透射电镜样品制备步骤

透射电镜制样流程透射电镜（Transmission Electron Microscopy，TEM）制样是指通过一系列的化学和物理方法来制取透射电镜所需的样品。

透射电镜是一种高分辨率的显微镜，可以在纳米尺度下观察材料的原子结构和微观形态。

为了获取高质量的TEM图像，制样过程非常关键。

下面将详细介绍透射电镜制样的流程。

1.样品制备：样品可以是纳米颗粒、薄膜、纤维或生物样品等。

首先，准备适宜的基底材料，如碳膜覆盖的铜网格或碳膜覆盖的铜刀片。

样品通常需要制成非常薄的切片，通常在50到100纳米的厚度范围内。

制备方法包括机械切割、电解石蠟切片、离子切割或电离蚀刻等。

2.固定和固化：对于生物样品，需要先进行固定处理，以保持样品的形态和结构。

常用的固定剂包括戊二醛、酸性醛或重金属盐。

然后，固定的样品需要进一步处理以固化，如用过氧化物、树脂或聚合物进行浸渍，以增加样品的稳定性。

3.切割和悬浮：将固化的样品切割成适当的尺寸和形状。

使用超微切割机、离子切割仪或其他切割工具进行切割。

切割后，样品通常会悬浮在水或有机溶液中，以便进一步处理。

4.脱水和对比染色：脱水是将样品从水中逐渐转移到有机溶剂中的过程。

这种处理可以控制样品的体积，以减少对比染色和观察中的伪影。

脱水通常通过渗透固定液逐渐转移，然后通过有机溶剂（如醋酸乙酯、丙酮或丙二醇）进行交换。

5.嵌入：将样品嵌入到透明的聚合物或树脂中。

嵌入过程中，通常采用逐渐增加浓度的树脂混合物，以确保样品得到完全浸透。

然后，将样品与树脂进行硬化，通常在高温下进行。

6.超薄切片：将固化的样品切割成非常薄的切片。

使用超薄切片机和钻磨刀片进行切割。

切割后的切片应尽快收集并转移到透明的铜网格或铜刀片上。

7.超薄切片处理：超薄切片通常需要进行后继处理以增强对比度和解决其他问题。

这可能包括染色、胶层增强或薄膜剥离等方法。

8.观察：将制备好的样品放入透射电镜中进行观察。

在观察前，样品需要在真空中或过氮气中去除气泡和其他杂质。

透射电镜样品制备步骤透射电镜是一种重要的材料表征技术，它利用电子的波动性和微粒性来观察材料的结构和性质。

为了能够使用透射电镜观察样品，首先需要对样品进行制备。

透射电镜样品制备步骤如下：1.选择合适的样品：透射电镜样品可以是固体、液体、薄膜或纳米颗粒等。

根据研究目的和样品性质选择合适的样品。

2.样品预处理：根据样品性质的不同，进行必要的预处理。

例如，对于固体样品，可以选择切割、抛光或电解抛光等方法来得到平滑的表面。

3.样品固定：将样品固定到透射电镜样品架上。

不同的样品有不同的固定方法。

例如，对于固体样品，可以使用导电胶将其固定在样品架上。

4.薄层制备：对于厚度过大的样品，需要将其制备成透明的薄层以便透射电镜观察。

常用的方法有机械研磨、电子束刻蚀或离子束刻蚀等。

5.样品清洁：将样品放入超声波清洗机中进行清洗，以去除可能附着在样品表面的杂质或污染物。

6.特殊处理：如果需要对样品进行特殊处理，例如加热、冷冻处理或受到特定环境气氛的影响等，根据需要进行相应的处理。

7.样品干燥：将样品放入真空或氮气环境中，以确保样品干燥。

避免样品受到水汽的污染。

8.获得薄片：使用切片机将固态样品切割成适当厚度的薄片。

为了获得高质量的薄片，可以选择特殊的切片工具和技术，例如离子束切片或低速钻磨切片。

9.薄片形状整理：使用不同的研磨和抛光方法，将薄片的形状和表面进行调整，以确保样品的平滑度和一致性。

10.网格制备：将薄片粘贴在透射电镜网格上。

网格可以增强样品的稳定性和保护，同时提供用于定位和标识的标记。

11.后续处理：根据研究目的和透射电镜分析的要求，可以对样品进行进一步处理。

例如，可以进行染色、脱膜、溅射或腐蚀等处理。

