ICS13.080.30
B10
团体标准
T/NAIA0001—2020土壤微生物量氮的测定
2020-XX-XX发布2020-XX-XX实施宁夏化学分析测试协会发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》规定编写。
本标准由宁夏昊标检测服务研究院（有限公司）提出。
本标准由宁夏化学分析测试协会归口。
本标准起草单位：宁夏昊标检测服务研究院（有限公司）、宁夏大学、宁夏农林科学院荒漠所、宁夏化学分析测试协会。
本标准主要起草人：王京、白玲、任亚丽、马晓瑞、刘鸿翔、刘辉、俞鸿千、张小飞、刘娜娜。
本标准于2020年XX月XX日首次发布。
土壤微生物量氮的测定
1范围
本标准规定了土壤微生物量氮的测定方法。
本标准适用于各类土壤微生物量氮的测定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的应用文件，仅注日期的版本适用于本文件，凡是不住日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 601化学试剂标准滴定溶液的制备
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法
NY/T 1121.1土壤检测第一部分：土壤样品的采集、处理和贮存
3原理
新鲜土样经氯仿熏蒸24h 后，土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放出微生物量氮，用硫酸钾溶液提取微生物量氮，测定提取液中氮含量，根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤氮含量的差值及转换系数，计算土壤微生物量氮。
4试剂和溶液
除非另有说明外，本方法均使用符合国家标准的分析纯试剂，分析用水为GB/T 6682规定的三级水。
4.1氯仿（CHCl 3）。
4.1.1去乙醇氯仿制备
市售氯仿一般含有少量乙醇作为稳定剂，使用前须将乙醇去除。方法是量取适量的氯仿和二级水按1:2的比例置入分液漏斗中，充分震摇1min 并静置分层后，慢慢放出底层氯仿于干燥的烧杯中，重复洗涤3次，得到无乙醇氯仿，向其中加入无水氯化钙，以除去氯仿中的水分。纯化后的氯仿置于暗色试剂瓶中，在4℃、黑暗条件下保存。
注意：氯仿具有致癌作用，所有操作必须在通风橱中进行。
4.2氢氧化钠（NaOH）。
4.3硫酸钾（K 2SO 4）。
4.4硫酸铜（CuSO 4）。
4.5硼酸（H 3BO 3）。
4.6浓硫酸（H 2SO 4）。
4.7甲基红指示剂（C 15H 15N 3O 2）。
4.8溴甲酚绿指示剂（C 21H 14BrO 5S）。
4.9氢氧化钠溶液（1mol/L）
称取40g （精确至0.01g ）氢氧化钠用水溶解，定容至1000mL 。
4.10硫酸钾浸提剂（0.5mol/L）
称取174.26g （精确至0.01g ）硫酸钾，用研钵磨成粉末，倒于2.5L 塑料桶中，加水2L ，盖紧螺旋盖置于摇床（150r/min ）至完全溶解。
4.11氢氧化钠溶液（400g/L）
称取400g （精确至0.01g ）氢氧化钠加水溶解，定容至1L 。
4.12硼酸溶液（20g/L）
称取20g （精确至0.01g ）硼酸加水溶解，定容至1L 。
4.13硫酸标准溶液（0.02mol/L）
准确移取5.56mL 浓硫酸缓缓注入800mL 水中，用水定容至1000mL ，配制成浓度为0.1mol/L 的硫酸标准溶液，按照GB/T 601对其进行标定。将此溶液用水稀释5倍得到0.02mol/L 的硫酸标准溶液。
4.14指示剂
称取0.1g（精确至0.0001g ）甲基红和0.5g（精确至0.0001g ）溴甲酚绿指示剂放入玛瑙研钵中，加入100mL 95%乙醇研磨溶解。
