大鼠肾小球系膜细胞培养

褐藻素对高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞纤维化病变的缓解作用朱小雨;杨观玉;黎梓燃;汪成洋;谢曦【摘要】为了探讨褐藻素(fucoxanthin,FX)是否对高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞的纤维化病变有缓解作用,同时也为了探究其作用机制,本研究通过Western Blot 方法,检测了细胞外基质的主要成分—纤维连接蛋白(fibronectin,FN)和四型胶原(collagen Ⅳ,Col Ⅳ)的表达;利用免疫荧光方法观察了细胞中FN的含量;采用罗丹明标记鬼笔环肽对细胞骨架进行染色,观察了细胞骨架的变化;使用相关试剂盒检测了细胞内活性氧的变化、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)的酶活性以及丙二醛(Malondialdehyde,MDA)的含量;利用Western blot方法观察了细胞炎症相关因子ICAM-1和TGF-β1的表达.结果表明:在高糖刺激下的肾小球系膜细胞中蛋白FN和Col Ⅳ的含量显著升高,细胞呈现肥大状态;FX的处理在一定程度上可缓解上述病理现象,FX处理后高糖诱导升高的活性氧和MDA含量显著降低,而高糖诱导的下调的SOD活性被显著升高;高糖下显著升高的炎症因子—细胞间黏附分子-1 (Intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)和转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)的蛋白水平同样被FX逆转.由此认为:FX可以减少高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞的细胞外基质成分的积累,而且可以缓解细胞肥大现象,其机制可能与细胞内氧化应激减轻和炎症因子表达减少有关.研究提示:褐藻素对糖尿病肾病具有一定的保护效应.【期刊名称】《海南大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2018(036)002【总页数】7页(P117-123)【关键词】褐藻素;糖尿病肾病;纤维化;抗炎;氧化应激【作者】朱小雨;杨观玉;黎梓燃;汪成洋;谢曦【作者单位】热带生物资源教育部重点实验室,海南大学海洋学院,海南海口570228;热带生物资源教育部重点实验室,海南大学海洋学院,海南海口570228;热带生物资源教育部重点实验室,海南大学海洋学院,海南海口570228;热带生物资源教育部重点实验室,海南大学海洋学院,海南海口570228;热带生物资源教育部重点实验室,海南大学海洋学院,海南海口570228【正文语种】中文【中图分类】R965.1糖尿病肾病(diabetes nephropathy,DN)是糖尿病最主要的微血管并发症之一，也是导致末期肾病的重要原因[1]，目前对其尚未有完全理想的治疗方案[2]. 据WHO最新报告，全球约有4.22亿人患有糖尿病，约有30%的糖尿病患者都会遭受肾病的困扰. 作为一种慢性疾病，DN表现出一系列连续的病理特征变化，包括初期肾脏肥大、基底膜增厚以及之后的细胞外基质(extracellular matrix,ECM) 积累、肾小球硬化、间质纤维化和最终导致的肾衰竭[3]. 尽管DN发病的机理十分复杂且未被完全阐明，但高血糖被认为是糖尿病的一系列并发症，包括DN的公认致病因素[4]. 高糖诱导产生的过量活性氧簇(reactive oxygen,ROS) 是DN发病的始动环节[5]，同时，高血糖所诱导的炎症因子的异常表达也加重了病情的发展，介导了肾脏细胞的肥大、ECM的沉积和肾小球硬化等[6-7]. 由此，提高机体抗氧化能力和消除过量的炎症因子被越来越多地考虑并被作为治疗DN的策略[8-10].