两种脲酶活性定性测定方法及比较

一、脲酶测定（比色法）脲酶是对尿素转化起关键作用的酶,它的酶促反应产物是可供植物利用的氮源，它的活性可以用来表示土壤供氮能力。

1、试剂配制：（1）pH6。

7柠檬酸盐溶液：取368g柠檬酸溶于600mL蒸馏水中，另取295g氢氧化钾溶于水，再将两种溶液合并，用1N氢氧化钠将pH调至6.7，并用水稀释至2L。

（2）苯酚钠溶液：称取62.5g苯酚溶于少量乙醇中，加2mL甲醇和18.5mL 丙酮，后用乙醇稀释至100mL（A液），保存再冰箱中。

称取27g氢氧化钠溶于100mL水中（B液）,保存于冰箱中.使用前,取A、B两液各20mL混和，并用蒸馏水稀释至100mL备用。

（3）次氯酸钠溶液：用水稀释制剂至活性氯的浓度为0.9％，（1。

9g次氯酸钠溶于1L水中）溶液稳定。

（4）10％尿素溶液：10g尿素溶于100mL水中。

（5）N的标准溶液：精确称取0。

4717g硫酸铵溶于水稀释至1L，则得1mL 含0。

1mgN的标液，再将此液稀释10倍制成氮工作液（0.01mg/mL）。

2、操作步骤称取5ｇ土置于50mL容量瓶中,加1mL甲苯处理，加塞塞紧轻摇15ｍｉｎ;往瓶中加入5mL10%尿素液和10mL的柠檬酸盐缓冲液(ｐＨ6.7），仔细混匀.在37℃恒温箱中培养24ｈ。

然后用热至38℃的蒸馏水稀释至刻度（甲苯应浮在刻度以上)，摇荡，将悬液过滤.取滤液1mL置于50mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至10mL，然后加入4mL苯酚钠溶液，并立即加入3mL次氯酸钠溶液,加入每一试剂后，立即将混合物摇匀,20ｍｉｎ后,将混合物稀释至刻度,在波长578ｎｍ处测定吸光值.脲酶活性以样品所得的吸光值减去对照样品吸光值之差,根据标准曲线求出氨态氮量。

标准曲线绘制：分别取0、1、3、5、7、9、11、13mL氮工作液置于50mL容量瓶中,加蒸馏水至20mL，再加4mL苯酚钠溶液和3mL次氯酸钠溶液,随加随摇匀，20min后显色,定容。

1h内再分光光度计上于578nm处比色。

大豆制品中脲酶活性的测定定性法：酚红法一、原理：酚红指示剂在pH 6.4-8.2时由黄变红，大豆制品中所含的尿素酶在pH=7.0，T=30℃时可将尿素水解产生氨，释放的氨可使酚红指示剂变红，根据变红的时间长短来判断脲酶活性的大小。

二、仪器和试剂：粉碎机：粉碎时不产生强烈发热；分析天平；25ml纳式比色管；恒温水浴锅；0.1%酚红指示剂：0.1g苯酚红溶于100ml 95%乙醇溶液；结晶尿素；三、方法：将试样粉碎，准确称取0.05±0.001g试样于25ml纳式比色管，加入0.2g结晶尿素及5滴酚红指示剂，加入25ml蒸馏水，摇动10s，立即置于30±0.5℃水浴锅中，开始计时，观察溶液颜色变化， 5min 后，取出比色管，摇匀，观察溶液颜色。

空白试验：不加尿素，其他同上。

品质判定：如果溶液为明显的粉红色，则认为该大豆制品脲酶活性超标，为不合格产品。

•0-1min变红，活性非常强（＞1.0）；•1-2min变红，活性大概0.5-1.0；•2-5min变红，活性大概0.3-0.5。

四、注意事项：1.粉碎样品时，不应产生大量热，否则会影响结果判定；2.称量样品时，一定要将样品混合均匀，否则会造成试验误差；3.试样和空白试验同时操作，过程要迅速，防止时间影响。

尿素-酚红法一、原理：酚红指示剂在pH 6.4-8.2时由黄变红，大豆制品中所含的尿素酶可将尿素水解产生氨，释放的氨可使酚红指示剂变红，根据变红样品占所有样品的比例来判断脲酶活性的大小。

二、仪器和试剂：表面皿；0.2N氢氧化钠溶液：称取0.8g氢氧化钠溶于100ml蒸馏水；1.0N硫酸溶液：移取7.0ml浓硫酸溶于500ml蒸馏水；尿素-酚红试剂：用500ml烧杯将0.8g酚红溶于20ml 0.2N氢氧化钠溶液，用蒸馏水稀释至约300ml，加入60g尿素，并溶解之，转移至2L容量瓶，冲洗烧杯数次,加蒸馏水至约1.5L，加入9.4ml 1.0N 硫酸溶液，用蒸馏水定容至2L；此时溶液应具有明亮的琥珀色；（过段时间溶液会变为深橘红色，可滴入稀硫酸溶液搅拌之，直至溶液再次变为琥珀色）三、方法：将一满匙样品放入表面皿中，摊平，将以调好的尿素-酚红试剂滴入表面皿中的样品上，直至完全浸湿，停留5min，观察样品的颜色反应。

脲酶的测定方法一、脲酶测定(比色法)脲酶是对尿素转化起关键作用的酶，它的酶促反应产物是可供植物利用的氮源，它的活性可以用来表示土壤供氮能力。

1、试剂配制：（1）pH6.7柠檬酸盐溶液：取368g柠檬酸溶于600mL蒸馏水中，另取295g 氢氧化钾溶于水，再将两种溶液合并，用1N氢氧化钠将pH调至6.7，并用水稀释至2L。

（2）苯酚钠溶液：称取62.5g苯酚溶于少量乙醇中，加2mL甲醇和18.5mL 丙酮，后用乙醇稀释至100mL（A液），保存再冰箱中。

称取27g氢氧化钠溶于100mL水中（B液），保存于冰箱中。

使用前，取A、B两液各20mL混和，并用蒸馏水稀释至100mL备用。

（3）次氯酸钠溶液：用水稀释制剂至活性氯的浓度为0.9％，（1.9g次氯酸钠溶于1L水中）溶液稳定。

（4）10％尿素溶液：10g尿素溶于100mL水中。

（5）N的标准溶液：精确称取0.4717g硫酸铵溶于水稀释至1L，则得1mL 含0.1mgN的标液，再将此液稀释10倍制成氮工作液（0.01mg/mL）。

2、操作步骤称取5ｇ土置于50mL容量瓶中,加1mL甲苯处理,加塞塞紧轻摇15ｍｉｎ;往瓶中加入5mL10%尿素液和10mL的柠檬酸盐缓冲液(ｐＨ6.7),仔细混匀。

在37℃恒温箱中培养24ｈ。

然后用热至38℃的蒸馏水稀释至刻度(甲苯应浮在刻度以上),摇荡,将悬液过滤。

取滤液1mL置于50mL容量瓶中,用蒸馏水稀释至10mL,然后加入4mL苯酚钠溶液,并立即加入3mL次氯酸钠溶液，加入每一试剂后,立即将混合物摇匀,20ｍｉｎ后,将混合物稀释至刻度,在波长578ｎｍ处测定吸光值。

脲酶活性以样品所得的吸光值减去对照样品吸光值之差,根据标准曲线求出氨态氮量。

标准曲线绘制：分别取0、1、3、5、7、9、11、13mL氮工作液置于50mL容量瓶中，加蒸馏水至20mL，再加4mL苯酚钠溶液和3mL次氯酸钠溶液，随加随摇匀，20min后显色，定容。

实验四 脲酶活力测定（纳氏试剂比色法）一、实验原理脲酶催化尿素水解成氨和二氧化碳，最适反应pH 7.0 。

反应式： (NH 2)2CO+ H 2O 脲酶2NH 3 + CO 2氨与纳氏试剂反应生成黄色配合物，其吸光度与氨浓度成正比，故可用以测定服酶的活力大小。

反应式：NH 3·H 2O ＋2K 2HgI 4 + 3KOH HgO ·HgNH 2I ＋7KI + 3H 20 （纳氏试剂） （碘化氨氧合汞） 二、实验步骤将待测酶液用磷酸盐缓冲液适当稀释后，按下述顺序操作：取3 支干净干燥试管，编号：1、空白；2、标准；3、样品。

