雷帕霉素对高糖诱导的肾系膜细胞自噬抑

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雷帕霉素增强RSL3对睾丸癌细胞I-10的增殖、侵袭与迁移的抑制作用

睾丸癌是青年人群中最常见的恶性肿瘤［1］。

西方国家发病率在过去20年中上升,手术和以顺铂为基础的化学疗法的结合使得睾丸癌患者的治愈率大于90%［2］。

尽管如此，10%~20%患有转移性疾病的睾丸癌患者不能通过基于顺铂的化疗治愈［3］。

因此，探索治疗睾丸肿瘤的新方法具有研究价值。

铁死亡是一种铁依赖形式的非凋亡细胞死亡，其特征是脂质ROS 的积累［4］。

在细胞和小鼠中进行的遗传学研究确定硒酶谷胱甘肽过氧化物酶（GPX4）是这种形式的细胞死亡的关键调节因子。

GPX4将脂质氢过氧化物转化为脂质醇，这一过程阻止了铁（Fe 2+）依赖的有毒脂质活性氧（ROS ）的形成。

GPX4功能的抑制导致脂质过氧化，并可诱导铁死亡［5,6］。

近年来，人们在设计和开发基于铁死亡诱导的抗癌药物方面做了大量工作，在癌症治疗中引入铁死亡具有很好的治疗潜力［7］。

RSL3是一种常用的铁死亡诱导剂，通过抑制谷胱甘肽Rapamycin enhances inhibitory effect of RSL3on proliferation,invasion and migration of testicular cancer I-10cells in vitroLI Bin,WANG Yue,HOU Fengwei,DU Jiaru,TONG XuhuiSchool of Pharmacy,Bengbu Medical College,Anhui Provincial Engineering Research Center for Biochemical Pharmaceuticals,Bengbu 233030,China摘要：目的探究雷帕霉素增强RSL3对睾丸癌细胞I-10的增殖、侵袭与迁移能力的抑制作用。

方法MTT 法检测RSL3（Type II ）及合用雷帕霉素（RAPA ）作用后I-10细胞的存活率。

将RSL3（0~16μmol/L ）分别以及联合16μmol/L 雷帕霉素作用于睾丸癌细胞I-10，采用MTT 法检测I-10细胞增殖抑制情况，利用集落克隆形成实验检测细胞增殖能力，采用划痕实验和Transwell 小室检测I-10细胞的迁移与侵袭能力，采用流式细胞术检测I-10细胞的脂质活性氧水平，采用GSH 和MDA 检测试剂盒检测细胞中GSH 和MDA 含量，利用Western blot 检测细胞GPX4蛋白表达。

雷帕霉素对肾小管上皮细胞生物学行为的影响及其治疗糖尿病肾病分

表达变化。结果Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ实验结果表明，ＴＧＦ — Ｂｌ诱导
通过表型改变而转变为成纤维细胞的一个过程，是发生肾间质纤维化的重要机制之一，这些成纤维细
胞通过管状基底膜迁移转变成间质。
Ｒ５８７．２４
和上皮细胞来源的肿瘤细胞中，ＴＧＦ．１３１能诱导上皮细胞ＥＭＴ的发生＿２Ｊ。该研究拟利用ＴＧＦ．３１１诱导肾小管上皮细胞发生ＥＭＴ，并联合使用ＲＡＰＡ在细胞水平观察其对ＥＭＴ的抑制作用；同时利用糖尿病
用，从而有利于减轻蛋白尿和肾间质纤维化。转化
生长因子Ｂｌ（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇｇｒｏｗｔｈｆａபைடு நூலகம்ｃｔｏｒｂｅｔａ１，ＴＧＦ．Ｂ１）是最重要的促纤维化因子，在大多数上皮细胞
◇基础医学研究 ◇
雷帕霉素对肾小管上皮细胞生物学行为的影响及其治疗糖尿病肾病分子机制的初步研究
成
摘要目的
芳，涂珍珍，周利利，苏
超，王德光，周海胜
研究雷帕霉素（ＲＡＰＡ）对肾小管上皮细胞生
ｄｏｉ：１０．１９４０５／ｊ．ｃｎｋｉ．ｉｓｓｎｌ０００—１４９２．２０１７．０１．００１