褐藻素(fucoxanthin，FX) 是一种海洋来源的类胡萝卜素，它广泛存在于棕藻中，其化学结构特殊，具有十分显著的生物活性，如具有抗癌、抗肥胖、抗糖尿病以及较为显著的抗氧化和抗炎活性[11]. 目前，褐藻素是否对糖尿病肾病具有保护效应及保护机制还尚未见报道.为此，本研究构建了体外糖尿病肾病模型，探讨了FX是否具有抗炎抗氧化的生物活性，是否可以缓解高糖诱导的细胞外基质增生，并初步探索了其作用机制，旨在为将FX开发成为抗DN的临床药物提供数据支持.1 材料与方法1.1 材料1.1.1 实验细胞大鼠肾小球系膜细胞GMCs购于中山大学动物实验中心.1.1.2 试剂与仪器 FX(成都普瑞发生物科技有限公司)；DMEM 高糖培养液、DMEM 低糖培养液(美国Gibco)；胎牛血清(杭州四季青生生物材料有限公司)；活性氧检测试剂盒、预染蛋白Marker、RIPA裂解液、蛋白酶抑制剂PMSF、BCA 蛋白浓度检测试剂盒、总SOD活性检测试剂盒、脂质氧化(MDA)检测试剂盒(碧云天生物科技有限公司)、罗丹明标记鬼笔环肽(Cytoskeleten)、Fibronectin、Col IV、TGF-β1、ICAM-1 蛋白抗体、HRP标记山羊抗兔IgG(武汉博士德生物科技有限公司)、垂直电泳仪及转膜系统 (Bio-Rad)、荧光倒置显微镜(OLYMPUS).1.2 方法1.2.1 大鼠肾小球系膜细胞的培养于含10%胎牛血清的DMEM 低糖培养液中进行细胞培养(37℃，5% CO2)，待细胞长至汇合后传代. 所有实验使用5～15代的细胞. 在给药处理前，先使用无血清培养液进行同步化处理. 24h后将细胞处理分为以下三组：5.6 mmol/L的葡萄糖DMEM作为正常组 (NG)，30 mmol/L的葡萄糖DMEM作为模型组(HG)，30 mmol/L的葡糖糖+5 μmol/L的FX作为治疗组(HG+FX).1.2.2 Western Blot实验将细胞种于60 mm培养皿中. 待细胞长至汇合状时进行无血清处理，于24 小时后进行相应的给药处理. 加药24 h后终止培养，使用预冷过的PBS洗涤细胞3次后(尽可能吸尽多余的PBS)，加入40 μL含PMSF的RIPA 细胞裂解液，用细胞刮刮下培养皿中的细胞后将其收集于1.5 mL的EP管，然后冰浴静置30 min，使蛋白充分溶出，接着将其置于提前预冷的离心机，于4℃，以12 000×g离心15 min. 取上清液于1.5 mL的EP管中，在采用BCA法测定各组蛋白含量后分装，然后经5%浓缩胶，12%分离胶SDS-PAGE 电泳，分离蛋白，每孔上样30 μg总蛋白. 经Bio-Rad电转仪将蛋白由凝胶转至NC膜上，转膜条件为：4℃，100V，90 min. TBST洗膜3次，每次10 min，5%脱脂牛奶封闭1 h，一抗于4℃慢摇孵育过夜. 次日以TBST洗膜3次，每次10 min，HRP二抗于室温慢摇孵育1小时，以TBST洗膜3次，每次10 min，加入ECL化学发光试剂，用X线胶片曝光，胶片经HP LaserJet Professional M1213nf MFP扫描后，用Image J软件进行灰度分析.1.2.3 活性氧水平检测于六孔板中将细胞培养至汇合状，在无血清同步化后进行相应处理(12h)，然后使用无酚红无血清培养液稀释活性氧探针DCHF-DA，并将其加入六孔板中，于37 ℃孵育20 min. 在不同分组处理后于培养箱内孵育1 h，孵育完成后使用无血清培养液冲洗3遍，以充分除去未结合的探针，最后，于荧光倒置显微镜中观察并拍照.1.2.4 免疫荧光将细胞种于盖玻片上，于相应处理24 h后使用PBS洗3遍，尽量除去残留PBS后，用4%多聚甲醛于室温将其固定20 min. PBS洗3遍后使用0.5% Triton-X于室温下破膜15 min. PBS洗涤后使用10% 山羊血清于室温封闭30 min，一抗于4℃ 孵育过夜. 