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荧光原位杂交技术荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization），简称FISH。
是利用荧光标记的特异核酸探针与细胞内相应的靶DNA分子或RNA分子杂交，通过在荧光显微镜或共聚焦激光扫描仪下观察荧光信号，来确定与特异探针杂交后被染色的细胞或细胞器的形态和分布，或者是结合了荧光探针的DNA区域或RNA分子在染色体或其他细胞器中的定位。
中文名fish外文名fluorescent in situ hybridization建立时间1986年发展历程1969年，Pardue和John等两个研究小组开始采用放射性标记DNA或28S RNA发明了原位杂交技术（ISH）。
尽管当时原位杂交技术已经具有较高的特异性和灵敏度，但鉴于放射性同位素自身特性的局限，如安全性、空间分辨率低、不稳定性等问题，这项技术仅限于实验室研究方面的应用。
1986年科研工作者开始利用异硫氰酸盐荧光素来标记探针，并在荧光显微镜下进行观察分析，建立了荧光原位杂交技术（FISH）。
1989年，Delong首次使用荧光标记寡核苷酸探针检测单个微生物细胞。
由于FISH技术具有敏感度高、信号强、背景低、快速等优点，该方法在环境微生物的检测中得到了广泛的应用。
随着科技的迅速发展，FISH探针标记物越来越多，不仅从单一荧光发展到多色荧光检测，而且应用范围也进一步扩大，不仅可以用于分裂相细胞而且可以用于间期细胞检测，为FISH技术的临床应用打下了坚实的基础。
操作步骤编辑播报（1）样品的固定；（2）样品的制备和预处理；（3）预杂交；（4）探针和样品变性；（5）用不同的探针杂交以检测不同的靶序列；（6）漂洗去除未结合的探针；（7）检测杂交信号，进行结果分析·荧光信号观察：将处理好的样品置于荧光显微镜下，选择分散较好的区域来观察。
三色（或者更多）荧光激发下，观察到不同颜色的荧光图像。
通常选用20X物镜来扫描样品杂交区域，40X或100X物镜下观察样品，从一定的方向进行计数，并对计数情况进行分析。
FISH技术全攻略FISH技术，即荧光原位杂交技术，是一种常用于细胞和组织中DNA 和RNA分子的定位和检测的方法。
它利用荧光标记的探针与待测物（DNA 或RNA）特异性结合，并通过显微镜观察荧光信号的强弱、位置等特征，从而实现对目标分子的检测和定位。
下面是FISH技术的全攻略。
一、实验准备1.准备标记探针所需的DNA或RNA杂交模板。
2.选择适合的荧光标记物，如荧光素或荧光染料。
根据待测物的特异性，选择合适的探针序列。
3.选择适当的杂交缓冲液和嵌合反应缓冲液。
4.准备样本制备所需的试剂和器材，如细胞培养液、组织切片等。
二、标记探针1.获得待测物的DNA或RNA序列，并设计与之特异性结合的引物。
2.利用引物将待测物扩增，并进行纯化。
3.利用PCR或反转录-PCR等方法将引物和合适的荧光标记物连接起来，形成标记探针。
4.对标记探针进行纯化和定量，确保其纯度和浓度适当。
三、样本制备1. 细胞样本制备：将待检测的细胞培养在无菌条件下，收集并进行固定处理，如用甲醛溶液固定细胞，并进行膜通透处理，如用0.1% Triton X-100等溶液处理。
2.组织样本制备：将待检测的组织收集起来，并进行固定处理和脱水处理，如用乙醚和乙醇等溶液处理。
四、杂交反应1.准备杂交缓冲液：根据具体要求配制适当的杂交缓冲液，如SSC缓冲液（含盐和柠檬酸），并加入适量含有探针的杂交模板。