雷帕霉素靶分子在糖尿病肾病发病机制中的作用

雷帕霉素靶分子在糖尿病肾病发病机制中的作用
王德光;李学旺
【期刊名称】《国际内科学杂志》
【年(卷),期】2007(34)7
【摘要】哺乳动物雷帕霉素靶分子位于胰岛素/胰岛素样生长因子通路的下游,同时接受营养信号和能量信号,参与细胞、器官和生物体肥胖的调控,引起胰岛素抵抗,促进血管内皮细胞生长因子的表达,可能在2型糖尿病及糖尿病肾病的发生发展中起重要的作用.
【总页数】4页(P375-378)
【作者】王德光;李学旺
【作者单位】安徽医科大学附属省立医院肾内科,安徽,合肥,230001;北京协和医院肾内科,北京,100730
【正文语种】中文
【中图分类】R587.2
【相关文献】
1.雷帕霉素靶分子信号转导通路在增生性玻璃体视网膜病变中的表达及意义 [J], 才娜;刘宁宁;柳力敏;万超;王昕华;陈蕾
2.雷帕霉素靶蛋白在糖尿病肾病发病机制中的作用 [J], 李书芳
3.雷帕霉素靶在小鼠受精卵早期发育中的作用研究 [J], 李延笑;孙炳奇;于秉治
4.雷帕霉素靶蛋白在糖尿病肾病发病机制中的作用 [J], 李书芳（综述）;马云青（审校）
5.雷帕霉素及其相关分子靶点在糖尿病肾病发病机制中的研究进展 [J], 校丽芳;严玉澄
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雷帕霉素对肾小管上皮细胞增殖和凋亡的影响

雷帕霉素对肾小管上皮细胞增殖和凋亡的影响成芳;赵冰封【期刊名称】《中国药物评价》【年(卷),期】2017(34)4【摘要】目的:探讨雷帕霉素(Rapamycin,RAPA)对肾小管上皮细胞增殖和凋亡的影响.方法:体外培养肾小管上皮细胞(HK-2细胞),选择100,200,400,800 ng·mL-1雷帕霉素作用于HK-2细胞24、48、72 h.利用MTT实验分析雷帕霉素对HK-2细胞增殖的影响,并计算各浓度及不同时间的增殖抑制率优化雷帕霉素作用的浓度和时间;选择最佳的作用浓度和作用时间处理HK-2细胞,通过流式细胞分析技术,分析雷帕霉素对HK-2细胞的凋亡的影响.结果:MTT实验显示不同浓度的雷帕霉素,对增殖有抑制作用,且表现浓度依赖性和时间依赖性;雷帕霉素可以促进HK-2细胞的凋亡.结论:通过HK-2细胞模型研究,发现雷帕霉素可抑制肾小管上皮细胞增殖、促进细胞凋亡.【总页数】3页(P264-266)【作者】成芳;赵冰封【作者单位】安徽医科大学第二附属医院,安徽合肥230601;安徽省妇幼保健院,安徽合肥230001【正文语种】中文【中图分类】R349.53;R978.15【相关文献】1.厄贝沙坦通过抑制IRAK1介导p38MAPK信号通路对高糖诱导的肾小管上皮细胞增殖和凋亡的影响 [J], 高兰;刘海蔚;纪群2.miR-16-5p下调ACE对高糖作用的肾小管上皮细胞增殖、凋亡的影响 [J], 宋现静;吕文山3.载脂蛋白M对肾小管上皮细胞增殖凋亡的影响 [J], 白亚萍;裴文俊;吴亚丽;闵娇;花长春;刘洁;章尧4.萝卜硫素对高糖诱导人肾小管上皮细胞增殖和凋亡的影响及机制 [J], 周磊;艾望;陈小娟;闻春月5.霉酚酸酯与雷帕霉素对多囊肾囊肿衬里上皮细胞增殖和凋亡影响的比较 [J], 张彤;付莉莉;梅长林因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