次日洗去一抗，二抗于室温孵育1 h后，洗去，以100 nmol/L DPAI孵育15 min后封片，于荧光显微镜下观察并拍照.1.2.5 细胞骨架染色将细胞种于盖玻片上，待其长至半汇合后进行相应处理. 经固定、破膜后避光孵育罗丹明标记鬼笔环肽染料(PhDr1)30 min，待DAPI孵育核染后封片，于荧光倒置显微镜下观察并拍照.1.2.6 细胞内超氧化物歧化酶水平和脂质过氧化水平的测定使用WST-8法超氧化物歧化酶试剂盒检测细胞总SOD水平，使用硫代巴比妥酸法试剂盒检测MDA水平，操作流程依照试剂盒的相关说明书.2 实验结果2.1 FX能显著降低高糖刺激的GMCs中升高的FN和Col IV的蛋白含量肾小球硬化是DN的重要病理特征之一，而ECM在肾小球的过度积累又是致使肾小球硬化的最主要因素. 如图1所示，Western Blot 结果显示，高糖处理的系膜细胞中ECM的主要成分—FN和Col IV相比于正常糖组的FN和Col显著上升，而在5μmol/L FX处理的细胞中上述蛋白的表达显著降低；同时，免疫荧光的结果也显示，在经过FX处理的高糖培养下的肾小球系膜细胞中，FN的荧光强度明显减弱(图2)，这提示FX可以有效减少高糖刺激的肾小球系膜细胞中细胞外基质的主要成分—FN和ColIV的过度表达与积累.FX处理高糖培养的GMCs 24小时后，通过 Western Blot 检测FN和Col IV的蛋白表达. (**P < 0.01, vs. HG. ##P < 0.01 vs. NG)图1 FX对蛋白FN和ColIV 表达的影响FX处理高糖培养的GMCs 24小时后，通过免疫荧光检测FN的蛋白表达，绿色代表FN，蓝色代表细胞核图2 FX对FN荧光强度的影响(×400)2.2 FX缓解高糖诱导的GMCs的肥大在DN的发病进程中，肾小球硬化是一个重要病理特征，其表现为肾小球系膜细胞的肥大[12]. 如图3所示，在高糖刺激下，通过对细胞骨架中微丝结构的主要成分—纤维状肌动蛋白(F-actin)的染色，我们观察到，肾小球系膜细胞呈明显的肥大趋势，经FX处理后，系膜细胞面积有所减小，因此，我们认为FX缓解了系膜细胞的肥大.2.3 FX改善了高糖诱导的GMCs中ROS的增加高糖诱导产生的过量ROS被认为是在DN病情初期起到了重要的作用，消除过量活性氧被认为是一条可行的延缓DN病情策略[3]. 在高糖培养液的刺激下系膜细胞产生了大量的ROS，而在FX的处理中其减少了活性氧的产生(图4)，这提示我们：FX改善病变的作用可能与消除过量ROS有关；同时我们观察到，N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl cysteine, NAC) 作为活性氧的清除剂，其也能有效抑制高糖诱导的活性氧的增加.2.4 FX减轻了高糖诱导的GMCs中的氧化应激水平在糖尿病状态下，超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, SOD) 的酶活力的高低反应了机体清除氧自由基的能力，而脂质过氧化的终末产物丙二醛(Malondialdehyde, MDA) 的含量高低又反应了机体细胞受自由基攻击的严重程度. 如图5所示，在高糖下SOD的水平显著降低，而MDA水平显著上升. 在FX的处理中细胞中SOD的水平显著地升高了，细胞内清除自由基的能力也提高了，而细胞内的MDA水平显著地降低了，细胞所受到的来自自由基的伤害减少了.FX处理高糖培养的GMCs 12小时后，检测细胞内SOD的活性和MDA水平(*P<0.05, vs. HG. #P <0.05 vs. NG)图5 FX对细胞内SOD的活性和MDA水平的影响FX处理高糖培养的GMCs 24小时后，通过 Western Blot 检测 ICAM-1和TGF-β1的蛋白表达(**P<0.01, vs. HG.