FISH技术全攻略

fish技术定量的方法
鱼类技术的定量方法通常包括以下几种：
1. 鱼类数量调查，这种方法通过在水域中进行捕捞或使用声纳等技术来估计鱼类的数量。

捕捞方法包括网捕、拖网和刺网等，而声纳技术则通过发送声波并根据回波来估计鱼群的数量和密度。

2. 生物学参数测量，这种方法通过测量鱼类的生物学参数，如体长、体重、年龄和性别比等来定量鱼类。

这些参数可以通过捕捞后的样本或者在水域中进行标记和再捕捞来获取。

3. 遥感技术，利用遥感技术，如卫星遥感和无人机技术，可以对水域进行监测，从而估计鱼类数量和分布。

这种方法能够覆盖大范围的水域，并且可以提供高分辨率的数据。

4. 模型预测，利用数学模型和统计方法，可以对鱼类数量进行预测和估计。

这种方法通常需要大量的数据支持，并且需要考虑到水域的环境因素和生态系统的动态变化。

总的来说，鱼类技术的定量方法是多种多样的，可以根据具体的研究目的和条件选择合适的方法进行定量分析。

FISH一．玻片预处理：玻片用热肥皂水洗刷，用自来水冲洗12-15次，蒸馏水冲洗3次，在1%稀盐酸中浸泡24h，自来水洗净，蒸馏水冲洗3次，双蒸水冲洗3次，121℃灭菌20min (160℃烘箱4h以上)，以去除玻片上可能有的核酸。

二．硅化处理：将上述处理的清洁玻片置于70%乙醇中洗1min，丙酮浸泡1min，2%APES/丙酮液浸泡10s（APE-S氨丙基三乙氧基硅烷），丙酮浸泡10s，双蒸水冲洗3次，50℃烘1h。

三．载片的包被：粘附剂：称取明胶1.0g溶于125-200ml双蒸水中，加热搅拌助溶，待明胶完全溶解后（很重要），加入明矾0.5g，溶解后稀释至250ml。

包埋玻片：明胶的温度保持在60℃左右，将准备好的玻片在粘附剂中上下浸蘸几下（浸蘸时务必整个玻片完全浸于液体中），分散开竖放在架子上，于空气自然干燥。

（用铝箔包好，避免污染，4℃备用）四．样品预处理：1)样品超声2mins，8000r/min离心3min，弃上清液，用PBS[1]将收集到的微生物冲洗一次。

12000r/min离心5min去上清，悬于200μl PBS。

2)加入3倍体积4%多聚甲醛[2]（600μl）4℃下过夜。

12000r/min离心5min去固定剂重悬于200μl PBS；（若样品需保存，可于-20℃条件下，储存于50%乙醇/PBS溶液中，杂交试验前，用PBS清洗2次，离心收集）五．制片，杂交，观察1)取10μl样品涂布于载玻片，自然干燥。

在玻片上加入200ul溶菌酶溶液（1mlPBS加20ul 20mg/L溶菌酶储备液）,加灭菌培养皿盖，避免风干，室温10min，除去酶液2)在玻片上加入200ul蛋白酶K（1mlPBS加20ul 20mg/L蛋白酶K储备液），放入生化培养箱中，37℃，30min，除去酶液3)分别用50%乙醇,80%乙醇,95%乙醇,100%乙醇各脱水3mins，风干备用4)双蒸水溶解原探针，使浓度50ng/mL左右，取探针10μL，杂交液[3]90μL混合（若有三个探针，则分别取10μL，杂交液为70μL），使最终探针浓度为5ng/mL的混合杂交液5)取经过预处理的样品涂于载片，充分干燥后，加20μL混合杂交液（样品与混合杂交液体积比为10μL：20μL）。

FISH（荧光原位杂交）技术全攻略荧光原位杂交技术（Fluorescence in situ hybridization，FISH）是一种应用非放射性荧光物质依靠核酸探针杂交原理在核中或染色体上显示核酸序列位置的方法。

