行适当处理，会由于细胞内部的各种酶作用，出现细胞器自溶现象。

因此，为了细胞结构尽可能保持天然状态，必须做到快、小、准、冷。

（1）动作迅速，组织从活体取下后应在最短的时间内（1分钟内）投入2.5%戊二醛固定液。

（2）所取组织的体积要小，一般不超过1mm*1mm，取样形状为牙签状。

也可将组织修成1mm*1mm*2-5mm大小长条形。

因为固定剂的渗透能力较弱，组织块如果太大，块的内部将不能得到良好的固定。

（3）机械损伤要小，解剖器械应锋利，操作宜轻，避免牵拉、挫伤与挤压。

推荐使用手术刀或双面刀片。

（4）操作最好在低温（0℃—4℃）下进行，以降低酶的活性，防止细胞自溶。

（5）取材部位要准确。

切片窗小于1mm*1mm，如取样带有太多的多余组织，可能造成你需要的部分刚好被修掉。

二．取材方法（按照自己的样品类型检索）1.动物及人体组织的取材（在冰浴上进行）动物组织的取材，应麻醉（1%戊巴比铵5 ml/kg体重腹腔注射）或断头急性处死，解剖出所需器官。

用手术刀切割取一小块组织，放在干净的硬质板上（例如培养皿底部），滴一滴冷却的固定液。

用新的、无油污的锋利双面刀片将材料切成大约1 mm宽，3~5 mm长的小块并从中选出受损伤较小的小条（牵拉损伤将直接破坏组织，切取时刀片下压，不要来回拉锯），用牙签将这些小块逐一放入盛有预冷的、新鲜固定液的1.5 ml管内，放入冰箱冷藏室低温固定（0~4℃）4小时或以上。

*固定结束后，将固定液用磷酸盐缓冲液稀释三倍，样品于该溶液中在4℃冰箱保存。

送样前请用磷酸盐缓冲液于4度冰箱浸泡清洗15 min，共3次，做好标记送至电镜室。

送样请使用2 ml离心管，用记号笔在离心管管壁上写好编号，用透明胶带缠绕。

后续管子会接触丙酮和乙醇，一定要用透明胶带缠绕，以防记号被洗掉。

透射电镜生物样品制备步骤
一．取材：
组织块小于1立方毫米
二．固定：
%戊二醛，磷酸缓冲液配制固定2小时或更长时间。

用磷酸漂洗液漂洗15分三次
1%锇酸固定液固定2-3小时
用磷酸漂洗液漂洗15分三次
三．脱水：
50%乙醇15-20分
70%乙醇15-20分
90%乙醇15-20分
90%乙醇90%丙酮（1：1）15-20分
90%丙酮15-20分
以上在4度冰箱内进行
100%丙酮室温15-20分三次四．包埋：
纯丙酮+包埋液（2：1）室温3-4小时
纯丙酮+包埋液（1：2）室温过夜
纯包埋液37度2-3小时
五．固化：
37度烘箱内过夜
45度烘箱内12小时
60度烘箱内48小时
六．超薄切片机切片70 nm
七．3%醋酸铀-枸橼酸铅双染色
八．透射电镜JEOL JEM-1230（80KV）观察。

拍片。

固定液的选择和配方：1、缓冲液的配制：在配制固定液之前，应先配制缓冲液。

0.2M磷酸缓冲液的配制：磷酸二氢钠(NaH2PO4.H2O) 2.6g磷酸氢二钠(Na2HPO4.12H2O) 29g重蒸馏水加至500ml调pH至7.42 (灌注)固定液的配制4%多聚甲醛用0.2M磷酸缓冲液配制，重蒸馏水补足容积。

4%多聚甲醛+（0.5-2%）戊二醛，以4%多聚甲醛+1%戊二醛为例，配方如下：0.2M磷酸缓冲液的配制 100ml25%戊二醛（电镜专用） 4ml重蒸馏水加到200ml多聚甲醛和戊二醛混合固定液：1.4%多聚甲醛+5%戊二醛：溶解2g多聚甲醛于25 ml双蒸水中，80℃水浴，摇动使之溶化后加1-3滴1M NaOH，使溶液澄清。

