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杂交瘤技术流程引言：杂交瘤技术是一种重要的细胞和分子生物学研究方法，可以用于合成抗体、研究蛋白质功能以及筛选抗肿瘤药物等领域。
本文将介绍杂交瘤技术的流程，包括细胞融合、筛选和鉴定杂交瘤等环节。
一、细胞融合细胞融合是杂交瘤技术的第一步，旨在将抗体产生细胞与肿瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞。
具体步骤如下：1.1 收集抗体产生细胞和肿瘤细胞：抗体产生细胞可以来自小鼠或人类免疫系统，而肿瘤细胞则常使用骨髓瘤细胞等。
1.2 调整细胞浓度：将抗体产生细胞和肿瘤细胞分别离心，去除培养基，然后重新悬浮在含有多种营养物质的培养基中，使其浓度适宜。
1.3 细胞融合：将抗体产生细胞和肿瘤细胞按照一定比例混合，加入聚乙二醇等融合剂，使细胞融合。
1.4 培养杂交细胞：将融合后的细胞放入含有适宜培养基的培养皿中，利用恒温培养箱进行培养，以促使杂交细胞的生长和繁殖。
二、筛选杂交瘤细胞筛选杂交瘤细胞是为了从大量的融合细胞中筛选出能够产生特定抗体的杂交瘤细胞。
具体步骤如下：2.1 选择培养基：准备含有适宜培养条件的培养基，其中可能包含抗生素等物质以抑制非杂交细胞的生长。
2.2 稀释细胞：将培养皿中的杂交细胞适当稀释，使其分散在培养基中。
2.3 培养杂交细胞：将稀释后的杂交细胞转移到含有适宜培养基的培养皿中，继续在恒温培养箱中培养。
2.4 筛选条件：根据所需抗体的特性，设置相应的筛选条件，如添加特定抗原、采用酶联免疫吸附实验等。
2.5 筛选结果：通过观察培养皿中细胞的形态、颜色等特征，确定是否产生了目标抗体的杂交瘤细胞。
三、鉴定杂交瘤细胞鉴定杂交瘤细胞是为了确认所筛选出的细胞确实具有产生特定抗体的能力，并且可以稳定地传代。
具体步骤如下：3.1 克隆化：将筛选出的杂交瘤细胞进行克隆化，即分离成单个细胞，并分别培养在不同培养皿中。
3.2 培养单克隆细胞：将克隆化后的单克隆细胞继续在恒温培养箱中培养，观察细胞生长情况，筛选出生长良好的细胞。
单克隆抗体制备的杂交瘤技术XXX,YYY,ZZZ(版权所有，仅限个人)一、实验目的：1.掌握杂交瘤技术的基本原理和基本操作方法。
2.能运用杂交瘤技术来制备自己的单克隆抗体。
二、实验原理：（一）动物免疫动物体内的B淋巴细胞在特定外来抗原的刺激下，可以大量增殖变成浆细胞以分泌针对于该抗原的抗体。
脾内不同的B淋巴细胞克隆可分泌针对不同抗原的抗体。
当受到特定外来抗原刺激时，相应的B淋巴细胞克隆便大量增殖以分泌相应的特异性抗体。
动物免疫的作用就是用特定外为抗原对动物进行一次或多次免疫，以刺激能分泌针对于该抗原抗体的B淋巴细胞大量增殖，从而得到大量产生专一的B淋巴细胞。
（二）细胞融合B淋巴细胞受外来抗原刺激后可以分泌抗体，但它在体外存活很短时间(最多两周)后即死亡；而骨髓瘤细胞不分泌任何免疫球蛋白，却能在体外长期存活。
如果能将这两种细胞的特性结合起来，我们就能得到既能分泌抗体又能在体外长期存活的细胞。
脾脏是动物体内B淋巴细胞集中的最大免疫器官,取出脾细胞(B淋巴细胞)和骨髓瘤细胞融合后，能产生五种细胞类型；未融合的脾细胞和骨髓瘤细胞,自身融合的脾细胞和骨髓瘤细胞，以及脾细胞和骨髓瘤细胞融合形成的杂交瘤细胞。
其中杂交瘤才是我们需要的，因此就要设法将此杂交瘤细胞从上述细胞混合液中挑选出来。
（三）杂交瘤细胞的筛选在细胞融合后，要从上述五种细胞中筛选出杂交瘤细胞，一般使用HAT培养进行筛选，HAT养基中含有次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶(T)三种成分。
细胞的DNA合成有内源性途径(主要途径)和外源性途径(旁路途径)两种方式。