##P<0.01 vs. NG)图6 FX对蛋白ICAM-1和TGF-β1表达的影响2.5 FX减少了高糖诱导的GMCs中ICAM-1和TGF-β1的蛋白表达高糖诱导产生的炎症因子、细胞间黏附分子-1 (Intercellular cell adhesion molecule-1 ,ICAM-1) 和转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1) 被认为在肾纤维化的进程中起到重要的作用. 如图6所示，在高糖环境下ICAM-1和TGF-β1的蛋白表达明显升高，而FX的干预显著降低了上述炎症因子的表达，这提示我们：FX抗纤维化的作用可能与抑制炎症因子的表达有关.3 讨论糖尿病肾病是糖尿病最严重的微血管并发症之一，1型糖尿病患者大约在确诊后的5～10年内会出现DN的症状，而2型糖尿病患者可能在确诊时就已经患有DN了[6,13]. 肾小球硬化是DN的一个主要病理特征，其表现为肾小球系膜细胞肥大[12]和以FN和Col IV为主的ECM过度表达. ECM在肾小球内的积累会导致肾小球硬化，最终导致糖尿病患者的肾脏功能衰竭[14]. 本研究中，细胞骨架染色表明，FX能够明显改善高糖引起的肾小球系膜细胞肥大，Western Blot结果显示，高糖能够上调FN和ColIV的蛋白含量，而使用FX处理后，这种高糖诱导ECM主要成分过度表达的现象得到有效逆转，免疫荧光的结果同样显示，FX的处理能够减少高糖刺激下肾小球系膜细胞中FN的含量，减少FN在细胞中的分布，这表明FX可以有效缓解高糖刺激的肾小球系膜细胞的细胞外基质累积和细胞肥大，其对高糖刺激下的肾小球系膜细胞有保护效应. 尽管如此，FX对糖尿病肾病的改善效应仍需要在体内研究中进行进一步的验证.高血糖所诱导产生的ROS参与了多种导致糖尿病并发症的信号通路，诱导产生了多种生长因子，加重了发病进程[15]. ROS是一类氧衍生的具有较强化学反应的活性分子, 包括超氧阴离子、过氧化氢等，具有未配对电子的原子或原子团. 氧化应激是由于活性氧簇的量超过氧化剂清道夫的含量以及NADPH/NADP+的比例异常而产生. 在高血糖的环境下，葡萄糖激活肾脏细胞内的醛糖还原酶和多元醇通路，下调NADPH/NADP+ 的比例. 血糖水平增加会诱导产生新合成的二酰基甘油，而它可激活蛋白激酶C (PKC)，PKC又可以激活线粒体内的NADPH氧化酶，进而诱导氧化应激的增加，最终促进了肾小球系膜区的扩张和基底膜的增厚，导致了内皮细胞功能的紊乱[16]. 许多研究表明，在糖尿病状态下氧衍生的自由基含量增加，ROS的增加和抗氧化剂的减少会对细胞组分造成损害[17]. 在糖尿病状态下，SOD 活力的高低反映了机体清除氧自由基的能力，而脂质过氧化的终末产物——丙二醛MDA含量的高低又反映了机体细胞受自由基攻击的严重程度，因此，细胞中的SOD活力与MDA含量可以反映细胞抗氧应激的能力. 在本研究中，肾小球系膜细胞在高糖培养12h后其细胞内的ROS水平相较于NG组的ROS水平有明显的升高，同时SOD水平降低，而MDA升高，这表明高糖下细胞受到了大量伤害，这与之前的研究相符合[7]. 而在FX的处理中FX不仅降低了细胞中ROS的水平，而且还降低了MDA的水平，这说明FX可以消除高糖下肾小球系膜细胞中的氧化应激水平，减少细胞受到的损伤，这可能与其结构中大量不饱和键直接参与了活性氧的猝灭有关[18]. 值得注意是，细胞内SOD水平显著升高，这表明FX很可能激活了肾小球系膜细胞中与某些抗氧化相关的信号通路，进而发挥了消除氧化应激的作用[19-21]. 总之，FX可以上调高糖培养下肾小球系膜细胞中的抗氧化应激水平，这提示我们，FX之所以可以改善高糖刺激下系膜细胞的病理变化，这可能与其能清除过量活性氧和能维持细胞内氧化还原稳态有关.近年来，慢性炎症也被认为在糖尿病肾病的发生与发展中起到重要的作用[9]. TGF-β1是一种分布广泛的生长因子，其通过受体信号传递来发挥其生物学作用. 