冷却后加10 ml 25%戊二醛，再加15 ml 0.2 PB,调pH备用。

此固定液中含多聚甲醛4%，戊二醛5%，属高渗液，但固定效果不错，尤其对细胞内的微管保存较好。

2.2%多聚甲醛+2%戊二醛：溶解1g多聚甲醛于25 ml双蒸水中，80℃水浴，摇动使之溶化后加1-3滴1M NaOH，使溶液澄清。

冷却后加4 ml 25%戊二醛，再加21 ml 0.2 PB,调pH备用。

常规固定选用这种配方。

3.4%多聚甲醛+0.5%戊二醛：溶解2g多聚甲醛于25 ml双蒸水中，80℃水浴，摇动使之溶化后加1-3滴1M NaOH，使溶液澄清。

冷却后加1 ml 25%戊二醛，再加24 ml 0.2 PB,调pH备用。

推荐用作免疫电镜标本固定剂，对于抗原较强的标本，可将浓度降低到2%多聚甲醛+0.25%戊二醛。

注意：多聚甲醛一瓶几十元，电镜专用戊二醛200左右，二者价格差距太大，因此，对于较大的动物要做电镜，灌注固定，则选择4%多聚甲醛+（0.5-2%）戊二醛的混合固定液，这两种固定剂优缺点可以互相补充。

多聚甲醛与戊二醛相比，其渗透力强、固定迅速、价格低廉，它对细胞基质保存不如戊二醛，但对酶的活性保存好。

现在是6页\一共有54页\编辑于星期四
2、取材的注意事项
1）、取材的全过程要求在冷（40C ）的环境中进行，
所用的液体要提前进行预冷。 2）、切割样品时要采取一刀切开的方法，不能用拉 锯式切割法，尽量减少对样品的机械损伤。
3）、样品的块要小，要求是1个立方毫米。这样 可使样品在较短的时间内得到充分的固定。
5）、固定温度：为降低酶的活性，防止细胞的自溶，固定大都在4 度中进行。
现在是10页\一共有54页\编辑于星期四
4、常用固定剂的种类及溶液的配制
1）、固定剂的选择: 一种优良的固定剂应具
备以下条件：渗透能力强；使蛋白质交联成稳定的 凝胶，而蛋白质分子结构不发生明显的变化和凝 集；能保存酶的一定活力和细胞内其它成分（核 酸、核蛋白、糖元及脂类）；对细胞没有收缩和 膨胀作用；对细胞不产生人工假象，并能提高电 子反差。根据以上条件，适用于电镜样品固定的固 定剂常见的有：戊二醛、锇酸、多聚甲醛、高锰酸 钾等。
放入预冷的固定液中，
现在是5页\一共有54页\编辑于星期四
如果材料漂在液体上面，需抽气让组织沉到液体的 底部，以便使组织得到充分的固定
游离细胞的取材：悬液培养的细胞需要离心获得 细胞的沉淀物，然后再用预冷的固定液进行固定 处理；贴壁培养的细胞要先想办法收集细胞团再 进行固定处理。 细菌的取材：取材方法基本和培养细胞的方，法 相同。悬液培养的要离心获得细菌沉淀物进行固 定，平板和斜面培养的可直接获得菌团进行固定。 人体病理组织的取材：需提前做好准备，到手术 室取材。
免液体体积发生变化，造成对组织微细结构的损伤）。
现在是17页\一共有54页\编辑于星期四
三、清洗与脱水
1、清洗：在超薄切片制备技术中，清洗主要是指：当用