雷帕霉素

雷帕霉素科技名词定义中文名称：雷帕霉素英文名称：rapamycin其他名称：西罗莫司(sirolimus)定义：一种新型大环内酯类免疫抑制药物。

通过与相应免疫嗜素RMBP结合抑制细胞周期G0期和G1期，阻断G1进入S期而发挥作用，其效应为：①抑制T和B细胞增殖；②抑制IL-1、IL-2、IL-6和IFN-γ诱导的淋巴细胞增殖；③抑制IgG和供者特异性抗体(细胞毒抗体)产生；④抑制单核细胞增殖。

可用于抗移植排斥反应和治疗类风湿性关节炎、红斑狼疮等自身免疫病。

应用学科：免疫学（一级学科）；应用免疫（二级学科）；免疫治疗（三级学科）本内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布求助编辑百科名片雷帕霉素（RAPA）是一种新型大环内酯类免疫抑制剂。

雷帕霉素通过不同的细胞因子受体阻断信号传导，阻断T淋巴细胞及其他细胞由G1期至S期的进程，从而发挥免疫抑制效应。

目录编辑本段基本解释雷帕霉素（RAPA）是一种新型大环内酯类免疫抑制剂。

雷帕霉素通过不同的细胞因子受体阻断信号传导，阻断T淋巴细胞及其他细胞由G1期至S期的进程，从而发挥免疫抑制效应。

从临床应用来看，雷帕霉素有很好的抗排斥作用，且与环孢霉素A（CsA）和FK506等免疫抑制剂有良好的协同作用，是一种疗效好，低毒，无肾毒性的新型免疫抑制剂。

2010年3月，美国德克萨斯州大学的一项研究显示，雷帕霉素可用于治疗阿尔茨海默症，该药物成分也存在于复活岛土壤中细菌的分泌物。

编辑本段简介雷帕霉素分子式雷帕霉素（Rapamycin，RAPA，RPM），又名Sirolimus，属大环内酯类抗生素，与FK506的结构相似。

起初雷帕霉素被研究作为低毒性的抗真菌药物，1977年发现雷帕霉素具有免疫抑制作用，1989年开始把RAPA作为治疗器官移植的排斥反应的新药进行试用，目前（2010年）RAPA的I、II期临床试验已结束，III期临床试验正在进行之中。

编辑本段结构雷帕霉素的分子式为C51H79NO13，分子量991KD，为白色固体结晶，熔点为183-185℃，亲脂性，溶解于甲醇、乙醇、丙酮、氯仿等有机溶剂，极微溶于水，几乎不溶于乙醚。

