22+透射电镜制样+

透射电镜样品制备方法由于电子束穿透能力限制，必须把标本切成厚度小于0.1um以下的薄片才适用，这种薄片称为超薄切片。

常用的超薄切片厚度是50-70nm。

在透射电镜的样品制备方法中，超薄切片技术是最基本、最常用的制备技术。

超薄切片的制作过程基本上和石蜡切片相似，需要经过取材、固定、脱水、渗透、包埋聚合、切片及染色等步骤。

一．取材的基本要求组织从生物活体取下后，如果不立即进行适当处理，会由于细胞内部的各种酶作用，出现细胞自溶现象。

此外还可能由于污染，微生物在组织内繁殖使细胞的微细结构遭受破坏，因此，为了细胞结构尽可能保持天然状态，必须做到快、小、准、冷。

（1）动作迅速，组织从活体取下后应在最短的时间内（争取1分钟内）投入2.5%戊二醛固定液。

（2）所取组织的体积要小，一般不超过1mm*1mm*1mm。

也可将组织修成1mm*1mm*2mm大小长条形。

因为固定剂的渗透能力较弱，组织块如果太大，块的内部将不能得到良好的固定。

（3）机械损伤要小，解剖器械应锋利，操作宜轻，避免牵拉、挫伤与挤压。

（4）操作最好在低温（0℃~4℃）下进行，以降低酶的活性，防止细胞自溶。

（5）取材部位要准确。

二．取材方法将取出的组织放在洁净的蜡版上，滴一滴预冷的固定液，用新的、锋利的刀片将组织切下并修小，然后用牙签或者镊子将组织块移至盛有冷的固定液的1.5ml离心管中。

如果组织块带有较多的血液和组织液，应先用PBS洗几遍，然后切成小块固定。

1.动物及人体组织的取材（在冰浴上进行）动物组织的取材，应麻醉（1%戊巴比铵5ml/kg体重腹腔注射）或断头急性处死，解剖出所需器官，用解剖剪刀剪取一小块组织，放在干净的纸板上，滴一滴冷却的固定液，用新的、无油污的锋利双面刀片将材料切成大约1mm宽，2~3mm长的小块并从中选出受损伤较小的小条，再将其切成1mm3的小块，最后用牙签将这些小块逐一放入盛有预冷的、新鲜固定液的1.5ml管内，放入冰箱冷藏室低温固定（0~4℃）2-4小时或以上。

透射电镜生物样品制作过程透射电镜生物样品制作过程大致经过取材、固定、脱水、浸透、包埋、切片及染色等步骤。

一. 取材取材时要注意的要点是：快、小、冷、净、准、避免机械损伤。

取材方法：将固定液滴在冰台上的卡片上，在麻醉后的动物身上快速用剪刀剪取一块组织，用预冷的过的缓冲液将剪下的组织洗净，迅速放到卡片上的固定液中，用刀片切去被镊子夹到和剪刀剪过的组织，后按实验的目的将组织切成0.5~1mm2的立方或横截面为1mm2的长方体。

用牙签将切好的组织块转移到装有固定液的小瓶中，贴好标签并置于4℃的冰箱中。

二．固定以下操作尽可能在4℃的环境下，使用的溶液也要保存在4℃的冰箱中。

1、戊二醛固定：用镊子轻轻的将组织块从固定液中取出，放在卡片上的固定液中，利用双面刀片把组织块切成小块状，放进盛有1~1.5ml的0.1%的戊二醛的固定液的细管中，将吸管放进真空箱中，将大气压抽到760托后取出，使组织块在戊二醛溶液中固定1小时。

2、漂洗：经戊二醛固定的组织块要用1~1.5ml的0.1%PBS缓冲溶液漂洗，漂洗的次数为5次，在漂洗到第四次时可以将组织留在PBS漂洗液中过夜，放入4℃的冰箱中。

第二天早晨再进行第五次漂洗。

3、四氧化锇固定：向漂洗过的组织中加入0.5ml的0.1%四氧化锇固定液，固定时间为2个小时。

由于四氧化锇具有毒性，因此操作在通风橱里进行。

4、漂洗四氧化锇：用0.1%PBS缓冲溶液漂洗剩余的四氧化锇，然后再漂洗两次，其时间间隔为10min。

三．脱水为了保证包埋介质完全渗入组织内部，必须事先将组织内的水分驱除干净，即用一种和水及包埋剂均能相混溶的液体来取代水，常用的脱水剂是乙醇和丙酮。

1、酒精脱水:用浓度梯度依次为30%、50%、70%、90%的酒精，依次浸泡组织，其浸泡的时间一般为10min。

当在70%梯度的酒精时，样品可以放置过夜。

2、丙酮脱水：用浓度梯度为90%、100%的丙酮浸泡组织，在纯丙酮中浸泡三次。

透射电镜试样制备一、实验内容及目的了解透射电镜对试样的要求，熟悉透射电镜试样的制备过程，制备一个合格的透射电镜试样。

二、薄膜样品的制备用于透射电镜下观察的试样厚度要求在50-200nm之间，试样的制备过程大致可以分为以下三个步骤：第一步从实物或大块样品上切割厚度为0.3-0.5mm厚的薄片。