透射电镜样品制备步骤取材醛类前固定缓冲液漂洗饿酸固定（后固定）缓冲液漂洗脱水剂梯度脱水丙酮/环氧丙烷臵换浸透（先于不同比例包埋剂-脱水剂再纯包埋剂长时间浸透）加热聚合修快超薄切片铀铅染色1、取材：4℃冰块上迅速取材，1mm3大小，立即放入2.5%戊二醛溶液中固定2-4h(4℃可保存1-2周，冷冻可保存2年)注：不可用自来水冲洗，被钳、镊夹取造成机械损伤的组织不可部分可取较大面积，但厚度必须小于1mm（戊二醛固定能力小于0.5mm）脑、胰等柔软组织先切成较大厚片于戊二醛固定数分钟增加硬度，再切成小块臵于新的戊二醛固定液小肠、周围神经、肌肉等方向性、易扭曲样本可绑在小波棒上固定，待硬化后纵行方向切成长方形固定2、漂洗：牙签取出样品至新的1.5ml离心管，用0.1M pH7.0磷酸缓冲液（PBS）漂洗样品三次（摇床），每次15min3、锇酸固定：1%锇酸溶液固定样品1-2h（临用前计算用量≤50ul/样，用0.1M PBS将2%锇酸稀释至1%，通风橱操作）注：饿酸固定时间过长会导致脂蛋白复合体溶解，使组织变脆，不利于切片3、再漂洗：吸出固定液，用0.1M pH7.0 PBS漂洗样品三次，每次15min注：漂洗以清除固定液，避免产生沉淀物干扰结构观察骨组织漂洗后需脱钙，EDTA-2Na脱钙液4、脱水剂梯度脱水：用梯度浓度（50%，70%，80%，90%和95%）乙醇溶液对样品进行脱水处理，每个浓度处理15min再用100%乙醇处理20min （乙醇细胞内抽提少，但与包埋剂相容性差）最后用纯丙酮处理20min（若包埋剂为Epon改用环氧乙烷臵换；Cell的固定脱水无需臵换）注：脱水以清除游离水以便包埋剂均匀渗透；脱水剂易吸收空气中水分，密封，臵换时应该迅速由低到高逐级脱水而不能急剧脱水，更换溶液时应迅速，以免组织内外产生气泡。

植物组织脱水时间延长，100%脱水剂中加入烤干的无水CuSO4、无水Na2SO45、包埋剂梯度渗透：①用包埋剂丙酮混合液（V/V=1/1）处理样品1h：计算用量80ul/样再配制(参考样品大小)②用包埋剂丙酮混合液（V/V=3/1）处理样品3h：计算用量80ul/样再配制(参考样品大小)③纯包埋剂渗透样品过夜：将样品移至干燥的新离心管中，常温过夜(所用器具均应干燥)注：样品周围不能有气泡6、加热聚合：牙签取出经渗透处理的样品至0.5ml干燥离心管（预先装入约300 ul包埋剂），加热聚合仪70℃加热过夜。

0.2M磷酸缓冲液一系列PH值的配方：磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液（0.2M）pH 0.2M Na2HPO4/ml 0.2M NaH2PO4/ml5.8 8.0 92.05.9 10.0 90.06.0 12.3 87.76.1 15.0 85.06.2 18.5 81.56.3 22.5 77.56.4 26.5 73.56.5 31.5 68.56.6 37.5 62.56.7 43.5 56.56.8 49.5 51.06.9 55.0 45.07.0 61.0 39.07.1 67.0 33.07.2 72.0 28.07.3 77.0 23.07.4 81.0 19.07.5 84.0 16.07.6 87.0 13.07 .7 89.5 10.57.8 91.5 8.57.9 93.0 7.08.0 94.7 5.3Na2HPO4·2H2O分子量＝178.05 0.2M溶液含35.61g/LNa2HPO4·12H2O分子量＝358.22 0.2M溶液含71.64g/LNaH2PO4·H2O分子量＝138.01 0.2M溶液含27.6g/LNaH2PO4·2H2O分子量＝156.03 0.2M溶液含31.21g/L电镜实验用２．５％戊二醛固定液及其制备方法申请号/专利号：201010185630本发明公开了一种电镜实验用２．５％戊二醛固定液及其制备方法，包括以下步骤：１、磷酸盐缓冲液配制：Ａ液：磷酸氢二钠＊１２个结晶水７１．６４克加蒸镏水至１０００ｍｌ；Ｂ液：磷酸二氢钠＊２个结晶水３１．２１克加蒸镏水至１０００ｍｌ；将Ａ液３６ｍｌ＋Ｂ液１４ｍｌ配置成０．２ｍｏｌｐＨ７．２的磷酸盐缓冲液；２、固定剂戊二醛配制：将步骤１配置好的０．２ｍｏｌｐＨ７．２磷酸盐缓冲液５０ｍｌ，加入５０％戊二醛５ｍｌ，然后加蒸镏水至１００ｍｌ，加入活性炭２ｇ1、0.2M磷酸缓冲液的配制磷酸二氢钠(NaH2PO4.H2O) 2.6g磷酸氢二钠(Na2HPO4.12H2O) 29g重蒸馏水加至500ml调pH至7.42、戊二醛固定液0．1M磷酸缓冲液配制的戊二醛固定液如下（A）（B）（C）25%戊二醛（ml）0.4 1 1.6重蒸馏水（ml）4.6 4 3.40．2M缓冲液（ml）5 5 5戊二醛最终浓度(%) 1 2.5 4配制后的固定液pH应为7.3-7.4。