雷帕霉素对糖尿病肾病大鼠足细胞损伤的作用

雷帕霉素对糖尿病肾病大鼠足细胞损伤的作用陈珏;张路路;严玉澄;顾乐怡;吴蓓;倪兆慧;钱家麒【期刊名称】《上海交通大学学报（医学版）》【年(卷),期】2013(033)009【摘要】目的观察哺乳动物雷帕霉素靶分子(mTOR)信号抑制剂雷帕霉素对糖尿病肾病大鼠足细胞的作用.方法 SD大鼠经链脲佐菌素(STZ)-次性腹腔注射建立糖尿病模型.建模成功后,将糖尿病SD大鼠随机分为雷帕霉素治疗组(建模后第12周开始用雷帕霉素治疗4周,n=6)、糖尿病肾病组(建模后第12周开始用等量生理盐水灌胃4周,n=6),以未建模SD大鼠作为正常对照组(n=6).BCA法检测各组大鼠24 h尿总蛋白水平；光学显微镜下观察大鼠肾脏组织学改变,透射电子显微镜观察足细胞足突形态并测量足突宽度；采用免疫荧光染色激光共聚焦显微镜及Western blotting法检测足细胞损伤标志蛋白desmin 和足细胞标志蛋白podocin的表达.结果与糖尿病肾病组比较,雷帕霉素治疗组大鼠24 h尿总蛋白排泄量显著减少(P ＜0.05)；肾小球系膜基质积聚缓解,炎症细胞浸润轻微,肾小球体积小且足细胞宽度窄(P＜0.05)；足细胞desmin表达减少,podocin表达增加.结论雷帕霉素可减轻糖尿病肾病大鼠的蛋白尿症状,这可能与雷帕霉素对足细胞的保护作用有关.【总页数】6页(P1197-1201,1208)【作者】陈珏;张路路;严玉澄;顾乐怡;吴蓓;倪兆慧;钱家麒【作者单位】上海交通大学医学院附属仁济医院肾脏科,上海200127;上海交通大学医学院附属仁济医院肾脏科,上海200127;上海交通大学医学院附属仁济医院肾脏科,上海200127;上海交通大学医学院附属仁济医院肾脏科,上海200127;上海交通大学医学院附属仁济医院肾脏科,上海200127;上海交通大学医学院附属仁济医院肾脏科,上海200127;上海交通大学医学院附属仁济医院肾脏科,上海200127【正文语种】中文【中图分类】R587.2【相关文献】1.mTtor通路在糖尿病肾病大鼠足细胞损伤中的作用 [J], 钟梅芳;赵青;李秋月;陈钦开2.二至丸提取物对糖尿病肾病大鼠足细胞损伤的保护作用研究 [J], 尹江宁;卢国元3.芪地糖肾颗粒通过调节ERK信号通路减轻2型糖尿病肾病大鼠足细胞损伤的作用研究 [J], 高雪; 柳红芳; 安至超; 何其英4.藏药灰兜巴对糖尿病肾病大鼠足细胞损伤的改善作用 [J], 杨坤宝;庞宗然;尹长江;白颖慧;鲁碧楠;于宁;韩桂艳5.黄芩苷对糖尿病肾病大鼠足细胞损伤的修复作用研究 [J], 苏宁;赵平;佘燕玲;周乐全;杜标炎;罗惠;郎建英因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

雷帕霉素对糖尿病肾病大鼠足细胞生物学行为及mTOR信号通路的影响

雷帕霉素对糖尿病肾病大鼠足细胞生物学行为及mTOR信号通路的影响黄乔木;何艳【期刊名称】《生物技术进展》【年(卷),期】2022(12)3【摘要】为了探究雷帕霉素对糖尿病肾病大鼠足细胞生物学行为及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信号通路的影响,采用链脲霉素腹腔注射构建糖尿病肾病大鼠模型,将正常大鼠体内取出的足细胞设为对照组,模型大鼠体内取出的足细胞设为糖尿病肾病模型组(DN组),取2 mg·kg^(−1)雷帕霉素干预DN组足细胞,并将其设为雷帕霉素组(RAPA组)。

采用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐[3-(4,5-dimethylthiahiazo-z-y1)-2,5-diphenytetrazoliumromide,MTT]法检测足细胞增殖水平,Transwell检测细胞迁移和侵袭能力,流式细胞术检测细胞凋亡水平,Western blot法检测上皮-间充质转化标志物[E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、波形纤维蛋白(vimentin)]、mTOR和核糖体S6激酶1(S6K1)蛋白表达水平。

结果显示,与对照组相比,DN组细胞增殖水平显著被抑制,细胞迁移、侵袭水平显著升高,细胞凋亡率显著增加,上皮-间充转标志物E-cadherin表达显著下调,N-cadherin和Vimentin 表达显著上调,mTOR/S6K1信号通路被显著活化(P<0.05)。