糖尿病的许多生理特征，如高血糖、增加的非酶糖基化蛋白、从头合成的二酰基甘油、蛋白激酶C以及细胞内增加的葡萄糖胺[12]，会激活肾脏中TGF-β1的活性，而TGF-β1已被证明参与了几乎所有DN的病理变化[22]，一旦被激活，TGF-β1系统会以多种协同方式增加ECM的积累. 一方面，TGF-β1可增加ECM的主要成分，包括FN、ColIV以及层连蛋白的表达[23]；另一方面，它能抑制基质降解相关酶的产生(如纤溶酶原激活物、胶原酶和弹性蛋白酶)并激活相关蛋白酶抑制剂(如基质金属蛋白酶组织抑制因子和纤溶酶原激活物抑制剂)[22]. TGF-β1还会上调整合素的表达并增加细胞与基质的相互作用[24]. 此外，TGF-β1还会影响肾脏细胞的周期，使其停滞在G1期(蛋白合成而DNA停止分裂)，最终导致细胞肥大[22]. ICAM-1是Ig超家族的细胞表面糖蛋白，它参与了将巨噬细胞招募至内皮细胞[25]的过程. 糖尿病状态同样会促进肾脏中ICAM-1的表达[26]，这会诱导所招募的巨噬细胞在肾脏中积累，造成肾脏损伤，并上调促进成纤维细胞增殖的因子，促进肾纤维化[27]. 在敲除ICAM-1的STZ诱导的糖尿病模型小鼠中，肾小球及肾小管间质中的巨噬细胞显著减少，同时蛋白尿、系膜基质沉积、肾小球肥大、细胞过多等现象得到明显改善[1,26]. 在本研究中，高糖刺激下的肾小球系膜细胞中的TGF-β1和ICAM-1蛋白含量有了显著的升高，这与我们课题组的既往研究结果一致[3,6,9]. 而FX能有效减少肾小球系膜细胞中这些炎症因子的蛋白含量，这提示我们：至少部分是由于FX减少了炎症因子在肾小球系膜细胞中的过度表达，这才减少了ECM在细胞中的过度积累.综上所述，在高糖培养的肾小球系膜细胞的模型中，FX可减少高糖诱导产生的过量ROS及异常表达的炎症因子，进而能改善肾小球系膜细胞的肥大，并减少ECM 主要成分FN和ColIV的过度表达. 我们的研究结果提示，褐藻素对糖尿病肾病具有一定的保护效应，有望将其开发为治疗糖尿病肾病的药物. 后续研究将集中探索在糖尿病状态下，褐藻素对肾脏抗炎抗氧化相关信号通路的影响，并同时开展体内研究，以便为抗DN的临床药物开发提供实验数据.【相关文献】[1]Wang L, Zhang L, Yu Y, et al. The protective effects of taurine against early renal injury in STZ-induced diabetic rats, correlated with inhibition of renal LOX-1-mediated ICAM-1 expression [J]. Ren Fail, 2008,30(8): 763-771.[2]Winiarska K, Szymanski K, Gorniak P, et al. Hypoglycaemic, antioxidative and nephroprotective effects of taurine in alloxan diabetic rabbits [J]. 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Advances in Clinical Medicine 临床医学进展, 2020, 10(12), 3275-3281Published Online December 2020 in Hans. /journal/acmhttps:///10.12677/acm.2020.1012490虫草素对大鼠肾小球系膜细胞自噬的调节作用毕凌云，冯明曌，张媛媛，司艳凤新乡医学院第一附属医院儿科，河南卫辉收稿日期：2020年11月27日；录用日期：2020年12月23日；发布日期：2020年12月30日摘要目的：本实验目的是研究虫草素(Cordycepin)对HBSS平衡盐溶液诱导的原代培养的大鼠肾小球系膜细胞(glomerular mesangial cells, GMCs)自噬的保护作用。