电火花线切割法是目前用得最广泛的方法，它是用一根往返运动的金属丝作切割工具，以被切割的样品作阳极、金属丝作阴极，两极间保持一个微小的距离，利用其间的火花放电进行切割。

电火花切割可切下厚度小于0.5mm的薄片，切割时损伤层比较浅，可以通过后续的磨制或减薄过程去除。

电火花切割只能切割导电样品，对于陶瓷等不导电样品可用金刚石刃内圆切割机切片。

第二步样品薄片的预减薄。

预减薄的方法有两种，即机械法和化学法。

机械法是通过手工研磨来完成的，把切割好的薄片一面用粘接剂粘在样品座表面，然后在水砂纸磨盘上进行研磨减薄。

应注意把样品平放，不要用力太大，并使它充分冷却。

减薄到一定程度时，用溶剂把粘接剂溶化，使样品从样品座上脱落下来，然后用同样方法研磨另一个面直至样品被减薄至规定的厚度。

（如果材料较硬，可减薄至70μm左右；若材料较软，则厚度不能小于100μm。

另一种预先减薄的方法是化学薄化法。

这种方法是把切割好的金属薄片放入配制好的化学试剂中，使它表面受腐蚀而急需减薄。

因为合金中各组成相的腐蚀倾向是不同的，所以在进行化学减薄时，应注意减薄液的选择。

化学减薄的速度很快，因此操作时必须动作迅速。

化学减薄的最大优点是表面没有机械硬化层，减薄后样品的厚度可以控制在20-50μm 。

经化学减薄的样品最终抛光穿孔后，可供观察的薄区面积较大。

但是化学减薄时必须事先把薄片表面充分清洗，否则将得不到满意的结果。

第三步最终减薄目前效率最高和操作最简便的方法是双喷电解抛光法，图为一台双喷式电解抛光装置的示意图。

将预先减薄的样品剪成直径为3mm的圆片,装入样品夹持器中。

透射电镜制样要求与制样方法1. 样品一般应为厚度小于100nm的固体。

2. 样品在电镜电磁场作用下不会被吸出，附于极靴上。

3. 样品在高真空中能保持稳定。

4. 不含有水分或其它易挥发物，含有水分或其他易挥发物的试样应先烘干。

TEM样品常放置在直径为3mm的200目载网上纳米粉末样品的制备方法1、研磨法将（研磨后的）粉末放在去离子水或无水乙醇溶液里，用超声波分散器将需要观察的粉末分散成悬浮液。

用滴管滴几滴在覆盖有支持膜的电镜载网上，待其干燥(或用滤纸吸干)后, 即成为电镜观察用的粉末样品。

载网种类：方华支持膜：方华支持膜的化学成分是聚乙烯醇缩甲醛，由于是纯的有机膜，所以膜的弹性好，厚度通常为 10nm 左右，透射电镜观察时背底影响小。

但方华膜因导电性不好，在电子束照射下，易因高温或电荷积累，产生样品漂移甚至膜破损，通常在 100kV 电镜和生物样品中使用较多。

碳支持膜：是一种最常用的支持膜，有两层膜结构。

从下至上依次为裸网、方华膜和碳膜，由于碳层具有较强的导电性和导热性，弥补了无碳方华膜的荷电效应以及热效应，增强了膜整体的稳定性，适合大多数纳米材料和生物样品的一般形貌观察用于常规样品制样。

微栅：在膜上制作出微孔，以便使样品搭载在微孔边缘，使样品“无膜”观察，提高图象衬度。

观察管状、棒状、纳米团聚物效果好，特别是观察这些样品的高分辨像及mapping时更是最佳选择。

超薄碳膜：在微栅的基础上叠加了一层很薄的碳膜，一般为3-5纳米。

这层超薄碳膜的目的是用超薄碳膜把微孔堵住。

主要针对粒度较小的纳米材料。

如10纳米以下分散性很好的纳米材料，如果用微栅可能从微孔中漏出，如果在微栅孔边缘，由于膜厚可能会影响观察。

所以用超薄碳膜就会得到很好的效果。

纯碳膜：当样品所用的有机溶剂（氯仿、甲苯等）能够溶解方华膜时，载网膜中就要去除方华膜，只剩碳膜，称为纯碳膜，碳膜的厚度通常为 20nm 左右，在高分辨观察时背底的影响也比较明显。