与DN组相比,RAPA 组细胞增殖水平显著升高,细胞迁移、侵袭水平显著降低,细胞凋亡率显著降低,E-cadherin表达显著上调,N-cadherin和Vimentin表达显著下调,mTOR和S6K1的蛋白表达显著被抑制(P<0.05)。

结果表明,雷帕霉素通过抑制mTOR信号通路,促进足细胞体外增殖,抑制细胞迁移、侵袭、凋亡和上皮-间充质转化,发挥对糖尿病肾病大鼠足细胞的保护作用。

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白及其抑制剂与肾脏疾病的研究进展

但是，ＴＲ是一种普遍存在的激酶，ｍＯ雷帕霉素抑制剂同时
也阻止几乎所有的细胞类型，包括肾细胞。
个具有小ＧＰＳＴａｅ活性的蛋白．细胞中的Ｒｅｈｂ～ＧＰ呈活Ｔ性状态。，ＣＩ２是ＧＰｉ激活蛋白，作用于Ｒｅ１ｓＴｒｅｓ它ｈｂ—ＧＰ使Ｔ
用雷帕霉素ｌ－２。】１］
▲南方医科大学在读博士研究生
△通信作者。科主任，授，教博士研究生导师；Ｅ—ｍｉｗｉａｂ＠ａｌｅｌｎｏ：ｉ
１３ｃｒ６．ｏｎ
・
２６８０・
广东医学
２１９月第３０２年３卷第１８期
年，ｒｎＢｏ等证实并克隆了哺乳动物ＴＲ基因，ｗＯ其产物只有
一
抑制蛋白家族。非磷酸化时则抑制真核细胞翻译起始因子４（Ｉ４）ＥｅＦＥ活性。ｍＯＴＲ活化并磷酸化４Ｂ，ＥＰ然后由ｅＦＥ、ｌ４
ｅＦＧ一种支架蛋白）ｌ４ＲＡ螺旋酶）ｅＦ形成Ｉ４（、ｅＦＡ（Ｎ和ｌ３
诱导肾小管上皮细胞凋亡的双重作用 …。值得注意的
ＴＣ／Ｓ２复合物的调节，ｍＯＳ１ＴＣ是ＴＲ信号的正调节物］。生
长因子还可以通过细胞外调节蛋白激酶（ＲＥＫ）一ＲＫ— ＳＴＣＳ２一ｍＯＣ信号通路调节ｍＯＣＴＲ１ＴＲ１活性。ＥＫ或ＲＫＲＳ在一个特定的位置通过磷酸化ｒＣ。ｒｃ失去活性进而Ｉ２使ｒＳＳ

活性维生素D3在雷帕霉素预处理系膜细胞增殖与凋亡中的作用

活性维生素D3在雷帕霉素预处理系膜细胞增殖与凋亡中的作用张金平;陈建平;张春江;赵丹;马莉;杨晓萍【期刊名称】《实用医学杂志》【年(卷),期】2014(000)015【摘要】Objective To investigate the effect of 1,25-dihydroxyvitamin D3 on proliferation and apoptosis of glomerular mesangial cells via thePI3K/Akt/mTOR signal pathway. Methods The normal control group, 1,25-dihydroxyvitamin D3 (10-8 mol/L) group, rapamycin (0.1 μg/mL) group and the rapamycin in combination with 1,25-dihydroxyvitamin D3 group. The cell proliferation was measured by cell counting kit-8 assay. The cell cycle and cell apoptosis were detected by flow cytometry assay , respectively. Results Compared with the normal control group, the proliferation of glomerular mesangial cells was significantly inhibited in the 1 ,25-dihydroxyvitamin D3 group, in the rapamycin group and in the rapamycin in combination with 1,25-dihydroxyvitamin D3 group. The cells at G1 phase were significantly increased, but the cells at S phase were significantly decreased, with significant increase of cell apoptosis rate. Compared with the 1,25-dihydroxyvitamin D3 group, the proliferation of human glomerular mesangial cells was significantly inhibited in the rapamycin group and in the rapamycin in combination with 1,25-dihydroxyvitamin D3 group. Compared with the rapamycin group, the cellsat G1 phase were significantly increased and the cells at S phase were significantly decreased in the rapamycin in combination with 1,25-dihydroxyvitamin D3 Group. Conclusions 1,25-dihydroxyvitamin D3 inhibits cell proliferation and promotes human glomerular mesangial cell apoptosis of human glomerular mesangial through the PI3K/Akt/mTOR signal pathway. 1,25-dihydroxyvitamin D3 and rapamycin can synergistically inhibit the proliferation of human glomerular mesangial cells.%目的：探讨活性维生素 D3[1，25（OH）2D3]通过 PI3K/Akt/mTOR 信号通路对人系膜细胞增殖与凋亡的调节作用。