5仪器设备
5.1电子天平：感量0.0001g 和0.01g。
5.2真空泵。
5.3恒温培养箱（25℃±1℃）。
5.4凯氏定氮仪。
5.5摇床（25℃，150r/min，300r/min）。
6测量步骤
6.1土壤前处理
新鲜土壤应立即处理或保存于4℃冰箱中，测定前先仔细除去土壤中可见植物残体(如根、茎和叶)及土壤动物(如蚯蚓等)，过2mm 孔径筛并混匀。如果土壤过湿，应在室内适当风干，并经常翻动，以避免局部干燥，至土壤含水量约为田间持水量的40%（以手感湿润疏松但不结块为宜）。如果土壤过于干燥，用蒸馏水调节含水量至田间持水量的40%。将土壌置于密封的塑料桶内，在25℃±1℃下预培养7-15d。桶内有适量水以保证相对湿度
为100%，并在桶内放一小烧杯1mol/LNaOH 溶液以吸收土壌呼吸产生的CO 2。这些过程是
为了消除土壤水分限制对微生物的影响以及植物残体对测定的干扰。经预培养的土壤应立即分析，否则，应置于4℃下保存，且分析前需在上述条件下至少再培养24h。
6.2熏蒸
称取经前处理相当干50g（精确至0.01g）烘干基的新鲜土壤3份，置于100mL 烧杯中。将烧杯放入真空干燥器中，同时放入盛有去乙醇氯仿（约2/3烧杯）的烧杯2~3个，烧杯内放入少量经浓盐酸溶液浸泡过夜后洗涤烘干的瓷片（0.5mm 大小，防瀑沸），或放入抗瀑沸的颗粒，同时放入一小烧杯1mol/LNaOH 溶液以吸收熏蒸期间释放出来的CO 2，干燥
器底部还应加入少量水以保持湿度，用真空泵抽真空，在-0.07MPa 真空度下使氯仿剧烈沸腾3~5min。关闭真空干燥器阀门，于25℃±1℃黑暗条件下熏蒸24h。打开干燥器阀门时，由于空气进入应该能听见有明显嘶嘶的声音，否则，意味着抽真空不够或漏气，应重新进行熏蒸。
取出土壤和氯仿（氯仿倒回贮存瓶，可再使用），将装土壤的烧杯转入清洁真空干燥器中，反复抽真空（-0.07Ma）直到土壌无氯仿味为止，否则，残留在土壤中的氯仿将影响分析结果。一般需要反复抽真空5~6次，每次3min，每次抽真空后最好完全打开干燥器，以加快去氯仿速度和效果。
在熏蒸的同时，另称取等量的土壤3份，置于另一干燥器中，除不加氯仿进行熏蒸外，其他操作与熏蒸土壤一样，作为对照土壤。
6.3浸提
将熏蒸后的土壤无损转移到200mL 聚乙烯塑料瓶中，加入100mL 0.5mol/L 硫酸钾浸提剂（4.10），使土水比为1:2（土壤为质量单位g，浸提液为体积单位mL），振荡（25℃，300r/min）浸提30min，用中速定量滤纸过滤于100mL 塑料瓶中。另称取等量的3份对照土壤于200mL 聚乙烯浸提塑料瓶中，加入100mL 0.5mol/L 硫酸钾浸提剂（4.10）同上浸提。同时做3个不加土壤的试剂空白，过滤后的浸提液应立即分析，或在-18℃下保存。
6.4消化
取10.0mL 浸提液（解冻的浸提液在取样前应彻底混匀）于250mL 消化管中，加入0.100g 硫酸铜，5mL 浓硫酸，于电炉上消化，混合液消化变清后再回流3h。
6.5测定
按说明书检查凯氏定氮仪，空蒸15min 洗管道。消化结束后，冷却，接在蒸馏装置上。将一三角瓶接在冷凝管的下端，并使冷凝管浸在三角瓶的液面下，三角瓶内盛有25mL 20g/L 硼酸吸收液（4.12）和指示剂（4.14）3滴。然后向消化管缓缓加入35mL 400g/L 氢氧化钠溶液（4.11），蒸馏5min，用少量蒸馏水冲洗冷凝管的下端（洗入三角瓶中）。用0.02mol/L 硫酸标准液（4.13）滴定，溶液由蓝色变为酒红色时即为终点。记下消耗标准硫酸溶液的毫升数。
7结果计算样品中氮含量以克每千克（g/kg）表示，按式（1）计算：
2011001000014.0)(V f m c V V N ⨯⨯⨯⨯⨯-=)
1(⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅
