大豆中脲酶活性的测定

大豆制品中脲酶活性的测定定性法：酚红法一、原理：酚红指示剂在pH 6.4-8.2时由黄变红，大豆制品中所含的尿素酶在pH=7.0，T=30℃时可将尿素水解产生氨，释放的氨可使酚红指示剂变红，根据变红的时间长短来判断脲酶活性的大小。

二、仪器和试剂：粉碎机：粉碎时不产生强烈发热；分析天平；25ml纳式比色管；恒温水浴锅；0.1%酚红指示剂：0.1g苯酚红溶于100ml 95%乙醇溶液；结晶尿素；三、方法：将试样粉碎，准确称取0.05±0.001g试样于25ml纳式比色管，加入0.2g结晶尿素及5滴酚红指示剂，加入25ml蒸馏水，摇动10s，立即置于30±0.5℃水浴锅中，开始计时，观察溶液颜色变化， 5min 后，取出比色管，摇匀，观察溶液颜色。

空白试验：不加尿素，其他同上。

品质判定：如果溶液为明显的粉红色，则认为该大豆制品脲酶活性超标，为不合格产品。

•0-1min变红，活性非常强（＞1.0）；•1-2min变红，活性大概0.5-1.0；•2-5min变红，活性大概0.3-0.5。

四、注意事项：1.粉碎样品时，不应产生大量热，否则会影响结果判定；2.称量样品时，一定要将样品混合均匀，否则会造成试验误差；3.试样和空白试验同时操作，过程要迅速，防止时间影响。

尿素-酚红法一、原理：酚红指示剂在pH 6.4-8.2时由黄变红，大豆制品中所含的尿素酶可将尿素水解产生氨，释放的氨可使酚红指示剂变红，根据变红样品占所有样品的比例来判断脲酶活性的大小。

二、仪器和试剂：表面皿；0.2N氢氧化钠溶液：称取0.8g氢氧化钠溶于100ml蒸馏水；1.0N硫酸溶液：移取7.0ml浓硫酸溶于500ml蒸馏水；尿素-酚红试剂：用500ml烧杯将0.8g酚红溶于20ml 0.2N氢氧化钠溶液，用蒸馏水稀释至约300ml，加入60g尿素，并溶解之，转移至2L容量瓶，冲洗烧杯数次,加蒸馏水至约1.5L，加入9.4ml 1.0N 硫酸溶液，用蒸馏水定容至2L；此时溶液应具有明亮的琥珀色；（过段时间溶液会变为深橘红色，可滴入稀硫酸溶液搅拌之，直至溶液再次变为琥珀色）三、方法：将一满匙样品放入表面皿中，摊平，将以调好的尿素-酚红试剂滴入表面皿中的样品上，直至完全浸湿，停留5min，观察样品的颜色反应。

不同方法测定大豆脲酶活性的比较研究杨奇慧舒璐钟剑锋摘要：用滴定法和增值法测定大豆粉在85℃和140℃下分别热处理0、45、90、135、180min的脲酶活性，并用0.2%KOH溶解法测定大豆粉在不同热处理下的蛋白质溶解度。

结果表明：在85℃条件下，处理0～180min 大豆粉的脲酶活性和蛋白质溶解度随着时间延长无明显变化；而在140℃条件下，大豆粉的脲酶活性和蛋白质溶解度随着处理时间的延长显著降低。

通过测定结果可见，同一样品用滴定法和增值法测得的脲酶活性在数值上不相等，不能互用，但蛋白质溶解度更能反映大豆粉受热过度的程度。

关键词：大豆粉；脲酶活性；蛋白质溶解度；pH增值法；滴定法众所周知，大豆含有较丰富的蛋白质、脂肪、碳水化合物等，是饲料生产中主要的植物蛋白质源之一，具有较高营养价值。

但是，大豆中含有多种抗营养因子，如蛋白酶抑制因子、植物凝集素、胃肠胀气因子、抗维生素因子、抗原蛋白等，这些抗营养因子阻碍营养物质在动物体内的利用，尤其是胰蛋白酶抑制因子的存在不仅会降低饲料营养成分的消化率和适口性，而且也会影响动物对蛋白质的消化吸收，对动物生长发育也产生不良的影响。