细胞自噬与肾脏疾病的关联研究

细胞自噬与肾脏疾病的关联研究细胞自噬是细胞自身清除损坏细胞器、蛋白质等代谢产物的一种方式，它是一种细胞内基本生理现象。

在肾脏中，自噬扮演着重要的角色，它可以在维持肾脏组织稳态中发挥作用。

随着细胞自噬研究的深入，人们对细胞自噬与肾脏疾病的关系越来越感兴趣。

自噬对肾脏疾病的影响在肾脏中，自噬可以清理植入肾脏的大量细胞垃圾和蛋白质聚集物，从而维持肾脏组织的正常生理功能。

一些研究表明，自噬的缺陷可能导致许多肾脏疾病的发展和进展。

例如，糖尿病性肾病(Diabetic nephropathy)是一种严重的慢性疾病，它被认为是全球范围内慢性肾脏疾病的主要原因之一。

自噬在糖尿病性肾病中发挥重要作用，它可以清理由高糖浓度引起的损伤细胞，并维持肾脏小管细胞的正常功能。

当自噬系统发生缺陷时，可能导致糖尿病性肾病的发生，甚至导致慢性肾脏病的发展和进展。

此外，自噬还与其他肾脏疾病，如肾衰竭、肝硬化肾病等有关。

自噬是保护性的，它可以帮助细胞摆脱有害物质，包括代谢产物和易致病的微生物。

在许多实验动物模型中，缺乏自噬会导致蛋白质聚集，这会引起肝脏和肾脏等器官的损害。

自噬对治疗肾脏疾病的作用正如前面提到的，自噬是一种维持肾脏组织稳态的重要机制。

因此，一个合理的治疗肾脏疾病的途径就是调节自噬系统。

许多研究表明，治疗肾脏疾病的药物，如雷贝拉唑和格列净等，可以通过修复自噬回路来提高肾脏功能，并减轻肾脏疾病的症状。

事实上，已有一些利用自噬治疗肾脏疾病的例子。

例如，甘露醇是一种临床上常用的药物，用于治疗急性肾损伤。

一些研究表明，甘露醇可以通过启动自噬系统，减轻肾脏损伤并提高肾脏功能。

此外，许多天然产物，如黄芪和紫草，也显示出在治疗肾脏疾病方面的自噬效能。

总结细胞自噬是一种高度保守的细胞再生系统。

它在维持肾脏组织的正常生理状态中起着重要的作用，并且自噬缺陷可能导致多种肾脏疾病的发病和进展。

随着细胞自噬研究的深入，人们逐渐认识到其在治疗肾脏疾病中的潜力，自噬调节剂也成为治疗肾脏疾病的又一个选择。

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SA-β-gal 染色阳性率下降（P<0.05），细胞核异染色质斑块形成减少；高糖培养的细胞用 3-MA 干预 72 h 和 10 d 后，LC3 表达下
降，p62/SQSTMI表达升高，MDA及蛋白质羰基含量升高（均P<0.05），72 h细胞SA-β-gal染色阳性率上升（P<0.05），细胞核斑块
形成增多。结论高糖可抑制系膜细胞自噬功能，促进系膜细胞氧化损伤，加速细胞衰老；雷帕霉素干预可减轻高糖对系膜细胞
自噬功能抑制，减少氧化损伤，延缓衰老；3-MA 加重高糖对系膜细胞自噬功能的抑制，进一步加重细胞氧化损伤，加速衰老。
关键词：系膜细胞；高糖；雷帕霉素；自噬；氧化损伤；衰老
中图分类号：R587.2; R691.6
1 材料和方法 1.1 材料
2 月龄雄性 Spraque-Dawley 大鼠（清洁动物）购自北京维通利华实验动物技术有限公司；雷帕霉素和 3-甲基腺嘌呤购自Lc Labortatories；RPMI 1640细胞培养基和胎牛血清分别购于 Gibco 和 Hyclone Thermo；Pierce BCA assay kit购于Thermo；丙二醛（MDA）试剂盒购自南京建成公司；兔多抗 LC3 抗体来自 Sigma，小鼠抗 p62/SQSTMI单抗来自美国Santa Cruz，鼠二抗、兔二抗购自 Abcam；DAPI 购自北京碧云天公司。 1.2 原代肾小球系膜细胞分离培养及分组 1.2.1 大鼠系膜细胞的分离培养将 2 月龄雄性 Spraque-Dawley 大鼠在无菌条件下取双侧肾脏，剥离肾包膜，用剪刀把肾皮质剪成碎块，放于重叠 3 层不锈钢筛网上，边研磨边冲洗。镜下观察，若见 98%以上的肾小球去包曼氏囊，视野中基本上无肾小管存在，即可停止研磨冲洗。