2.加热探针和杂交目标：将探针和待测物的杂交模板一起加热处理，使其变性。
3.杂交：将变性后的标记探针与杂交模板进行杂交，使其重新结合。
4.温度控制：根据具体情况选择合适的杂交温度和时间，并进行合适的温度控制。
五、信号检测与图像分析1.温度冲洗：在特定的温度和缓冲液条件下进行冲洗，去除未结合的探针和杂交模板。
2.荧光显微镜观察：将样本放在显微镜下，观察和记录荧光信号的强度和位置。
3.图像分析：利用图像分析软件对荧光显微镜下观察到的图像进行处理和分析，如测量信号的强度和位置。
荧光原位杂交技术（FISH）在产前诊断中的应用一直备受关注。
近年来，随着该技术在临床实践中的不断深入和发展，专家共识也逐渐形成。
在本文中，将从深度和广度上对荧光原位杂交技术在产前诊断中的专家共识进行全面评估，并撰写一篇有价值的文章，以便读者能更深入地理解这一领域的最新进展和专家观点。
1. 荧光原位杂交技术概述- 荧光原位杂交技术是一种基于DNA的细胞遗传学技术，能够定位和检测细胞中特定DNA序列的存在和定位。
该技术通过使用标记了荧光物质的探针，使得特定的DNA序列在细胞或组织的显微镜下呈现出荧光信号，从而实现对细胞遗传信息的定量和定位检测。
在产前诊断中，荧光原位杂交技术能够用于检测胎儿染色体异常、基因突变等遗传性疾病，具有高灵敏度和特异性的优势。
2. 专家共识的形成- 随着荧光原位杂交技术在产前诊断中的广泛应用，越来越多的专家学者参与其中，并在临床实践和科研工作中积累了大量的经验和数据。
通过学术会议、专家讨论会、文献研究等形式，专家们逐渐达成了对荧光原位杂交技术在产前诊断中应用的共识。
这些共识涵盖了该技术的临床适应症、操作规范、质控要求、结果解读等方面，为该领域的规范化和标准化提供了重要指导。
3. 专家共识的内容和意义- 在产前诊断中，荧光原位杂交技术的专家共识主要包括对该技术的临床应用范围和标准化操作流程的制定。
专家们一致认为，该技术在胎儿染色体异常、染色体结构异常、基因突变等方面具有重要应用意义，可以为胎儿遗传疾病的早期筛查和诊断提供可靠依据。
专家共识还对该技术的样本采集、实验操作、结果解读等方面提出了具体要求，以确保临床应用的准确性和可重复性。
4. 个人观点和理解- 就我个人来说，我认为荧光原位杂交技术在产前诊断中的应用具有重要的临床意义和发展前景。
通过该技术，我们可以更准确地了解胎儿遗传信息，及时发现和诊断潜在的遗传疾病，为家庭和社会减少遗传疾病的发病率和负担提供了可能。
专家共识的形成也为该技术在临床实践中的标准化和规范化提供了重要支持，有助于推动该领域的进一步发展和应用。
探讨PNA-FISH在组织石蜡切片中应用的技术要点代蕾颖;胡军;吕瑛【摘要】20世纪80年代末,起源于放射性杂交的荧光原位杂交(FISH)技术开始建立.20多年来,这项技术已经得到了长足的发展,大量商业化探针的出现更使其广泛应用于临床诊断.随着FISH新技术的出现,探针的种类也不断增加,肽核酸探针就是其中一种.肽核酸(Peptide Nucleic Acid,PNA)是一类具有类多肽骨架的DNA类似物,它是不带电荷的分子,避免了寡核苷酸与其靶序列结合时因电荷相互排斥所导致的杂交不稳定性,且PNA与靶序列的结合不易受杂交液离子强度的影响,从而显示出其极强的杂交优势,大大提高了检测灵敏度[1].PNA-FISH技术适用于多种标本类型,特别是档案标本,如福尔马林固定石蜡包埋的组织.【期刊名称】《承德医学院学报》【年(卷),期】2012(029)001【总页数】3页(P66-68)【关键词】荧光原位杂交;肽核酸;石蜡切片【作者】代蕾颖;胡军;吕瑛【作者单位】北京金菩嘉医疗科技有限公司,北京100176;北京金菩嘉医疗科技有限公司,北京100176;北京金菩嘉医疗科技有限公司,北京100176【正文语种】中文【中图分类】R394-3320世纪80年代末，起源于放射性杂交的荧光原位杂交 (FISH)技术开始建立。