内源性途径就是利用谷氨酰胺或单磷酸尿苷酸在二氢叶酸还原酶的催化下来合成DNA；而外源性途径则是利用次黄嘌呤或胸腺嘧啶在次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Hypoxanthine guznine phosphoribosyl transferase,HGPRT)或胸腺嘧啶激酶(thymidine kinase,TK)的催化下来补救合成DNA，HAT培养基中氯基喋呤是二氢叶酸还原酶的抑制剂，能有效地阻断DNA合成的内源性途径。
杂交瘤技术（hybridoma technique）基本程序与方法 6（2）杂交瘤细胞的复苏杂交瘤细胞、骨髓瘤细胞或其他细胞在液氮中保存，若无意外情况时，可保存数年至数十年。
复苏时融解细胞速度要快，使之迅速通过最易受损的 -5℃?0℃，以防细胞内形成冰晶引起细胞死亡。
通常情况下，冻存时细胞数量多，生长状态好的杂交瘤细胞系以及其他细胞的复苏可采用以下方法，这也是各个实验室普遍采用的程序。
即复苏时，从液氮中取出安瓶，立即在37℃水浴融化，待最后一点冰块快要融化时，从水浴中取出，置冰浴上。
用5-10ml HT培养基稀释，1000r/min 10分钟，弃上清，再悬浮于适量HT培养基中，转入培养瓶或24孔板，置37℃，7.5% CO2培养。
如果细胞存活力不高，死细胞太多，可加104-105/ml小鼠腹腔细胞进行培养。
不过，冻存的细胞并不都能100%复苏成功，其原因较多，如冻存时细胞数量少或生长状态不良，或复苏时培养条件改变或方法不当，也可能细胞受细菌或支原体污染，以及液氮罐保管不善等。
在出现上述情况时，可采用一些补救方法复苏这些细胞，如小鼠皮下形成实体瘤法，脾内接种法，小鼠腹腔诱生腹水和实体瘤法，以及96孔板培养法等。
6、单抗特性的鉴定（1）单克隆性的确定包括杂交瘤细胞的染色体分析、单抗免疫球蛋白重链和轻链类型的鉴定和单抗纯度鉴定等。
①杂交瘤细胞的染色体分析对杂交瘤细胞进行染色体分析可获得其是否是真正的杂交瘤细胞的客观指标之一，杂交瘤细胞的染色体数目应接近两种亲本细胞染色体数目的总和，正常小鼠脾细胞的染色体数目为40，小鼠骨髓瘤细胞SP2/0为62-68，NS-1为54-64；同时骨髓瘤细胞的染色体结构上反映两种亲本细胞的特点，除多数为端着丝点染色体外，还出现少数标志染色体。
另一方面，杂交瘤细胞的染色体分析对了解杂交瘤分泌单抗的能力有一定的意义，一般来说，杂交瘤细胞染色体数目较多且较集中，其分泌能力则高，反之，其分泌单抗能力则低。
什么是杂交瘤技术？杂交瘤技术的原理及步骤杂交瘤技术（hybridoma technique）即淋巴细胞杂交瘤技术，又称单克隆抗体技术。
它是在体细胞融合技术基础上发展起来的。
克勒（Kohler）和米尔斯坦（Milstein）（1975）证明，骨髓瘤细胞与免疫的动物脾细胞融合，形成能分泌针对该抗原的均质的高特异性的抗体——单克隆抗体，这种技术通称为杂交瘤技术。
这一技术的基础是细胞融合技术。
骨髓瘤细胞在体外可以连续传代，而脾细胞是终末细胞，不能在体外繁殖。
如将小鼠的骨髓瘤细胞与分泌某种抗体或因子的淋巴细胞融合，则融合细胞既具有肿瘤细胞无限繁殖的特性，又具有淋巴细胞能分泌特异性抗体或因子的能力，同时也克服了免疫淋巴细胞不能在体外繁殖的缺点，融合的细胞称为淋巴细胞杂交瘤。
杂交瘤技术原理及步骤：杂交瘤技术的基本原理是通过融合两种细胞而同时保持两者的主要特征。
这两种细胞分别是经抗原免疫的小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞。
被特异性抗原免疫的小鼠脾细胞（B淋巴细胞）的主要特征是它的抗体分泌功能，但不能在体外连续培养，小鼠骨髓瘤细胞则可在培养条件下无限分裂、增殖，即具有所谓永生性。