方法：大鼠GMCs分离后分别在含有细胞培养基、高糖溶液、HBSS溶液、HBSS溶液+ 虫草素培养基中培养，培养24 h、72 h后用Western blotting分析方法检测细胞自噬标记LC3 I、II和p62/SQSTM1。

结果：培养24 h，各组之间LC3和p62/SQSTM1表达没有显著差异，72 h后在高糖培养基中的细胞LC3-I、LC3-II、p62/SQSTM1下调，在含HBSS溶液培养基中的细胞LC3-I、LC3-II、p62/SQSTM1表达均上调，在含HBSS溶液+ 虫草素培养基中的细胞LC3-I、LC3-II、p62/SQSTM1则相反，表达均下降。

结论：虫草素可以抑制HBSS溶液诱导的肾小球系膜细胞的自噬作用。

关键词虫草素，自噬，肾小球系膜细胞，大鼠Regulatory Effect of Cordycepinon Autophagy in Rat GlomerularMesangial CellsLingyun Bi, Mingzhao Feng, Yuanyuan Zhang, Yanfeng SiPediatric Department, The First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University, Weihui HenanReceived: Nov. 27th, 2020; accepted: Dec. 23rd, 2020; published: Dec. 30th, 2020毕凌云 等Abstract Objective: The aim of this study was to investigate the effects of cordycepin on the impairment of autophagy induced by HBSS in primary cultured rat glomerular mesangial cells (GMCs). Methods: Rat GMCs were isolated and cultured in cell medium, cell medium + high-glucose, HBSS and HBSS + cordycepin medium. At 24 h and 72 h of culture, the cells were examined for expression levels of the autophagy markers LC3 I, II and p62/sequestosome-1 (SQSTM1) using western blotting analy-sis. Results: At 24 h, no significant difference in the expression of LC3 I, II and p62/SQSTM1 was observed among the groups; however, at 72 h the cells exposed to high-glucose medium showed down-regulated LC3 I, II and p62/SQSTM1 expression. The cells exposed to HBSS for 72 h showed up-regulated LC3 I, II and p62/SQSTM1 expression. These changes were reversed in the HBSS + cordycepin group at 72 h. Conclusions: In conclusion, Cordycepin can inhibit HBSS-induced auto-phagy in rat GMCs. KeywordsCordycepin, Autophagy, Glomerular Mesangial Cells, RatCopyright © 2020 by author(s) and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY 4.0). /licenses/by/4.0/1. 前言自噬是一种重要的细胞机制，在生理状态下，机体通过自噬清除老化的蛋白质，以此来维持细胞内环境的稳定，起着“内务处理”的作用；自噬的另一个重要作用则是清除细胞内的细胞器及异常蛋白。

细胞种类统计，培养基加抗生素细胞名称PK-15 猪肾细胞；形态特性上皮细胞样生长特性贴壁生长细胞数量100万-200万培养条件EMEM+10%Hyclone灭活血清特征特性PK-15细胞建系于1955（Stice,E）。