20多年来，这项技术已经得到了长足的发展，大量商业化探针的出现更使其广泛应用于临床诊断。
随着FISH新技术的出现，探针的种类也不断增加，肽核酸探针就是其中一种。
肽核酸(Peptide Nucleic Acid，PNA)是一类具有类多肽骨架的DNA类似物，它是不带电荷的分子，避免了寡核苷酸与其靶序列结合时因电荷相互排斥所导致的杂交不稳定性，且PNA与靶序列的结合不易受杂交液离子强度的影响，从而显示出其极强的杂交优势，大大提高了检测灵敏度[1]。
PNA-FISH技术适用于多种标本类型，特别是档案标本，如福尔马林固定石蜡包埋的组织。
一些国外生物技术公司的简介QIAGEN：德国著名的试剂公司，该公司的核酸分离纯化系列基于多项专利技术，纯度高，产量高，快速方便，品种齐全，为世界知名品牌。
其大多数产品以即用型试剂盒形式提供，随产品有非常详细的操作技术手册。
此外，还提供优质的传染系统，RT/PCR反应系统（包括高特异性的逆转录酶及热启动的Taq酶），蛋白及多肽表达、纯化、检测分析系统。
Ambion：该公司始终致力于开发RNA相关产品，在RNA的分离纯化、RACE、RT-PCR 方面有许多非常有特色的产品，并提供优质的Northern杂交体系，和高效的体外翻译体系。
如今，其产品在RNA研究领域已经成为研究人员的首选品牌。
Invitrogen：该公司成功地提供了PCR产物快速克隆试剂盒，及与之配套的系列产品，包括高效转染和转化试剂、高效感受态细胞、全面的原核及真核基因表达系统、酵母双杂交系统等多种特色产品。
大大便利了分子克隆的全过程操作。
其成功并购了Gibco/BRL，Novex，Research Genetics等知名公司，产品覆盖更为广泛。
Clontech：现已成为B.D.公司旗下分子生物学主力舰。
该公司的cDNA试剂盒、荧光蛋白报告基因系统、酵母双杂交系统、基因Array产品是独具特色的产品，其中一些试剂盒（GFP、Tet Off &On等）获得过多次大奖。
Clontech公司聚集了一大批优秀的科学家，在分子研究的各个领域开发出了许多设计思路独特，快捷便利的试剂产品，紧跟科学前沿。
Strategene：该公司的特色产品包括：预制基因文库、定制文库、文库构建产品、感受态细胞、高效转染试剂、点突变试剂盒、PCR仪及多种专利产品，在分子生物学研究的多个方面有不凡表现，受到全球实验室的好评，成为迅速崛起的佼佼者。
Novagen：该公司在蛋白表达和纯化工具的研究上成绩卓著，发展了相对应的表达载体和纯化方法，使得用户可以很方便地将蛋白表达、纯化、检测在有协调性的Novagen 技术系统内完成。
单核细胞增生李斯特菌和致病性弧菌的双重肽核酸原位荧光杂交检测吴姗;李可;方云;楼成杰;虞惠贞;张明哲;帅江冰;张晓峰【摘要】为了同步快速检测单核细胞增生李斯特菌(简称单增李斯特菌)和致病性弧菌,建立了它们的双重肽核酸(peptide nucleic acid,PNA)原位荧光杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)检测方法.在用单重PNA探针分别检测单增李斯特菌和致病性弧菌的基础上,建立了可同步检测它们的双重PNA荧光检测方法,优化了适合这2种菌同步双重杂交的固相荧光原位杂交检测参数.