在选择培养基的作用下，只有B细胞与骨髓瘤细胞融合的杂交细胞才能具有持续培养的能力，形成同时具备抗体分泌功能和保持细胞永生性两种特征的细胞克隆。
其原理从下列3个主要步骤阐明。
(一)细胞的选择与融合建立杂交瘤技术的目的是制备对抗原特异的单克隆抗体，所以融合细胞一方必须选择经过抗原免疫的B细胞，通常来源于免疫动物的脾细胞。
脾是B细胞聚集的重要场所，无论以何种免疫方式刺激，脾内皆会出现明显的抗体应答反应。
融合细胞的另一方则是为了保持细胞融合后细胞的不断增殖，只有肿瘤细胞才具备这种特性。
·选择同一体系的细胞可增加融合的成功率。
多发性骨髓瘤是B细胞系恶性肿瘤，所以是理想的脾细胞融合伴侣。
使用细胞融合剂造成细胞膜一定程度的损伤，使细胞易于相互粘连而融合在一起。
教案课程名称细胞生物学实验授课题目（章、节）实验八：杂交瘤技术的实验原理及其操作演示授课老师刘庆平授课对象2002级生物工程授课时间第十三周教学方法理论教学选用教具多媒体教学实验内容提要：杂交瘤技术的实验原理及其操作演示（4学时）第一节实验介绍150分钟（一）、实验原理；（二）、实验目的；（三）、实验用品；（四）、实验方法和过程；（五）、实验结果分析；第二节．实验多媒体示教30分钟教学重点、难点及基本要求：重点及难点：杂交瘤获得成功的基本要素。
1、动物免疫2、细胞融合3、杂交瘤细胞的融合基本要求：1. 掌握杂交瘤技术的基本原理和基本操作方法2. 能运用杂交瘤技术来制备自己需要的单克隆抗体教研室主任意见：单元教学小结（经验效果、问题、改进措施、信息反馈等）本教案以讲授一个单元（2-4学时）一次实验（实习）为单位填写。
填写要用钢笔。
字迹要清晰、工整。
按表项目逐一填写。
实验二杂交瘤技术的实验原理及其操作演示（多媒体教学演示4学时）杂交瘤技术是1975年Kohler和Milstein用于制备单克隆抗体而创建的一项重要技术，被誉为“免疫学上的一次革命”。
此技术被广泛用于各种单克隆抗体的制备。
抗体是由B淋巴细胞分泌的，一个B淋巴细胞只能分泌一种抗体。
把B淋巴细胞和骨髓细胞融合，即可形成在体外长期存活并分泌的杂交瘤细胞，如果把单个杂交瘤细胞克隆化，扩增传代，其分泌的抗体即为高度纯一的单克隆抗体。
单克隆抗体具有高度专一性，一种单克隆抗体只能结合一种特定的抗原决定簇。
正是由于其这种高度专一性，因此被广泛用于疾病的论断和治疗，生物大分子的鉴定、定位和分离纯化，以及一些细胞器，特定细胞或病毒的鉴定、定位和分离等方面, 具有极其远大的应用前景, 因此，用于制备单克隆抗体的杂交瘤技术也变得越来越重要，应用范围越来越广。
实验目的1. 掌握杂交瘤技术的基本原理和基本操作方法2. 能运用杂交瘤技术来制备自己需要的单克隆抗体实验原理杂交瘤技术的建立基于以下三种关键技术。
一、动物免疫动物体内的B淋巴细胞在特定外来抗原的刺激下，可以大量增殖变成浆细胞以分泌针对于该抗原的抗体。
脾内不同的B淋巴细胞克隆可分泌针对不同抗原的抗体。
当受到特定外来抗原刺激时，相应的B淋巴细胞克隆便大量增殖以分泌相应的特异性抗体。
动物免疫的作用就是用特定外为抗原对动物进行一次或多次免疫，以刺激能分泌针对于该抗原抗体的B淋巴细胞大量增殖，从而得到大量产生专一的B淋巴细胞。
二、细胞融合B淋巴细胞受外来抗原刺激后可以分泌抗体，但它在体外存活很短时间(最多两周)后即死亡；而骨髓瘤细胞不分泌任何免疫球蛋白，却能在体外长期存活。
如果能将这两种细胞的特性结合起来，我们就能得到既能分泌抗体又能在体外长期存活的细胞。
脾脏是动物体内B淋巴细胞集中的最大免疫器官, 取出脾细胞(B淋巴细胞)和骨髓瘤细胞融合后，能产生五种细胞类型；未融合的脾细胞和骨髓瘤细胞, 自身融合的脾细胞和骨髓瘤细胞，以及脾细胞和骨髓瘤细胞融合形成的杂交瘤细胞。
其中杂交瘤才是我们需要的，因此就要设法将此杂交瘤细胞从上述细胞混合液中挑选出来。