该技术问世与70年代中期左右，其曾多于与染色体异常的研究，近年来随着FISH探针种类的不断增多，使得该技术逐步应用于各种领域。

该技术具有快速，安全,灵敏度高以及探针可长期保存等特点，目前已广泛应用于细胞遗传学，肿瘤生物学，基因定位，基因作图，基因扩增及分子诊断等领域。

1对于FISH操作来说，那些因素比较重要?在FISH中最重要的因素是温度、光照、湿度和各种试剂的PH值.温度和湿度直接影响着探针和目标DNA的杂交效率；光照影响了荧光染料的强度，因此探针要避光保存，其已经杂交的片子可用防荧光淬灭剂封片且避光保存;各种试剂pH也要精确达到要求,这也直接关系到FISH的稳定性。

2 如何保证FISH操作中的温度？最佳的措施是使用一些FISH的专用仪器进行操作，如Vysis的Hybrit FISH杂交仪.如果是手工操作，首先要对FISH操作过程中可能使用的一些仪器进行温控能力的检查，如水浴锅、孵箱，对其中不符合要求的要进行更换(疾病诊断中的探针要求温控精度在0。

5度以内）.其次，要尽可能地保持操作环境温度在20度以上，对于在冬季进行的FISH 操作尤为重要。

此外对于需要预热以达到要求温度的试剂，在使用前必须使用温度计对其进行测温。

同时检测的样本最好不能超过4块。

操作中的行动一定要迅速。

操作者还往往忽视一些小部件的温度，诸如载玻片和盖玻片。

特别是在冬季,盖玻片本身温度就低，加之探针的量本就不多（10ul）,因此事先没有预热的盖玻片会使得杂交液的温度急剧下降严重地影响了探针和目标DNA的杂交效率。

因此对上述小部件的要进行预热处理,不然会影响FISH的杂交效果。

3 使用荧光显微镜观察结果时，最初有清晰而明亮的信号，但随后信号急剧衰减，几分钟后信号就消失了。

使用fish全攻略使用fish全攻略FriendlyInteractiveShell(fish)很轻易使用。

它的语法、上下文相关的帮助和颜色编码的命令行界面(CLI)明显简化了UNIX?的使用，减轻了脚本编程的负担。

英语是一种令人困惑的语言。

例如，请考虑moon和good这两个单词。

对外行人而言，这两个单词似乎应该是押韵的，但是前者的读音是/mun/(根据InternationalPronunciationAlphabet)，而后者的读音是/good/。

似乎英语中的惟一规则就是例外。

UNIXshell同样令人困惑。

例如，在Bourneshell(和大多数常用的UNIXshell)中，'$var'、"$var"和`$var`看起来相似，但是它们会产生很不一样的结果。

(在本文中的shell示例中，每个CLI前面都加上使用的shell的名称和命令编号)。

在上面的命令序列中，把变量var设置为两字母的字符串ls。

在第一个echo命令中，单引号禁止解释此变量，因此会按原样显示引号中的文本，即四字母的字符串$var。

在第4行代码中，双引号会解释此变量，所以结果是字符串ls。

最后，反撇号解释变量并作为子shell运行中间结果。

因此，`$var`产生中间字符串ls，它作为shell命令运行，天生当前目录的内容列表。

当然，这三种操纵符(单引号、双引号和反撇号)都有正当的用途，但是与英语中的例外一样，记住和把握这些细微差异很令人头疼。

为了进一步证实这一点，请问：$var和"$var"之间有什么差异?(提示：假设$var包含空格。

)假如一个变量包含空格，双引号会按原样把变量展开为一个参数。

否则，变量中的任何空格都被解释为参数分隔符。

shell语法很令人头疼。

这很糟糕，由于它使CLI(UNIX最强大的特性之一)更难把握。

上面这样的不一致题目甚至会给UNIX老手带来困扰。

FISH（荧光原位杂交）技术全攻略荧光原位杂交技术（Fluorescence in situ hybridization，FISH）是一种应用非放射性荧光物质依靠核酸探针杂交原理在核中或染色体上显示核酸序列位置的方法。

该技术问世与70年代中期左右，其曾多于与染色体异常的研究，近年来随着FISH探针种类的不断增多，使得该技术逐步应用于各种领域。

该技术具有快速，安全，灵敏度高以及探针可长期保存等特点，目前已广泛应用于细胞遗传学，肿瘤生物学，基因定位，基因作图，基因扩增及分子诊断等领域。

1对于FISH操作来说，那些因素比较重要？在FISH中最重要的因素是温度、光照、湿度和各种试剂的PH值。

温度和湿度直接影响着探针和目标DNA的杂交效率；光照影响了荧光染料的强度，因此探针要避光保存，其已经杂交的片子可用防荧光淬灭剂封片且避光保存；各种试剂pH也要精确达到要求，这也直接关系到FISH的稳定性。