在标记的荧光为FAM和Cy3的情况下,使用Leica DM 6000B荧光显微镜对4种荧光滤光模块I3、L5、N21和Y3的检测效果进行比较,结果表明:在进行双重荧光检测时,建议选择L5和Y3的组合分别观察绿色荧光和红色荧光.比较2种菌液体积比例对检测结果的影响表明:当比例从1:1调至1:9时,2种菌可同时在2个检测通道中被检测到;当比例调至1:19时,量少的菌则很难被观察到.综上表明:2种PNA探针分别被标记上FAM和Cy3荧光后,可使用Leica DM 6000B荧光显微镜在L5和Y3滤镜模块下分别进行绿光和红光的观察.说明若选择合适的荧光及荧光滤光模块,可使用普通荧光显微镜完成单增李斯特菌和致病性弧菌的PNA-FISH同步检测.【期刊名称】《浙江大学学报（农业与生命科学版）》【年(卷),期】2018(044)006【总页数】8页(P659-666)【关键词】双重肽核酸探针;荧光原位杂交;单核细胞增生李斯特菌;弧菌【作者】吴姗;李可;方云;楼成杰;虞惠贞;张明哲;帅江冰;张晓峰【作者单位】浙江省检验检疫科学技术研究院,杭州310016;浙江省检验检疫科学技术研究院,杭州310016;浙江省检验检疫科学技术研究院,杭州310016;浙江省检验检疫科学技术研究院,杭州310016;浙江省检验检疫科学技术研究院,杭州310016;浙江省检验检疫科学技术研究院,杭州310016;浙江省检验检疫科学技术研究院,杭州310016;浙江省检验检疫科学技术研究院,杭州310016【正文语种】中文【中图分类】Q93-33单核细胞增生李斯特菌（简称单增李斯特菌）和致病性弧菌是生活中常见的、危害性较大的食源性致病菌。
fish技术在病理诊断中的应用病理诊断是医学领域中重要的一环，通过观察和分析组织及细胞的形态、结构和功能来确定疾病的类型和特征。
近年来，一种新的分子生物学技术——fish技术（Fluorescence in situ hybridization）逐渐应用于病理诊断中，为病理医师提供了更加准确和有效的诊断手段。
fish技术是一种基于DNA或RNA的分子探针与细胞或组织中特定序列的互补配对而发生的荧光信号的检测技术。
fish技术可以用于检测染色体异常、基因扩增、基因融合等分子水平的变化，从而帮助病理医师确定疾病的诊断和预后。
fish技术在肿瘤病理学中具有广泛的应用。
例如，在肺癌中，fish 技术可以检测EGFR基因突变、ALK基因融合等特定基因的异常，从而为选择靶向治疗提供重要依据。
此外，fish技术还可用于乳腺癌、胃癌、卵巢癌等肿瘤的分子诊断，提高了对肿瘤类型和预后的判断准确性。
fish技术在遗传病的诊断中也有重要作用。
遗传病是由基因突变引起的疾病，fish技术可以帮助病理医师确定染色体异常和基因突变，进而诊断遗传病。
例如，在唐氏综合征的诊断中，fish技术可以检测21号染色体上的三体，确认疾病的存在。
此外，fish技术还可以用于先天性心脏病、遗传性肾病等遗传病的诊断。
fish技术还在微生物学领域有着重要应用。
传统的微生物学诊断方法需要进行细菌培养和鉴定，耗时且存在一定的假阴性结果。
而fish技术可以直接检测细菌、病毒等微生物的核酸序列，提高了微生物学诊断的准确性和迅速性。
例如，在结核病的诊断中，fish技术可以检测结核分枝杆菌的核酸序列，快速确定病原体，缩短了诊断时间。
fish技术还可用于研究染色体结构和功能。
通过fish技术，可以观察和分析染色体的形态和变异，探究染色体异常与疾病发生的关系。
fish技术作为一种新的分子生物学技术，在病理诊断中的应用前景广阔。