收集第2层筛网（75 μm）上的肾小球组织移入离心管，800 r/min×5 min 离心，弃上清，沉淀加入 V 型胶原酶，37 ℃ 消化 10~15 min，用 15% FBS RPMI 1640培养液终止消化后，800 r/min×5 min离心，弃上清，收集肾小球至铺有明胶的培养瓶中，用含有 15%胎牛血清的RPMI 1640培养基在37 ℃、5% CO2条件下培养［2］。7~10 d 后第 1 次传代，传代后 24 h 细胞贴壁，形态为梭形或不规则星形，3~4 d 汇合成片，用细胞免疫荧光染色鉴定，抗α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）及抗波形蛋白（Vimentin）染色阳性，抗细胞角蛋白（Cytokenratin）及抗Ⅷ因子染色为阴性。传至第 3 代用于实验。 1.2.3 实验分组细胞分 4 组。正常对照组：细胞在含 5 mmol/L 葡萄糖的 15% FBS RPMI 1640 培养液中培养。高糖组：细胞在含 30 mmol/L 葡萄糖的 15% FBS RPMI 1640 培养液中培养。雷帕霉素+高糖组：细胞在 30 mmol/L 葡萄糖和 10 nmol/L 雷帕霉素的 15% FBS RPMI 1640 培养液中培养。3-MA+高糖组：细胞在含 30 mmol/L 葡萄糖和 1 mmol/L 3-MA 的 15% FBS
Abstract: Objective To investigate the effects of rapamycin and 3-methyladenine on autophagy impairment, oxidative stress and premature senescence induced by high-glucose in primarily cultured rat mesangial cells. Methods Rat glomerular mesangial cells (GMCs) were isolated and cultured in normal glucose, high glucose, high glucose with 3-methyladenine (3-MA), or high glucose with rapamycin. At 24 h, 72 h and 10 days of culture, the cells were examined for expression levels of autophagy markers LC3 and p62/SQSTM1, malondialdehyde (MDA) and protein carbonyl, β-galactosidase (SA-β-gal) activity and heterochromatin foci (SAHF). Results Compared with those of normal cell culture, the cells exposed to high glucose for 72 h and 10 days showed down-regulated LC3 expression, up-regulated p62/SQSTM1 expression, elevated MDA and protein carbonyl levels, and increased SAHF formation and percentage of SA-β-gal-positive cells. These changes were reversed in GMCs exposed to high glucose and rapamycin for 72 h and 10 days, but exacerbated in cells incubated with 3-MA. Conclusion High glucose can suppress autophagic function of rat GMCs to