2 如何保证FISH操作中的温度？最佳的措施是使用一些FISH的专用仪器进行操作，如Vysis的Hybrit FISH杂交仪。

如果是手工操作，首先要对FISH操作过程中可能使用的一些仪器进行温控能力的检查，如水浴锅、孵箱，对其中不符合要求的要进行更换（疾病诊断中的探针要求温控精度在0.5度以内）。

其次，要尽可能地保持操作环境温度在20度以上，对于在冬季进行的FISH操作尤为重要。

此外对于需要预热以达到要求温度的试剂，在使用前必须使用温度计对其进行测温。

同时检测的样本最好不能超过4块。

操作中的行动一定要迅速。

操作者还往往忽视一些小部件的温度，诸如载玻片和盖玻片。

特别是在冬季，盖玻片本身温度就低，加之探针的量本就不多（10ul），因此事先没有预热的盖玻片会使得杂交液的温度急剧下降严重地影响了探针和目标DNA的杂交效率。

因此对上述小部件的要进行预热处理，不然会影响FISH的杂交效果。

3 使用荧光显微镜观察结果时，最初有清晰而明亮的信号，但随后信号急剧衰减，几分钟后信号就消失了。

fish技术定量的方法一、引言随着生物科学技术的不断发展，荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization，简称FISH）技术在生物学研究领域得到了广泛应用。