它可以帮助病理医师准确定位和诊断疾病的分子变化，提高了病理诊断的准确性和敏感性。
医学科学设计与研究作业姓名：王祥璞学号：20166020268 班级：16届口腔基础医学检测并定位牙周致病菌的创新型方法：PNA-FISH技术Luzia Mendes 、Catarina Ferreira、 Miguel Goncalves Pinto 均毕业于波尔图大学牙科学院的牙周部。
Rui Rocha、Andreia Sofia Azevedo 、Nuno Filipe Azevedo毕业于波尔图大学工程院化学工程系的能源、生物科技、环境、工艺学实验室。
关键字PNA-FISH技术（肽核酸-荧光原位杂交技术）、组织浸润、伴放线放线杆菌（Pg）、牙龈卟啉单胞菌(Aa)、牙周疾病摘要目的：我们的目的是通过应用FISH(荧光原位杂交技术)开发肽核酸（PNA）探针，用以检测龈下菌斑和牙龈组织中的伴放线放线杆菌以及牙龈卟啉单胞菌，并对其位置进行定位。
方法：针对每种微生物设计各自的PNA探针，优化之后的PNA-FISH方法可以使得每种微生物和它们各自的探针（也就是PNA-FISH复合物）同时杂交。
在对Pg和Aa代表菌株进行测试之后，PNA-FISH方法就可以用来对患有重度牙周炎的患者收集的龈下菌斑和牙龈样本中的微生物进行监测。
结果：对于（Pg PNA1007和 Aa PNA235）两种探针而言最佳的杂交环境是59℃ 150分钟。
Pg PNA1007探针和 Aa PNA235探针的特异性和敏感性分别都达到了100%和99.9%。
临床样本的结果表明PNA-FISH方法可以监测并区分位于龈下菌斑和牙周组织内混合微生物群中的目标细菌。
讨论：这项研究为监测并定位临床样本中的Pg和Aa细菌提供了一种新的高精度的方法，并且仅需要短短的数小时。
通过使用这种方法我们就可以观测微生物菌落中的这些菌种在牙周袋内的空间分布，并且在活体牙龈组织中首次应用了FISH（荧光原位杂交技术）技术。
1.介绍牙周炎是由易感个体的龈下菌斑和宿主防御系统之间的失衡所导致的。
过去十年来有关牙周膜的研究都非常的重要，然而，因为多种微生物复杂的性质以及进行体内研究的困难，有关科研和诊断目的方面的性质依然具有挑战性。
现代的分子生物学方法已经取代了传统的培养方式，并且提供了一些新的资源，这些资源不仅仅可以区分单一的微生物，还对所有具有潜在致病性的群体也具有非常的重要作用。
在这种情况下，生物膜研究中FISH（荧光原位杂交技术）的应用得到了重视，因为它可以通过标记的DNA探针和细菌核糖体RNA进行杂交对微生物进行原位鉴定。
一些人已经通过使用这项技术在体内观测到了龈上、龈下牙龈生物膜中牙周病原菌的空间分布，以及他们入侵宿主上皮细胞的能力。
然而，这项技术提供的附加价值有助于了解生物膜的三维结构以及它们和宿主组织之间的关系，FISH过程中的一些限制强烈的影响了这种关系。
比如低细胞渗透、杂交亲和性以及靶向部位对DNA探针的可通过性。
这些限制经常引发靶向部位特异性和敏感性的缺失，并随之丢失很多重要的信息。
为了克服这些问题，核酸类似物，也被称为DNA模拟物，得到了发展。
在1991年Nielsen等人首先发现了PNA（肽核酸），随后在90年代晚期应用于微生物检测。
在这种DNA模拟物中，DNA带负电荷的磷酸糖骨架被一种中性的聚酰胺主链所替代，这种聚酰胺主链由N-（2-氨基乙基）甘氨酸单元所组成。
中性PNA链和互补RNA链之间电荷斥力的缺乏会使得PNA/RNA更迅速、更强烈的结合。
结果表明，PNA探针相比同类的DNA探针能更快的提升对靶序列的可访问性。