是PK-1a细胞的克隆系。

该细胞系可用于多种病毒的增值及特性研究。

另外，电镜观察发现，PK-15细胞内有C-型病毒颗粒存在，是研究C-型病毒的材料。

细胞培养常用几款抗生素比较１、最常用：青霉素、链霉素联合抑制细菌，即所谓的“双抗”，主要针对革兰氏阳性菌、阴性菌；对于细菌的感染也可用庆大或卡那霉素；２、如果真菌污染严重，可用两性霉素／制霉菌素控制；３、若为支原体污染，可用庆大霉素／四环素／红霉素；关于细胞培养抗生素使用的建议：由于细菌和酵母等的污染很容易观察到，及时清理污染细胞可大大减少支原体、病毒的污染机会。

潜在的支原体、病毒的感染会带来很大的危害。

这些微生物的存在会影响细胞的理化性质，从而使研究者得到错误的实验结果。

由于过滤技术的提高和超净台质量的改进，在规范细胞培养操作过程中引进污染的机会已经被大大减低。

所以，建议常规的的细胞培养中不要使用抗生素。

只有在培养污染源较多(如组织培养)或者非常珍贵的细胞株时才使用抗生素。

青霉素80万u+pbs 4ml,链霉素100万u+pbs 5ml,各自混匀后，再一起混匀，过滤分装在9个1ml EP管中，放在-20度，配1升培养基时加1ml,或者按这个比例临时加。

双抗就是青链霉素混合液，青链霉素混合液(100X) (Penicillin-Streptomycin Solution）双抗，是专门用于细胞培养的，可以直接添加到细胞培养液内。

青霉素-链霉素溶液(100X)中，青霉素的含量为10000U/ml，链霉素的含量为10mg/ml。

在细胞培养液中推荐的青霉素的工作浓度为100U/ml，链霉素的工作浓度为0.1mg/ml。

青链霉素的浓度最终应为100单位/ml。

一、实验背景肾脏是人体重要的排泄器官，负责维持体内水分、电解质和酸碱平衡。

肾细胞作为肾脏的基本功能单位，其结构和功能状态直接关系到肾脏的健康。

本实验旨在通过体外培养肾细胞，研究其生物学特性，为肾脏疾病的研究和治疗提供实验基础。

二、实验材料1. 实验动物：雄性SD大鼠，体重200-220g。

2. 试剂：DMEM培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素、胰蛋白酶、四甲基偶氮唑盐（MTT）等。