作为一种非放射性杂交技术，FISH在基因表达、染色体核型分析、基因定位等方面具有显著优势。

本文旨在介绍FISH技术定量的方法，以期为相关领域的研究者提供参考。

二、FISH技术简介1.原理FISH技术利用荧光标记的核酸探针与目标DNA序列特异性结合，通过荧光显微镜观察杂交信号，实现对特定基因或染色体区域的定位与分析。

2.操作步骤FISH技术的操作步骤主要包括：探针设计、样本处理、染色、图像获取与分析、数据处理与定量分析。

3.优点与局限性FISH技术具有非放射性、高灵敏度、特异性强、操作简便等优点。

但同时也存在一定的局限性，如对探针设计的要求较高、样本制备过程较为繁琐等。

三、FISH技术定量方法1.荧光染料选择选择具有良好光谱分辨率和量子产率的荧光染料，如FITC、Cy3、Cy5等，用于标记核酸探针。

2.样本处理与染色针对不同类型的样本（如细胞、组织切片、染色体悬液等），采用适当的处理方法进行制备。

染色过程中，需注意控制探针浓度、杂交温度、杂交时间等条件，以获得最佳实验效果。

3.图像获取与分析利用荧光显微镜对染色后的样本进行观察，捕获杂交信号。

通过专业图像分析软件，对图像进行处理和定量分析。

4.数据处理与定量分析对处理后的图像进行阈值设定、背景扣除等操作，计算目标区域的荧光信号强度。

根据信号强度，对基因表达水平、染色体拷贝数等进行定量分析。

四、实验应用与案例分析1.基因表达分析FISH技术可用于检测特定基因在细胞或组织中的表达水平，有助于研究基因在生物过程中的功能。

2.染色体核型分析FISH技术可实现对染色体核型的快速准确分析，对遗传病的诊断和染色体异常研究具有重要意义。

3.细胞定位分析通过FISH技术，可定位特定基因在细胞内的表达位置，有助于研究细胞结构和功能。

FISH技术全攻略FISH技术，即荧光原位杂交技术，是一种常用于细胞和组织中DNA 和RNA分子的定位和检测的方法。

它利用荧光标记的探针与待测物（DNA 或RNA）特异性结合，并通过显微镜观察荧光信号的强弱、位置等特征，从而实现对目标分子的检测和定位。

下面是FISH技术的全攻略。

一、实验准备1.准备标记探针所需的DNA或RNA杂交模板。

2.选择适合的荧光标记物，如荧光素或荧光染料。

根据待测物的特异性，选择合适的探针序列。

3.选择适当的杂交缓冲液和嵌合反应缓冲液。

4.准备样本制备所需的试剂和器材，如细胞培养液、组织切片等。

二、标记探针1.获得待测物的DNA或RNA序列，并设计与之特异性结合的引物。

2.利用引物将待测物扩增，并进行纯化。

3.利用PCR或反转录-PCR等方法将引物和合适的荧光标记物连接起来，形成标记探针。

4.对标记探针进行纯化和定量，确保其纯度和浓度适当。

三、样本制备1. 细胞样本制备：将待检测的细胞培养在无菌条件下，收集并进行固定处理，如用甲醛溶液固定细胞，并进行膜通透处理，如用0.1% Triton X-100等溶液处理。

2.组织样本制备：将待检测的组织收集起来，并进行固定处理和脱水处理，如用乙醚和乙醇等溶液处理。

四、杂交反应1.准备杂交缓冲液：根据具体要求配制适当的杂交缓冲液，如SSC缓冲液（含盐和柠檬酸），并加入适量含有探针的杂交模板。

2.加热探针和杂交目标：将探针和待测物的杂交模板一起加热处理，使其变性。

3.杂交：将变性后的标记探针与杂交模板进行杂交，使其重新结合。

4.温度控制：根据具体情况选择合适的杂交温度和时间，并进行合适的温度控制。

五、信号检测与图像分析1.温度冲洗：在特定的温度和缓冲液条件下进行冲洗，去除未结合的探针和杂交模板。

2.荧光显微镜观察：将样本放在显微镜下，观察和记录荧光信号的强度和位置。

3.图像分析：利用图像分析软件对荧光显微镜下观察到的图像进行处理和分析，如测量信号的强度和位置。

FISH以及免疫荧光的实验步骤FISH（荧光原位杂交）是一种用于检测DNA或RNA序列的实验技术。

该技术结合了传统原位杂交和荧光显微镜技术，可以在细胞或组织样本中定位、标记和可视化特定的DNA或RNA分子。

下面是一个典型的FISH实验的步骤：1.准备标记探针：选择适当的探针来标记目标DNA或RNA序列。

探针通常是短的DNA或RNA片段，与目标序列互补，可以与其发生特异性杂交。

这些探针可以使用不同的标记物进行标记，如荧光染料或辐射性同位素。

2.样品制备：根据需要，制备细胞悬液或组织切片样品。

细胞悬液可以通过离心细胞，将细胞固定在载玻片上。

组织切片可以使用刮片或切片机获得，然后固定在载玻片上。

3.固定样品：将细胞悬液或组织切片固定在载玻片上，以保持细胞或组织的形态结构。

常用的固定剂包括乙醇、甲醛等。

4. 渗透化处理：使用渗透化剂渗透细胞或组织样品，以增加探针和标记物的进入性能。

常用的渗透化剂包括蛋白酶K和Triton X-100。

5.探针杂交：将标记的探针与样品中的DNA或RNA序列结合。

首先在浓度适宜的探针液中孵育样品，使探针与目标序列发生杂交。

温度和时间取决于探针和目标序列的碱基组成和长度，通常需要在高温下进行，以增加探针与目标序列的特异性。

6.杂交后的冲洗：使用适当的缓冲液冲洗样品，以去除未结合的探针和杂交条件中的非特异性结合。

冲洗通常需要进行多次，以确保特异性结合。

7.荧光染色：如果探针是荧光标记的，在杂交后可以直接进行荧光染色。

将样品浸泡在适当浓度的荧光染料中，以标记目标序列。

染色时间通常较短，一般在15-30分钟左右。

8.荧光显微镜观察：在荧光显微镜下观察和记录标记的目标序列的位置和数量。

使用适当的滤光片来选择和分离目标染色的荧光波长。

利用计算机软件，可以对显微镜下的图像进行分析和处理，以获得更多的信息。

在进行FISH实验时，需要注意一些技术细节和注意事项：1.适当的正向和阴性对照是必要的，以确保实验的准确性和可靠性。

FISH 技术简介（一）FISH 技术1．概要FISH是荧光现场合成的英文名称的缩写，它是一个强有力的基因评估工具，能对内层、外层细胞基因中的特定染色体畸变进行显微识别及定位。