并且，PNA分子的疏水性更利于细胞通过生物膜基质的渗透和扩散。
PNA的使用给传统的FISH技术带来了更强、更高的特异性和敏感度。
因此，首先我们的目标是发展高特异性、敏感度的PNA探针对牙周病原菌进行原位检测，Pg和Aa是位于龈下菌斑的牙周相关致病菌中的两种细菌，这些牙周相关致病菌也会机械性的入侵口腔上皮细胞。
因此，这是针对本次调查研究的合乎逻辑的选择。
2.材料和方法2.1 目标菌种和培养的维持8个牙龈卟啉单胞菌（Pg）过滤、临床分离、分类培养都是由Mike Curtis 和Koji Nakayama两位教授提供的。
3个伴放线放线杆菌菌株（Aa）由Casey Chen教授所提供。
所有的菌株（表2）都保存在添加了5%去纤维蛋白羊血的胰酶大豆琼脂（TSA）中，并将其放在37℃的厌氧环境下进行培养，每5-7天在新鲜的培养板上对聚集的菌落划线。
2.2 探针的发展设计针对每个微生物的PNA探针，首先用免费可行的Primrose（樱草花）程序区分出潜在有用的寡核苷酸和15个碱基对，Primrose（樱草花）程序和核糖体数据库项目II（RDP II ）的16S rRNA数据库是相连接的。
序列的选择是基于五个随机选择的菌株16S rRNA基因的比较。
为了避免丢失测试的五个随机菌株的感兴趣部位的可能序列。
其次，也为了更好的达到我们的目的，我们通过应用一些标准挑选出最好的PNA-FISH探针。
也就是说，目标微生物的检测数高一些并且非目标微生物的检测数低一些；探针的内部并没有自我互补的结构；两种探针拥有相似的预期的解链温度以及高的鸟嘌呤和胞嘧啶含量。
最后，所选的序列合成Pg和Aa PNA探针的末端，它们的末端通过一个双 AEEA连接臂分别与Alexa Fluor（一种荧光标记试剂） 488和594相连接。
2.3 理论灵敏度、特异性以及亲合力评价使用更新后的RDP II（核糖体数据库项目II）数据库对理论灵敏度和特异性进行评估，并通过美国国家生物技术信息中心（NCBI）的搜索进行确定，网址是/BLAST/.靶向序列至少要拥有1200个碱基对并且要有良好的质量。
总之，理论的敏感度和特异性是通过公式目标数/总的目标数 *100 以及非目标数/总的非目标数 * 100 来估算的，其中的“目标数”是代表被寡核苷酸探针检测出的目标菌株的数量，“总目标数”是代表数据库中所显示的目标菌株的总数量，“非目标数”是代表没有被寡核苷酸探针检测出来的非目标菌株的数量，“非目标总数”代表的是数据库中所显示的非目标菌株的总数量。
亲和力是基于由Fuchs 等人所制定的16S rRNA靶向图的荧光寡核苷酸探针的可访问性来评估。
2.4 PNA-FISH多元化协议的发展在对临床样本进行测试前每个设计的探针都会进行测试和优化。
杂交的方法是在Almeida等人所报告程序的基础上进行了一些改良。
对杂交的时间和温度进行了调整以求两种微生物能同时达到最强的信号（多重PNA-FISH）。
首先，我们在每个目标菌种的单纯培养中评估PNA-FISH协议。
在每种情况下，从TSA培养板中收集培养了3天的细胞，悬浮在无菌水中，之后涡旋1分钟。
用3孔载玻片，每30μL悬液放置在55℃的温度下15分钟，随后室温下沉浸在4%的多聚甲醛中，之后是50%的酒精，每次10分钟。
固定涂片随后用20μL的杂交液覆盖，杂交液中含有含10%硫酸葡聚糖、10mM(毫摩尔)氯化钠、0.2%聚乙烯吡咯烷酮、5mM（毫摩尔）EDTA二钠、0.1%Triton X-100（一种非离子型表面活性剂）、50mM(毫摩尔)Tris–HCl（三羟甲基氨基甲烷）、200 nM（纳摩尔）PNA探针。