以上是透射电镜样品制备的一般步骤。

不同样品和研究目的可能会有所不同。

因此，根据具体的研究需求和样品特点，制备过程可以做相应的调整和优化。

透射电镜的样品制备透射电镜的样品制备是一项较复杂的技术，它对能否得到好的ＴＥＭ像或衍射谱是至关重要的．投射电镜是利用样品对如射电子的散射能力的差异而形成衬度的，这要求制备出对电子束＂透明＂的样品，并要求保持高的分辨率和不失真．电子束穿透固体样品的能力主要取决加速电压，样品的厚度以及物质的原子序数．一般来说，加速电压愈高，原子序数愈低，电子束可穿透的样品厚度就愈大．对于１００～２００ＫＶ的透射电镜，要求样品的厚度为５０～１００ｎｍ，做透射电镜高分辨率，样品厚度要求约１５ｎｍ（越薄越好）．透射电镜样品可分为：粉末样品，薄膜样品，金属试样的表面复型．不同的样品有不同的制备手段，下面分别介绍各种样品的制备．（１）粉末样品因为透射电镜样品的厚度一般要求在１００ｎｍ以下，如果样品厚于１００ｎｍ，则先要用研钵把样品的尺寸磨到１００ｎｍ以下，然后将粉末样品溶解在无水乙醇中，用超声分散的方法将样品尽量分散，然后用支持网捞起即可．（２）薄膜样品绝大多数的ＴＥＭ样品是薄膜样品，薄膜样品可做静态观察，如金相组织；析出相形态；分布，结构及与基体取向关系，错位类型，分布，密度等；也可以做动态原位观察，如相变，形变，位错运动及其相互作用．制备薄膜样品分四个步骤：ａ将样品切成薄片（厚度１００～２００微米），对韧性材料（如金属），用线锯将样品割成小于２００微米的薄片；对脆性材料（如Ｓｉ，ＧａＡｓ，ＮａＣｌ，ＭｇＯ）可以刀将其解理或用金刚石圆盘锯将其切割，或用超薄切片法直接切割．ｂ切割成φ３ｍｍ的圆片用超声钻或ｐｕｎｃｈｅｒ将φ３ｍｍ薄圆片从材料薄片上切下来．ｃ预减薄使用凹坑减薄仪可将薄圆片磨至１０μｍ厚．用研磨机磨（或使用砂纸），可磨至几十μｍ．ｄ终减薄对于导电的样品如金属，采用电解抛光减薄，这方法速度快，没有机械损伤，但可能改变样品表面的电子状态，使用的化学试剂可能对身体有害．对非导电的样品如陶瓷，采用离子减薄，用离子轰击样品表面，使样品材料溅射出来，以达到减薄的目的．离子减薄要调整电压，角度，选用适合的参数，选得好，减薄速度快．离子减薄会产生热，使样品温度升至１００～３００度，故最好用液氮冷却样品．样品冷却对不耐高温的材料是非常重要的，否则材料会发生相变，样品冷却还可以减少污染和表面损伤．离子减薄是一种普适的减薄方法，可用于陶瓷，复合物，半导体，合金，界面样品，甚至纤维和粉末样品也可以离子减薄（把他们用树脂拌合后，装入φ３ｍｍ金属管，切片后，再离子减薄）．也可以聚集离子术（ＦＩＢ）对指定区域做离子减薄，但ＦＩＢ很贵．对于软的生物和高分子样品，可用超薄切片方法将样品切成小于１００ｎｍ的薄膜．这种技术的特点是样品不会改变，缺点是会引进形变．（３）金属试样的表面复型即把准备观察的试样的表面形貌（表面显微组织浮凸）用适宜的非晶薄膜复制下来，然后对这个复制膜（叫做复型）进行透射电镜观察与分析．复型适用于金相组织，断口形貌，形变条纹，磨损表面，第二相形态及分布，萃取和结构分析等．制备复型的材料本身必须是＂无结构＂的，即要求复型材料在高倍成像时也不显示其本身的任何结构细节，这样就不致干扰被复制表面的形貌观察和分析．常用的复型材料有塑料，真空蒸发沉积炭膜（均为非晶态物质）．常用的复型有：ａ塑料一级复型，分辨率为１０～２０ｎｍ；ｂ炭一级复型，分辨率２ｎｍ，ｃ塑料－炭二级复型，分辨率１０～２０ｎｍ；ｄ萃取复型，可以把要分析的粒子从基体中提取出来，这种分析时不会受到基体的干扰．除萃取复型外，其余复型只不过是试样表面的一个复制品，只能提供有关表面形貌的信息，而不能提供内部组成相，晶体结构，微区化学成分等本质信息，因而用复型做电子显微分析有很大的局限性，目前，除萃取复型外，其他复型用的很少．。