按下表步骤加入实（7）从样品管加尿素开始计时，准确反应5min ，立即向样品管（3号管）加1 mol ·L -1H 2SO 4 1.00mL ，终止反应。

三、结果计算脲酶活力（U · mL -1) = ( A 3 - A 1 ）* 标准管中的NH 3微摩尔数 ( A 2 - A 1 ) * min * 酶样品毫升数 式中：n 为酶样品的稀释倍数 四、仪器和试剂1 、分光光度计、恒温水浴器、试管等。

2 、“有机溶剂沉淀法制备大豆脲酶”实验中制备的脲酶提取液和粗酶液，用磷酸盐缓冲液适当稀释。

3 、3 ％尿素底物溶液：3g 高纯尿素用磷酸盐缓冲液溶解，并定容至100mL 。

4 、磷酸盐缓冲液（pH7.0）：6.70 g Na2HPO4 ·2 H2O , 3.25 g KH2PO4 ，溶于蒸馏水并定容至100 mL 。

5 、1 mol·L -1 H2SO4溶液：56mL 浓硫酸，缓慢加入盛有约600 mL 蒸馏水的容量瓶中，冷却后加水定容至1000mL。

6 、硫酸铵标准溶液：称取在60°C干燥至恒重的分析纯硫酸铵1.322g，蒸馏水溶解，并定容至100mL 。

此溶液含NH3为40μmol·mL-1。

7 、纳氏试剂：分别溶解3 . 5g 氯化高汞（HgCl2）于20mL热蒸馏水，10g碘化钾于5 mL水中，再将前者慢慢倒入碘化钾溶液中，不断搅拌，直至出现微红色的少量沉淀为止。

不同方法测定大豆脲酶活性的比较研究杨奇慧舒璐钟剑锋摘要：用滴定法和增值法测定大豆粉在85℃和140℃下分别热处理0、45、90、135、180min的脲酶活性，并用0.2%KOH溶解法测定大豆粉在不同热处理下的蛋白质溶解度。

结果表明：在85℃条件下，处理0～180min 大豆粉的脲酶活性和蛋白质溶解度随着时间延长无明显变化；而在140℃条件下，大豆粉的脲酶活性和蛋白质溶解度随着处理时间的延长显著降低。

通过测定结果可见，同一样品用滴定法和增值法测得的脲酶活性在数值上不相等，不能互用，但蛋白质溶解度更能反映大豆粉受热过度的程度。

关键词：大豆粉；脲酶活性；蛋白质溶解度；pH增值法；滴定法众所周知，大豆含有较丰富的蛋白质、脂肪、碳水化合物等，是饲料生产中主要的植物蛋白质源之一，具有较高营养价值。

但是，大豆中含有多种抗营养因子，如蛋白酶抑制因子、植物凝集素、胃肠胀气因子、抗维生素因子、抗原蛋白等，这些抗营养因子阻碍营养物质在动物体内的利用，尤其是胰蛋白酶抑制因子的存在不仅会降低饲料营养成分的消化率和适口性，而且也会影响动物对蛋白质的消化吸收，对动物生长发育也产生不良的影响。

但是，胰蛋白酶抑制因子的测定较困难，而豆粕中脲酶活性与胰蛋白酶抑制因子活性呈正相关，所以通常通过测定脲酶活性来反映蛋白酶抑制因子的活性。

目前，脲酶活性的测定方法有滴定法（国标法）、pH增值法等，目前，对脲酶活性不同测定方法差异性的研究较少，本文拟对两种方法进行研究，以比较不同方法对测定结果的影响，为实际生产和理论研究提供依据和参考。

1 材料和方法1.1 实验材料大豆粉：将生大豆粉碎，过60目标准筛。

在85℃和140℃下分别处理0、45、90、135和180min冷却后装入封口袋保存备用。

1.2 化学试剂本实验所用试剂均为分析纯（AR），实验用水为蒸馏水。

1.3 测定方法1.3.1 pH增值法实验原理：将研细的试样与尿素缓冲液混合，尿素在尿素酶作用下水解产生氨，使溶液pH 值改变，改变的程度与脲酶活性大小相关，因此可以用其与空白溶液的差值表示脲酶活性高低，单位为△pH值。

随着膨化技术在饲料工业中推广普及，越来越多的饲料生产商在配方中使用膨化大豆粉，与其它蛋白资源一样，大豆的适度熟化非常重要，熟化程度低会含抗胰蛋白酶等营养抑制因子，熟化度过高又会导致氨基酸利用率低。