恶性肿瘤、神经呆滞及畸形病症中全部或部分染色体的变化能被观察到。

尽管传统的分子遗传学有了进步，但是检查这些基因非平衡还是受到限制。

染色体光谱分析是全面分析这些情况的一个有效工具。

但由于难于准备临床肿瘤样品、解释复杂的重排列、决定哪些为平衡而哪些为不平衡，因而仍有局限性。

尽管KAROTYPING正逐步变得自动化，但最终结果仍依赖于操作员的判断。

正是由于这些局限，激励了荧光现场合成技术的发展。

使用染色体特定DAN探测，能对染色体上各处基因位置绘图，并作为光谱技术的补充。

荧光现场合成用于基因定位。

用一种试剂处理DNA，将DNA 双绞链解链，并引入用已知基因特征测试DNA分子，在基因的位置作合成，给探针标记荧光，因而标识了基因的位置。

FISH 技术可用于膀胱肌瘤、乳房肿瘤、脑瘤等的前期诊断。

然而，这种技术可用于整个生物学，特别是在医药、分子生物学、细胞遗传学等领域，并且，从植物科学界，如用于研究农作物的野生祖先的试验亦传来有趣的结果。

2．FISH 技术荧光是一种光，由样品对一种变波长光的反应而产生。

样品中引起荧光的分子叫做荧光物。

与激励光的光子相互作用，引起荧光物中的一个电子向一个高能量级运动，当电子跃回其原能量级时，向激励光发出不同的波长。

LEICA Q550CW 细胞遗传学工作站可产生数字化图像，而单独用显微镜不能轻松地取得。

如下是几个FISH 用于数字图像的应用：。

荧光的位置可以看到。

可决定荧光的强度及荧光物的数量。

强度的变化可反映检测环境的变化在这些应用科学中，所有的因子可能很有趣，但头一条，即位置可见是最重要的。

对同一对象，可用几个荧光探针，显示不同的特征。

每一个探针可用一束窄波长光照亮，它可产生一种长波长的荧光，因而可看到全部的探针。

探针标记方法大全1、DNA的缺口平移法缺口平移是一种快速、简便、成本相对较低以及生产高比活性均一标记DNA的方法。

该技术可以制备序列特异的探针。

当使用重组质粒探针时，虽然任何形式的双链DNA都可以进行缺口平移标记。

但通常使用限制性核酸内切酶将插入片段进行酶切和凝胶电泳纯化后再进行缺口平移标记。

此外，用这种探针进行杂交可产生较低的背景信号。

2、DNA的随机引物法这种方法是使用寡核苷酸引物和大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段来标记DNA片段。

这种方法可代替缺口平移产生均一的标记探针外，还在许多方面优于缺口平移法，比如标记核苷酸在DNA探针中的掺入率可达50％以上。

由于在反应过程中加入的DNA片段不被降解，故在随机引物反应中加入的DNA可少于200 ng，甚至10 ng也能有效地标记。

DNA片段的大小不影响标记的结果。

标记物沿所加入的全长DNA被均等地掺入。

标记的探针可以直接使用而不需要去除未掺入的核苷酸；单链双链DNA都可作为随机引物标记的模版。

随机引物可用于较小的DNA片段（100~500 bp），而缺口平移法对大DNA片段（>1000 bp）效果最好。

随机引物法的主要缺点是产生的标记探针量比缺口平移的要少些，此外环状DNA不能有效地标记，必须先用限制性内切核酸酶线形化或用碱法或DNA酶Ⅰ产生缺口。

3、RNA的体外转录法体外转录法标记RNA探针可用于商品化转录质粒来制备。

这些质粒中应该包括SP6、T3、或T7 RNA聚合酶的RNA启动位点和，而这些启动位点则与多克隆位点（multiple cloning sites，MCS）相邻。

4、RNA的寡脱氧核苷酸法克隆质粒pSP64、pGEM-3、pGEM-4等含邻近MCS的SP6RNA启动子，可作为从DNA寡核苷酸模版产生RNA探针的基础。

这两种标记方法产生探针量大，而且产生的探针不受载体序列的影响，所需要的线性化的质粒DNA大约1 ug，但需要高纯度的模板。