第二篇材料电子显微分析实验一透射电子显微镜样品制备一、实验目的1．掌握塑料—碳二级复型样品的制备方法。

2．掌握材料薄膜样品的制备方法—双喷电解减薄法和离子薄化法。

二、塑料—碳二级复型的制备原理与方法(一) AC纸的制作所谓AC纸就是醋酸纤维素薄膜。

它的制作方法是：首先按重量比配制6％醋酸纤维素丙酮溶液。

为了使AC纸质地柔软、渗透性强并具有蓝色，在配制溶液中再加入2％磷酸三苯脂和几粒甲基紫。

待上述物质全部溶入丙酮中且形成蓝色半透明的液体，再将它调制均匀并等气泡逸尽后，适量地倒在干净、平滑的玻璃板上，倾斜转动玻璃板，使液体大面积展平。

用一个玻璃钟罩扣上，让钟罩下边与玻璃板间留有一定间隙，以便保护AC纸的清洁和控制干燥速度。

醋酸纤维素丙酮溶液蒸发过慢，AC纸易吸水变白，干燥过快AC纸会产生龟裂。

所以，要根据室温、湿度确定钟罩下边和玻璃间的间隙大小。

经过24小时后，把贴在玻璃板上已干透的AC纸边沿用薄刀片划开，小心地揭下AC纸，将它夹在书本中即可备用。

(二) 塑料—碳二级复型的制备方法(1) 在腐蚀好的金相样品表面上滴上一滴丙酮，贴上一张稍大于金相样品表面的AC纸(厚30~80μm)，如图1-2(a)所示。

注意不要留有气泡和皱折。

若金相样品表面浮雕大，可在丙酮完全蒸发前适当加压。

静置片刻后，最好在灯泡下烘烤一刻钟左右使之干燥。

(2) 小心地揭下已经干透的AC纸复型(即第一级复型)，将复型复制面朝上平整地贴在衬有纸片的胶纸上，如图1-2(b)所示。

(3) 把滴上一滴扩散泵油的白瓷片和贴有复型的载玻片置于镀膜机真空室中。

按镀膜机的操作规程，先以倾斜方向“投影”铬，再以垂直方向喷碳，如图1-2(c)所示。

其膜厚度以无油处白色瓷片变成浅褐色为宜。

(4) 打开真空室，从载玻片上取下复合复型，将要分析的部位小心地剪成2mm×2mm的小方片，置于盛有丙酮的磨口培养皿中，如图1-2(d)所示。

(5) AC纸从碳复型上全部被溶解掉后，第二级复型(即碳复型)将漂浮在丙酮液面上，用铜网布制成的小勺把碳复型捞到清洁的丙酮中洗涤，再移到蒸馏水中，依靠水的表面张力使卷曲的碳复型展平并漂浮在水面上。

外泌体透射电镜样品的制备方法摘要：外泌体透射电镜样品的制备方法 1外泌体透射电镜样品的制备方法 1外泌体（exosom）是细胞外囊泡（extracellular vesicle，EV）中的重要组成部分，由于他们含有丰富的生物标志物，在细胞的社交网络里充当重要角色，作为生物学研究中的一个新兴领域越来越受到关注。