透射电镜生物样品制备步骤
一．取材：
组织块小于1立方毫米
二．固定：
2.5%戊二醛，磷酸缓冲液配制固定2小时或更长时间。

用0.1M磷酸漂洗液漂洗15分三次
1%锇酸固定液固定2-3小时
用0.1M磷酸漂洗液漂洗15分三次
三．脱水：
50%乙醇15-20分
70%乙醇15-20分
90%乙醇15-20分
90%乙醇90%丙酮（1：1）15-20分
90%丙酮15-20分
以上在4度冰箱内进行
100%丙酮室温15-20分三次
四．包埋：
纯丙酮+包埋液（2：1）室温3-4小时
纯丙酮+包埋液（1：2）室温过夜
纯包埋液37度2-3小时
五．固化：
37度烘箱内过夜
45度烘箱内12小时
60度烘箱内48小时
六．超薄切片机切片70 nm
七．3%醋酸铀-枸橼酸铅双染色
八．透射电镜JEOL JEM-1230（80KV）观察。

拍片。

透射电镜常规制样简易流程
1.取样
因戊二醛和锇酸的固定深度有限，样品越小越好，尽量取1mm*1mm*1mm。

2.先固定
戊二醛在3%-6%。

参考：25% 戊二醛（必须买Sigma公司的G5885或者更高浓度的戊二醛）和0.2M PBS 配置为戊二醛5%和0.1M PBS缓冲液的混合工作液；时间：常温4小时后，4度冰箱过夜。

3.清洗
PBS缓冲液冲洗。

一定要洗干净，否则戊二醛和锇酸会产生沉淀。

参考：每15-30分钟更换一次，共4次。

4.后固定
参考:锇酸2%，固定4小时。

剧毒，在通风橱操作。

5.清洗
PBS缓冲液冲洗。

6.梯度脱水
参考：乙醇梯度脱水:30-50-70-90-95-100-100%，每次10-15分钟，无水乙醇中加分子筛或者无水硫酸铜，提前一周配置好备用。

7. 渗透
参考：spurr树脂。

包埋板即可。

8. 包埋聚合
参考：70度，24小时。

10.超薄切片
11.染色
（1）醋酸双氧铀封口膜上染色，染色时间参考：10分钟（铀染）
（2）水清洗
（3）柠檬酸铅因其极易和空气产生铅沉淀，染色时旁边放NaOH颗粒，注意避光。

染色时间参考附件。

¾透射电子显微镜成像时，电子束是透过样品成像。

¾由于电子束的穿透能力比较低，用于透射电子显微镜分析的样品必须很薄。

¾根据样品的原子序数大小不同，一般在50～500nm之间。

透射电镜样品的要求：¾1. 样品必须对电子束透明。

¾2. 所制得样品必须具有代表性，以真实反映所分析材料的特征。

主要方法：粉末样品、复型、离子减薄、电解双喷。

¾透射电镜观察用的样品很薄，需放在专用的样品铜网上。

¾透射电子显微镜使用的铜网一般直径为3毫米，上面铳有许多微米大小的孔，在铜网上覆盖了一层很薄的火棉胶膜并在上面蒸镀了碳层以增加其膜的强度，被分析样品就承载在这种支撑膜上。

样品铜网的作用：¾承载样品，并使之在物镜极靴孔内平移、倾斜、旋转，寻找观察区。

¾样品通常放在外径3mm ，200目方孔或圆孔的铜网上，铜网牢固夹持在样品座中保持好的热、点接触，减少因电子照射引起的热或电荷积累而产生样品漂移或损伤。

样品台透射电子显微镜样品制备电镜观察时样品受到的影响：(1)真空的影响。

含有挥发溶剂或易升华的试样必须冷冻后观察。

(2)电子损伤的影响。

试样在电镜中受到l0－3～1A/cm2的电子束照射，电子束的能量部分转化为热，使试样内部结构或外形发生变化或污染。

观察有机物或聚合物试样时，为防止电子束对试样的损伤和污染，应提高电压。

(3)电子束透射能力的影响。

由于电子束透射能力较弱，一般100kv加速电压时，试样厚度必须在20～200nm之间。

粉末样品制备¾随着材料科学的发展，超细粉体及纳米材料发展很快，而粉末的颗粒尺寸大小、尺寸分布及形态对最终制成材料的性能有显著影响，因此，如何用透射电镜来观察超细粉末的尺寸和形态便成了电子显微分析的一的一项重要内容。

¾其关键工作是是粉末样品的制备，样品制备的关键是如何将超细粉的颗粒分散开来，使其均匀分散到支持膜上，各自独立而不团聚。