将盖玻片盖上，把玻片放在潮湿的房间中59℃ 150分钟进行孵育。
在经过杂交后，移除盖玻片，浸没玻片并保存在预热（59℃）的含有5mM(毫摩尔)Tris碱、15mM(毫摩尔)氯化钠、0.1%Triton X-100（一种非离子型表面活性剂）的洗涤液中30分钟，随后在使用显微镜之前放在一个阴暗的地方进行空气干燥超过24小时，每个实验的负调控都是通过使用不含探针的杂交溶液完成的。
其次，测试两种探针分类学上相关的微生物以及（或者）可能的口腔群体。
最后，为了确保每个菌种的探针都能在一个多元化的过程中保持各自的生物学行为，将含有两种PNA探针的混合物同时施加在相应的两种菌种（Pg和Aa）的混合玻片上.为此，对来自每个菌种的10μL混悬液进行混合并且涂到玻片上。
按照上述的进行杂交。
用PNA-FISH对临床样本中的Aa和Pg进行定位和区分。
图-1 16S rRNA的序列与单碱基错配以及Aa PNA235 、 PgPNA1007 部分对齐，杂交的情况在右边显示。
图-2 在经过PNA-FISH和荧光显微技术处理之后的Pg（绿色）和Aa（红色）的单纯性培养.2.5 临床样本的收集临床样本的收集是来自于五个参加了波尔图大学临床牙科医学院的成年患者的样本。
所有的患者都被诊断为患有重度牙周炎，他们原本都是健康的，在过去的3个月里并没有进行任何有关抗菌方面的治疗。
我们所选择的这种便利性的非概率样本只基于研究者面对两种微生物在重度牙周炎中的高检测率时的批判性判断。
我们在收集样本之前都获得了患者的同意，按照规定，这项研究由波尔图牙科学院的伦理委员会批准。
用无菌的Gracey刮治器收集龈下菌斑的样本，随后用棉卷隔离牙齿并用无菌棉球去除龈上菌斑，样本悬浮在无菌生理盐水中并立即进行处理。
在牙周手术期间或者在拔除没有保留价值的牙齿时收集牙龈样本。
牙龈样本放置在4%的多聚甲醛中并且在4℃的温度下储存以备下一步的使用。
2.6 临床样本中验证PNA –FISH龈下菌斑悬浮液在10000XG（相对离心力）下离心5分钟。
在被再次离心之前，这些颗粒再悬浮在400μL 4%的多聚甲醛中1h.固定的细胞随后再悬浮在500μL 50%的乙醇中并储存在20℃温度下直到下一次使用。
杂交的时候，将一份30μL的固定细胞样本涂抹到3孔玻璃载玻片上并进行空气干燥。
牙龈组织活检是将其包埋在石蜡中，切成3μm的厚度，并放置在显微镜的载玻片上。
在杂交之前，玻片先放在二甲苯中浸没两次，每次15分钟；之后通过逐渐降低酒精浓度(100%, 95%, 80%, 70% and 50%)进行再水化，每次5分钟；最后，放在蒸馏水中冲洗10分钟并进行空气干燥。
将含有200nM（纳摩尔）每个菌种探针的20μL杂交液添加到两个临床样本中并按照之前所描述的进行杂交。
在阴暗处用60μL的4，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI”；100μ克/毫升）进行额外染色10分钟。
在进行微观可视化操作之前，将玻片用10mL的水进行冲洗并进行空气干燥。
2.7 微观可视化在进行微观可视化操作之前将样本用1滴非荧光浸泡油进行处理并盖上盖玻片。
用徕卡DM LB2荧光显微镜和装有能够筛选Alexa Fluor分子的敏感滤光器的徕卡DFC 3000 相机捕捉图像。
滤波器不能监测到用来确认自发荧光缺失的探针，所有的图片都通过徕卡IM50图像管理器、图像处理以及带有1000倍放大功能的归档软件获取，对于多种用途相同区域的图像则是通过与滤波器每一部分相应的PNA探针以及重叠区来获取的。