根据国际细胞外囊泡协会2014年发表的一个指导手册（MISEV），用透射电镜来观察样品中细胞外囊泡的形态特征是鉴定EV的基本方法之一。

外泌体的30~150nm杯状膜性微囊结构，可采用透射电镜负染色技术观察记录。

（1）试验样品的准备实验样品为脐静脉内皮细胞源的外泌体小泡。

提取方法如下。

①梯度离心细胞培养基先后300g（10min）、2000g （10min）、18000g（30min），4℃低温离心，离心后收取上清液，0.22μm滤器过滤，以去除培养基中的死细胞、细胞碎片、微泡及凋亡小体。

②超滤将上述培养基用于1×105超滤管浓缩为2mL左右。

③蔗糖重水垫将0.6mL的300g/L蔗糖重水溶液（密度1.210g/cm3）加到超离管中，将含有外泌体的液体小心加到蔗糖重水垫的上方，以PBS缓冲液补足体积。

使用超速离心机以110000g速度4℃低温离心70min。

④吸弃上层PBS，收集含有外泌体的蔗糖重水层，以10mL左右冷PBS稀释后加到1×105超滤管中浓缩为0.2mL左右。

将上述0.2mL超滤液加到超离管中，以PBS补足体积，超速离心机110000g低温离心70min，管底可见黄白色沉淀物。

⑤弃上清，将沉淀物以4mL冷PBS重悬，110000g低温离心70min，弃上清，所得沉淀物即为纯化后的外泌体。

采用BCA 试剂盒定量。

-80℃冰箱保存。

注意所有离心都必须在4℃低温进行。

（2）实验试剂与材料准备①新鲜配制的PBS缓冲液（pH 7.4）。

②2.5%戊二醛固定液（pH7.0~7.4）。

透射电镜样品包埋块制作原理步骤一、取材：1、动作迅速：组织离体后，应将其快速放入4℃戊二醇固定液中，使组织细胞尽可能保持原来的生活状态。

2、减少损伤：选择锋利切割器械，减少牵拉或挤压组织。

3、组织块大小：取材医生可先切成长条形，然后再修成约1mm3大小。

二、固定：固定目的是把细胞在活体状态时的超微结构细节尽可能完整地保存下来，避免自身酶的分解而出现自溶，或因外界微生物的入侵繁殖而产生腐败，致使细胞的超微结构遭受破坏。

同时也使细胞内的各种成分固定下来，避免以后的冲洗和脱水时溶解和流失。

理想的固定剂应具备以下特点：能够迅速又均匀地渗透到组织结构内；能够稳定细胞各种结构成分，使之在以后处理过程中不致溶解和丢失；对细胞超微结构没有损伤；能供细胞化学测定并能增强图像反差。

当然，满足所有要求的固定剂是不存在的，目前常用固定剂有锇酸和戊二醇。

1.使用锇酸的注意事项：锇酸即四氧化锇，它能和细胞内绝大多部分成分反应，且能够保护脂肪，但对碳水化合物、糖类和核酸保护作用差，锇酸渗透差，分子密度大，经锇酸固定的组织在电镜下能获得较好反差。

锇酸为剧毒、极易挥发的试剂，对呼吸道有强烈刺激作用，必须在通风橱中操作，废液必须收集在密闭容器中。

常用的锇酸溶液为2%的储备液，使用之前需用0.2MPBS 稀释成1%的锇酸溶液。

2.戊二醇戊二醇能够稳定糖原，同时保存某些锇酸保护作用差的蛋白质结构，对酶活性破坏小。

对微管、滑面内质网等固定较好，对脂肪保护差，且反差小，因此必须和锇酸配合使用，即“双重固定法”。

3.固定方法：样本先用2.5%戊二醇在4℃下固定2h，经PBS缓冲液多次清洗后再用1%锇酸固定2h。

根据不同组织，可适当延长固定时间。

由于戊二醇能够和锇酸反应产生电子致密的还原锇沉淀，组织经戊二醇固定后，必须将戊二醇清洗干净才能转入锇酸。

此外，锇酸又能和乙醇作用生成沉淀，因此锇酸固定后也应用PBS清洗液进行清洗干净方能进行脱水处理。