result in oxidative damage and cell senescence. Rapamycin can attenuate autophagy impairment, oxidative damage and senescence induced by high glucose, whereas 3-MA can further aggravate high glucose-induced cell injuries in rat GMCs. Key words: mesangial cells; high glucose; rapamycin; autophagy; oxidative damage; senescence
RPMI 1640培养液中培养。分别于培养24 h、72 h、10 d 后取样检测各指标。 1.3 Western blotting 检测自噬标志物 LC3 和 p62/ SQSTMI 蛋白的表达
取 2×106个细胞加 0.1 ml 预冷的 RIPA 裂解液（50 mmol/L Tris-Cl［pH 7.6］，150 mmol/L NaCl，1% NP-40， 0.1% SDS，0.5%脱氧胆酸，1 µg/ml leupeptin，1 µg/ml aprotinin，0.5 mmol/L 苯甲基磺酰氟）进行匀浆，冰浴 30 min，在 4 ℃、12 000 r/min 离心 30 min，吸取上清蛋白，用 Micro BCA Protein Kit 测蛋白浓度。取 30~50 µg 总蛋白，加2×SDS上样缓冲液（2 ml，0.5 mol/L Tris pH 6.8，2 ml甘油，2 ml 20% SDS，0.5 ml 0.1%溴酚蓝，1 ml 1 mol/L DTT，2.5 ml ddH2O），100 ℃ 变性 5 min。 SDS-PAGE 分离后转印至硝酸纤维素膜，用 1×封闭液室温封闭 1 h，一抗用 LC3 抗体（1∶2000 稀释）和 p62 抗体（1∶200 稀释）4 ℃过夜；TBST 洗 3 次，每次 5 min，二抗（1∶2000稀释）室温孵育1 h；TBST洗3次，每次5 min，用化学发光（ECL，普利莱公司）显色。以β-actin 为内参照，采用Image J图像分析软件进行半定量分析。 1.4 系膜细胞衰老标志物-SA-β-Gal染色
文献标志码：A 文章编号：1673-4254（2012）04-0467-05
doi: 10.3969/j.issn.1673-4254.2012.04.006 /kcms/detail/44.1627.R.20120407.1635.002.html
Effect of rapamycin on high glucose-induced autophagy impairment, oxidative stress and premature senescence in rat mesangial cells in vitro
2012;32(4)
南方医科大学学报（J South Med Univ）
·467·
基础研究
雷帕霉素对高糖诱导的肾系膜细胞自噬抑制、氧化损伤和衰老的影响
李锦，白雪源，崔少远，傅博，陈香美中国人民解放军总医院肾病科/肾脏疾病国家重点实验室，北京 100853
摘要：目的探讨雷帕霉素及 3-甲基腺嘌呤（3-MA）对高糖诱导的原代大鼠系膜细胞自噬、氧化损伤及衰老的影响。方法从大
· Med Univ）
第 32 卷
及衰老的发生有关。近年来随着生活水平提高和生活方式的变化，热量摄入呈明显增加的趋势，代谢综合征在中国的发生率逐年递增。代谢综合征是导致糖尿病及心脑血管疾病的危险因素，也可引起代谢性疾病肾损伤。研究表明，高热量饮食可以加重组织器官的氧化损伤与衰老。但目前对于自噬在代谢性疾病肾损伤发生中的作用还不清楚。本研究首次观察了高糖对大鼠系膜细胞自噬活性、氧化损伤和衰老的影响，并探讨了自噬增强剂雷帕霉素及自噬抑制剂 3-MA 对高糖诱导的系膜细胞自噬抑制、氧化损伤及衰老的影响。