判断膨化大豆粉是否合格的主要指标是脲酶活性。

脲酶活性是指：在30±5℃和PH值等于7的条件下，每分钟每克膨化大豆分解尿素所释放的氨态氮的毫克数。

脲酶本身无营养意义，但它与抗胰蛋白酶的含量接近，并且遇热变性失活的程度与抗胰蛋白酶相似，因此，尿酶活性用来作为膨化大豆加热是否合适的间接估测指标。

脲酶活性没有负值，最低为0。

在我国现行的国标推荐值为0.3，在美国一般认为以不超过0.2为宜，并且针对日粮中有尿素的反刍动物而言不得超过0.12，当然对于家禽和猪0.3或稍高都可以接受。

国内很多大企业一般均采用0.2。

实验室定量测定脲酶活性的方法较复杂，有滴定法和pH增值法两种，已有研究表明两者对同一样品测得的数值也不相等。

目前国内绝大部分企业都采用快速而简单的简易判定方法定性地估测脲酶活性，一般来说，主要有如下两种方法。

一.液态法1.原理：大豆制品中的脲酶可使尿素分解成氨，会使酚红指示剂改变颜色。

2.试剂2.1尿素:GB696，分析纯。

2.2酚红指示剂2.2.1称取0.1g酚红，加1.43mL0.1mol/L氢氧化钠溶液，在研钵中研磨以促溶解；2.2.2转移至250mL定量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀备用。

3.操作方法3.1取0.2g粉末样品，置于25mL比色管中。

3.2加0.02g尿素，加酚红指示剂2滴，再加水20mL，充分摇匀15s。

3.3记录粉红色出现时间，并根据时间判断尿酶活性，颜色出现时间应少于15min。

颜色出现时间脲酶活性1min 极强1～5min 强5～15min 稍有15min 无同时作空白对照试验。

样品空白(不加尿素)及试剂空白(不加样品)，只有上述空白正常时，即酚红指示剂不改变颜色，试验结果才是可靠的。

脲酶测定方法（参考土壤脲酶活性两种测定方法的比较）比色法标准曲线：以尿素为基质，根据脲酶酶促产物氨在碱性介质中，与苯酚一次氯酸钠作用(在碱性溶液中及在亚硝基铁氰化钠催化剂存在下)生成蓝色的靛酚来分析脲酶活性[6]。

精确称取0．471 7 g硫酸铵溶于水并稀释至1 000mL，则得含氮0．1 mg／mL的标准液。

绘制标准曲线时可再将此液稀释10倍供用。

吸取稀释的标准液1、3、5、7、9、11、13 mL，移于50 mL容量瓶中，加蒸馏水至20 mL，再加4 mL 苯酚钠溶液和3 mL次氯酸钠溶液，随加随摇匀。

20 min后显色、定容。

1 h内在分光光度计上波长578 nm处比色。

以光密度值为纵坐标、以氨的浓度为横坐标绘制标准曲线。

步骤：取5 g风干土盛于50 mL三角瓶中，加入1 mL甲苯。

15 min 后加10 mL 10％尿素溶液和20 mL pH值6．7的柠檬酸盐缓冲液，摇匀，在37℃恒温箱中培养24 h。

过滤后取3 mL滤液注入50 mL容量瓶中，加蒸馏水至20 mL。

再加4 mL苯酚钠溶液和3 mL次氯酸钠溶液，随加随摇匀，20 min后显色、定容。

l h内在分光光度计上波长578 nm处比色。

脲酶活性：以24 h后1 g土壤中含NH3一N的毫克数表示。

NH3一N(mg)=2a (1)式中：a为从标准曲线查得的NH3一N毫克数；2为换算成1 g土的系数。

脱氢酶活性测定（1）TPF标准曲线的绘制（2）与干净的20mL据塞试管中，依次加入2mL0.5MTris-HCL缓冲液（pH=7.6）、2mL蒸馏水和2mL不同浓度的TTC标准溶液（2、4、8、12、16、20、24mg/mL），然后加入0.1g低亚硫酸钠（保险粉），振荡摇匀。

待充分显色后，加入5mL甲苯，振荡萃取TPF，上清液于485nm处测定吸光度值。

以TPF的浓度为横坐标，以OD485值为纵坐标绘制标准曲线。

（3）操作步骤称取5g土壤样品，置于干净具塞试管中，每支试管加入2mL1%的TTC溶液，2mL蒸馏水，充分混匀。