透射电镜样品制备过程
组织取材（60s内），体积<1mm3，之后进行如下步骤
1）前固定：3%戊二醛2h或过夜。

2）漂洗：磷酸缓冲液，3次，10min/次。

3）后固定：1%锇酸固定液，2h。

4）漂洗：（同上）。

5）梯度脱水：50%丙酮，70%丙酮，80%丙酮，90%丙酮两次，各10min 。

100%丙酮两次，各15min。

6）渗透：丙酮/包埋剂（1:1,1:2），室温各1h。

丙酮/包埋剂1:3, 4度过夜。

纯包埋剂，4度过夜。

7）包埋：纯包埋剂（37度,45度,60度各24h）。

取出包埋块，进行超薄切片，片厚70nm。

分别采用醋酸双氧铀对切片进行染色30min，双蒸水漂洗3-5次，之后用柠檬酸铅
染色10min，双蒸水漂洗3-5次。

待切片干燥后，透射电镜观
察。

切片机型号：Leica UC7 超薄切片机，速度1mm/s.
透射电镜型号：日立高新HT7700，电压80kv 电流10μa.。

¾透射电子显微镜成像时，电子束是透过样品成像。

¾由于电子束的穿透能力比较低，用于透射电子显微镜分析的样品必须很薄。

¾根据样品的原子序数大小不同，一般在50～500nm之间。

透射电镜样品的要求：¾1. 样品必须对电子束透明。

¾2. 所制得样品必须具有代表性，以真实反映所分析材料的特征。

主要方法：粉末样品、复型、离子减薄、电解双喷。

¾透射电镜观察用的样品很薄，需放在专用的样品铜网上。

¾透射电子显微镜使用的铜网一般直径为3毫米，上面铳有许多微米大小的孔，在铜网上覆盖了一层很薄的火棉胶膜并在上面蒸镀了碳层以增加其膜的强度，被分析样品就承载在这种支撑膜上。

样品铜网的作用：¾承载样品，并使之在物镜极靴孔内平移、倾斜、旋转，寻找观察区。

¾样品通常放在外径3mm ，200目方孔或圆孔的铜网上，铜网牢固夹持在样品座中保持好的热、点接触，减少因电子照射引起的热或电荷积累而产生样品漂移或损伤。

样品台透射电子显微镜样品制备电镜观察时样品受到的影响：(1)真空的影响。

含有挥发溶剂或易升华的试样必须冷冻后观察。

(2)电子损伤的影响。

试样在电镜中受到l0－3～1A/cm2的电子束照射，电子束的能量部分转化为热，使试样内部结构或外形发生变化或污染。

观察有机物或聚合物试样时，为防止电子束对试样的损伤和污染，应提高电压。

(3)电子束透射能力的影响。

由于电子束透射能力较弱，一般100kv加速电压时，试样厚度必须在20～200nm之间。

粉末样品制备¾随着材料科学的发展，超细粉体及纳米材料发展很快，而粉末的颗粒尺寸大小、尺寸分布及形态对最终制成材料的性能有显著影响，因此，如何用透射电镜来观察超细粉末的尺寸和形态便成了电子显微分析的一的一项重要内容。

¾其关键工作是是粉末样品的制备，样品制备的关键是如何将超细粉的颗粒分散开来，使其均匀分散到支持膜上，各自独立而不团聚。

透射电镜样品制备流程由于透射电镜能观察的样品必须很薄（60～70nm），所以透射电镜的样品准备要求很严格，方法也很单一，仅有一下两种方法：一．负染色技术负染色技术简单快速，可以显示生物大分子、细菌、分离的细胞器以及蛋白晶体等样品的形态、结构、大小以及表面结构的特征。

尤其在病毒学中，负染色技术有着广泛的应用。

样品要求：①样品悬液的纯度不要求很纯，但是如果杂质太多，如大量的细胞碎片，培养基残渣，糖类以及各种盐类结晶的存在都会干扰染色反应和电镜的观察。

尤其是不能有过多的糖类，因为在电子束的轰击下，糖类容易碳化而有碍观察，因此样品要适当提纯。

②样品悬液的浓度要适中，太稀在电镜下很难找到样品，太浓样品堆积影响观察。

操作流程：吸取样品悬液滴到有膜的铜网上，静置数分钟，然后用滤纸吸去多余的液体，滴上负染色液，染色1～2min后滤纸吸去负染色液，待干后用于电镜观察。

二、超薄切片技术超薄切片技术是为透射电镜观察提供薄样品的专门技术，是生物学中研究细胞超微结构最常用的技术。

广泛应用于生物体的各种细胞的超微结构观察。

一般厚度在10～100nm的切片称为超薄切片，制作这种切片的技术叫做超薄切片技术。

超薄切片制作的过程包括取材、固定、脱水、渗透、包埋、聚合、切片和染色等几个环节，和一般光学显微镜的石蜡切片过程相似。

但是，超薄切片切片过程更为细致与复杂，要求更严格，而且所用的试剂比较昂贵、配制复杂、强致癌。

具体操作步骤、注意事项如下：1．取材和前固定：快速的切取大小为0.5～1.0mm3的样品块，一分钟内把组织（样品）块浸入2.5％戊二醛（进口品质）溶液（取样前来平台领取），每个离心管内装20个以上的样品块，作为一个样送到平台。

要求：①取材前一定要和工作人员取得电话联系！②取材选择部位要准确可靠，确保每块材料都是要观察的部位。

③所有植物样品一定要抽真空，能够沉底的样品也抽真空15mins，不能沉底的样品一定要抽真空致沉底！④细菌、散在细胞等不能成块的样品，加戊二醛固定液，离心沉淀后送到平台，由平台工作人员处理。