通过细胞融合技术脾脏B淋巴细胞骨髓瘤细胞(特异性抗原刺激) 不分泌抗体分泌特异性抗体寿命长寿命短杂交瘤细胞分泌特异性单克隆抗体Köh l e r和M i l s t e i n,获得1984年Nobel奖创立抗原选择抗体学说，发明单克隆抗体技术杰尼Niels K. Jerne科勒Georges J.F. Köhler米尔斯坦César Milstein三、杂交瘤细胞的筛选在细胞融合后，要从上述五种细胞中筛选出杂交瘤细胞，一般使用HAT培养进行筛选，HAT培养基中含有次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶(T)三种成分。
细胞的DNA合成有内源性途径(主要途径)和外源性途径(旁路途径)两种方式。
内源性途径就是利用谷氨酰胺或单磷酸尿苷酸在二氢叶酸还原酶的催化下来合成DNA；而外源性途径则是利用次黄嘌呤或胸腺嘧啶在次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Hypoxanthine guznine phosphoribosyl transferase, HGPRT)或胸腺嘧啶激酶(thymidine kinase,TK)的催化下来补救合成DNA，HAT培养基中氯基喋呤是二氢叶酸还原酶的抑制剂, 能有效地阻断DNA合成的内源性途径。
B淋巴细胞具有HGPRTTK这两种酶, 因此在内源性途径被阻断后仍能利用HAT培养基中的次黄嘌呤和胸腺嘧啶来合成DNA，可在HAT培养基中存活, 但B淋巴细胞是正常细胞, 故不能长期存活。
杂交瘤技术中所使用和SP2/0-Ag14骨髓瘤细胞为HGPRT-的TK-缺陷型, 缺乏HGPRT 酶和TK酶在内源性途径被阻断后不能进行DNA的外源性合成，故不能在HAT培养基中存活。
杂交瘤细胞由于继承了B淋巴细胞和骨髓瘤细胞的双重特性，能够合成HGPRT酶和TK酶，故在HAT养基中能长期存活。
因此将融合后的混合细胞在HAT培养基中培养两周后，只有杂交瘤细胞能存活下来，成为制造单克隆抗体的细胞源。
实验用品一、器材1. 主要设备: 无菌室一间(或超净台一台), 普通离心机一台, 倒置显微镜一架, 酶联免疫检测仪一台, CO2恒温培养箱一台, 恒温水浴一台, 高压灭菌名锅一个。
2. 小型器材: 血细胞计数板二块, 25ml和50ml培养瓶20个, 96孔和24孔培养板各10块, 40孔酶标板20块, 50ml塑料离心管6支, 10ml玻璃离心管10支, 1ml、5ml和10ml吸管各4支, 6cm培养皿2套, 100ml和50ml培养液瓶各10个, 1ml、5ml和10ml注射器各2支, 小滴管8支, 玻璃套管4, 中、小型手术剪刀各2把, 中、小型手术镊各2把, 6号针头8个, L 型6号针头2个, 500ml和1000ml杯各2个, 酒精灯一盏, 不锈钢网(55cm 200目)2块, 解剖盘2个, 培养液抽滤灭菌装置一套, 橡皮塞若干, 70%酒精棉若干。
二、材料8~12周龄BALB/c纯系小鼠10只；SP2/0-Ag14骨髓瘤细胞；灭活人轮状病毒(用作抗原)。
三、试剂RPMI 1640培养基, 小牛血清(FCS), GKN液, 50%PEG液, HT培养液, HAT培养液, 0.5% 台盼蓝(trypan blue), 1 mol/L NaOH, 1 mol/L HCl, 包被液, 底物反应液, 辣根过氧化物酶羊(或兔)抗鼠IgG, 青霉素, 链霉素。
[附] 各种试剂配方如下：1. RPMI 1640基本培养液RPMI 1640粉10g, 青、链霉素各10万单位，加三蒸水最终至1000ml, 用1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl将pH调至7.0，用0.22μm滤膜抽滤除菌，分装冻存备用。