3. 仪器：细胞培养箱、显微镜、离心机、酶标仪等。

三、实验方法1. 肾细胞分离与培养（1）取大鼠肾脏，在无菌条件下剪除脂肪和血管，剪成小块。

（2）加入适量胰蛋白酶，37℃水浴消化30min，消化过程中不断振荡。

（3）终止消化，用吸管吹打细胞，制成细胞悬液。

（4）将细胞悬液离心（1000r/min，5min），弃上清液。

（5）加入DMEM培养基，调整细胞浓度至1×10^6个/mL。

（6）将细胞悬液接种于培养瓶中，置于细胞培养箱中培养。

2. 肾细胞形态观察（1）将培养至第3代的肾细胞用胰蛋白酶消化，制成细胞悬液。

（2）取适量细胞悬液，接种于载玻片上，置于显微镜下观察细胞形态。

3. 肾细胞功能检测（1）细胞增殖实验：采用MTT法检测肾细胞增殖能力。

（2）细胞凋亡实验：采用Annexin V-FITC/PI双重染色法检测肾细胞凋亡率。

四、实验结果1. 肾细胞形态观察在显微镜下观察到肾细胞呈多边形，细胞核较大，细胞质丰富，细胞排列整齐。

2. 细胞增殖实验MTT法检测结果显示，肾细胞在培养过程中呈现明显的增殖趋势，随着培养时间的延长，细胞数量逐渐增加。

3. 细胞凋亡实验Annexin V-FITC/PI双重染色法检测结果显示，肾细胞凋亡率较低，说明肾细胞具有较强的抗凋亡能力。

五、讨论与分析本实验成功分离和培养了肾细胞，观察到肾细胞具有典型的肾细胞形态。

细胞增殖实验表明，肾细胞具有较强的增殖能力。

细胞凋亡实验结果显示，肾细胞具有较强的抗凋亡能力。

胆汁酸膜受体 TGR5对高糖培养的大鼠肾小球系膜细胞 FN、TGF-β1的调控作用熊凤霄;杨志英;王少贵;陈诚;黄河清【摘要】目的：探究 G 蛋白偶联受体 TGR5在大鼠肾小球系膜细胞中的表达以及高糖条件下对纤维连接蛋白(fibronectin, FN)以及转化生长因子( transforming growth factor-β1,TGF-β1)蛋白水平的影响,探索其在糖尿病肾病中可能发挥的作用。

方法高糖(30 mmol·L -1 glucose,HG)条件下,用特异性激动剂 INT-777激活TGR5,或者对 TGR5进行过表达、干扰处理,通过 Western blot 来检测大鼠肾小球系膜细胞中TGR5的表达情况以及 FN、TGF-β1蛋白水平的变化。

结果在大鼠肾小球系膜细胞中存在 TGR5的表达；与对照组相比,激活 TGR5后,由高糖引起的FN、TGF-β1蛋白水平的上升受到抑制(P <0．01,P <0．05)；另一方面,干扰TGR5后, FN、TGF-β1的蛋白水平与对照组相比异常升高,差异有统计学意义(P <0．01,P <0．05)。

结论在大鼠肾小球系膜细胞中,TGR5可以抑制由高糖引起的FN、TGF-β1蛋白水平的升高,在糖尿病肾病的发生发展中可能发挥保护作用。

%Aim To investigate the expression of G protein-coupled receptor TGR5 and its effects on FN and TGF-β1 expression cultured under high glucose condition in rat glomerular mesangial cells , and then to explore the role of TGR5 in diabetic nephropathy. Methods INT-777 and TGR5 plasmid were used to activate TGR5 under high glucose(HG,30 mmol·L - 1 glucose ) condition, and anti-TGR5 small interfering RNA(TGR5 siRNA) was used to knock down TGR5. The protein expression of FN and TGF-β1 in rat me-sangial cells was detected by Western blot. Results TGR5 could be detected in rat glomerular mesangial cells. Both FN and TGF-β1 proteinlevels could be in-creased by high glucose compared with control group(P < 0. 05),and be inhibited by activiation of TGR5(P <0. 05). On the other hand,knockdown of TGR5 could increase FN and TGF-β1 protein to abnormal levels(P< 0. 01,P < 0. 05). Conclusion TGR5 suppresses HG-induced FN and TGF-β1 expression in rat glomer-ular mesangialcells,suggesting a protective role in the process of diabetic nephropathy.【期刊名称】《中国药理学通报》【年(卷),期】2016(000)001【总页数】5页(P33-36,37)【关键词】G 蛋白偶联受体;TGR5;高糖;肾小球系膜细胞;纤维连接蛋白;转化生长因子;INT - 777;糖尿病肾病【作者】熊凤霄;杨志英;王少贵;陈诚;黄河清【作者单位】中山大学药学院药理与毒理学实验室，广东广州 510006;中山大学药学院药理与毒理学实验室，广东广州 510006;中山大学药学院药理与毒理学实验室，广东广州 510006;中山大学药学院药理与毒理学实验室，广东广州510006;中山大学药学院药理与毒理学实验室，广东广州 510006【正文语种】中文【中图分类】R-332;R322.61;R341;R692.39;R977.6中国图书分类号: R-332; R322．61; R341; R692．39; R977. 6在大鼠肾小球系膜细胞中存在TGR5的表达;与对照组相比，激活TGR5后，由高糖引起的FN、TGF-β1蛋白水平的上升受到抑制( P＜0. 01，P＜0. 05) ;另一方面，干扰TGR5后，FN、TGF-β1的蛋白水平与对照组相比异常升高，差异有统计学意义( P＜0. 01，P＜0. 05)。