2. RPMI 1640完全培养液RPMI 1640基本培养液80ml无菌的灭活小牛血清(FCS) 20ml(新鲜小牛血清在56℃灭活30min后，抽滤除菌)3. 100×HT母液次黄嘌呤(H) 136.1mg胸腺嘧啶(T) 38.8mg于50℃溶解后，用0.22蕀滤膜抽滤除菌，分装冻存备用。
4. 100×A母液氨基喋呤(A) 1.76g三蒸水90ml滴加1mol/L NaOH至完全溶解，再用1mol/L HCl调pH至7.5，加三蒸水至1000ml, 用0.22μm 滤膜抽滤除菌，分装冻存备用。
5. HT培养液RPMI 1640完全培养液1000ml100×HT母液10ml6. HAT 培养液RPMI 1640完全培养液1000ml100×HT母液10ml100×A母液10ml7. GKN 液配方同实验三，所不同的是需用0.22μm滤膜抽滤除菌。
8. 50% PEG(聚乙二醇)溶液取分子量1000Da的PEG 5g 用高压灭菌溶化，冷却50℃时加入等体积已预热至50℃的无菌GKN，充分混匀后分装冻存备用。
在融合时用1mol/L NaOH调pH至8.0~8.2左右。
9. 包被液Na2CO3 1.59gNaHCO3 2.93g加蒸馏水至1000ml，完全溶解后置4℃保存备用。
10. PBSS-Tween20缓冲液NaCl 8.0gNa2HPO4.12H2O 2.9gKH2PO4 0.2gKCl 0.2gTween 20 0.5ml加蒸馏水至1000ml，完全溶解后置4℃保存备用。
11. 底物缓冲液A液: 0.1mol/L 柠檬酸B液: 0.2mol/L Na2HPO4取A液24.3ml + B液 25.7ml，加入蒸馏水至100ml。
12. 底物反应液(使用液)底物缓冲液100ml邻苯二胺(OPD) 40mg实验方法杂交瘤的制备一般应包括动物免疫、细胞融合及HAT筛选、抗体的检测和克隆化几个基本操作步骤(见右图)。
一、动物免疫动物免疫的方法很多，一般有常规免疫法、脾内一次性免疫法、短程免疫法和体外免疫法等。
脾内一次性免疫法具有用量少、免疫程序短、不加佐剂且所得单克隆抗体的特异性较高等特点。
由于单次免疫抗原刺激后数日内就进行细胞融合，因此不存在所谓“优势克隆”的问题，从而更容易获得多种不同特异性的单克隆抗体，也能肋于筛选出差别微小的两种抗原的单克隆抗体。
但该方法的缺点是，其免疫效果要等杂交瘤筛选时才明了, 因此在实验时有一定的随机性；此外对一些免疫原性较差的抗原决原簇的单克隆抗体的筛选较困难。
常规免疫法比较可靠，由于在融合前能通过测定血清中的抗体滴度来证实免疫效果，因此实验成功的把握性较大。
但由于免疫动物多次反复接受相同抗原的刺激, 会使某些特定的淋巴细胞克隆大量增殖, 易形成“优势克隆”, 因此所产生单克隆抗体的种类较少, 很可能多个克隆所产生的单克隆抗体都是针对于同一个抗原决定簇的。
此外此法的免疫程序太长，费时费力。
而短程免疫法和体外免疫法均各有其优缺点，在此不再介绍。
在利用杂交瘤技术制备单克隆抗体时，一般采用常规免疫法。
在本实验中，我们使用人软状病毒脾内一次性免疫法来免疫动物，以达到快速简便的实验效果，也适于学生操作。
具体方法如下。
1. 纯化分离已灭活的人轮状病毒，并精确定量。
2. 用戊巴比妥钠对2只10周龄的BALB/c小鼠进行麻醉，按每克体重注射0.05g戊巴比妥馀的量对小鼠进行腹腔注射，5min后小鼠即进入昏迷状态。
3. 无菌打开小鼠腹腔，暴露出脾脏，用1ml注射器将含有30ng的0.1ml抗原(人轮状病毒)液分别注射到两只小鼠脾脏内。
4. 将脾脏轻轻复位，缝合伤口，饲养备用。
5. 免疫三天后取脾细胞进行融合。
二、细胞融合及HAT筛选细胞融合方法一般有病毒介导的细胞融合、PEG介导细胞融合及电融合等。