但是，胰蛋白酶抑制因子的测定较困难，而豆粕中脲酶活性与胰蛋白酶抑制因子活性呈正相关，所以通常通过测定脲酶活性来反映蛋白酶抑制因子的活性。

目前，脲酶活性的测定方法有滴定法（国标法）、pH增值法等，目前，对脲酶活性不同测定方法差异性的研究较少，本文拟对两种方法进行研究，以比较不同方法对测定结果的影响，为实际生产和理论研究提供依据和参考。

1 材料和方法1.1 实验材料大豆粉：将生大豆粉碎，过60目标准筛。

在85℃和140℃下分别处理0、45、90、135和180min冷却后装入封口袋保存备用。

1.2 化学试剂本实验所用试剂均为分析纯（AR），实验用水为蒸馏水。

1.3 测定方法1.3.1 pH增值法实验原理：将研细的试样与尿素缓冲液混合，尿素在尿素酶作用下水解产生氨，使溶液pH 值改变，改变的程度与脲酶活性大小相关，因此可以用其与空白溶液的差值表示脲酶活性高低，单位为△pH值。

大豆制品中尿素酶活性的两种快速检测法饲料公司酚红法1原理酚红指示剂在pH6.4~8.2时由黄变红，大豆制品中所含的尿素酶，在室温下可将尿素水解产生氨。

释放的氨可使酚红指示剂变红，根据变红的时间长短来判断尿素酶活性的大小。

2仪器和试剂2.1粉碎装置粉碎时应不产生强烈发热（如研钵、球磨机）；2.2天平感量0.01 g；2.3 试管直径18 mm，150 mm；2.4尿素；2.5酚红试剂1g/L乙醇溶液。

3测定步骤将试样研细，称取0.02 g试样，称准至0.01 g，转入试管中。

加入0.02 g结晶尿素及2滴酚红指示剂，加20~30 mL蒸馏水，摇动10 s。

观察溶液颜色，并记下呈粉红色的时间。

4尿素酶活性的测定结果表示1 min内呈粉红色为：活性很强；1~5 min内呈粉红色为：活性强；5~15 min内呈粉红色为：有点活性；15~30 min内呈粉红色为：没有活性。

注：通常，10 min以上不显粉红色或红色的大豆制品，其尿素酶活性即认为合格。

饲料公司pH-增值法本法是美国、日本和前苏联等国常用方法。

尿素水解释放的氨是碱性的，可使溶液pH值升高。

试样反应30 min后，与空白溶液的pH之差数，可间接用来表示氨量的多少。

1. 仪器设备1.1 恒温水浴须能保持温度于30℃±0.5℃；1.2 酸度计（pH计）具有玻璃电极、甘汞电极、可测试5 mL 的溶液。

此为一种精密仪器，须装有温度补正器，其敏感度应为±0.02 pH单位或更佳。

仪器操作及pH值测定均应依照制造商的说明，该pH计应在测定前以标准缓冲液加以校正。

1.2试管20 mm×150 mm并配有橡皮塞。

2. 试剂2.1 取0.05 mol/L磷酸盐缓冲液溶解3.403 g磷酸二氢钾（KH2PO4）于约100 mL新蒸馏水中，溶解4.335 g磷酸氢二钾（K2HPO4）于约100 mL的蒸馏水中，然后将此两种溶液合并配成1000 mL。

大豆制品中尿素酶活性测定方法中华人民共和国专业标准蛋白酶活力测定法ZBX66030-87Measurementofproteinaseactivity本方法适用于酿造酱油时在制品菌种、成曲的蛋白酶活力测定。

1福林法试剂及溶液:以下试剂都为分析纯福林试剂(Folin试剂):于2000mL磨口回流装置内,加入钨酸钠(Na2WO4·2H2O)100g,钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)25g,蒸馏水700mL,85%磷酸50mL,浓盐酸100mL,文火回流10h。

取去冷凝器,加入硫酸锂(Li2SO4)50g,蒸馏水50mL,混匀,加入几滴液体溴,再煮沸15min,以驱逐残溴及除去颜色,溶液应呈黄色而非绿色。

若溶液仍有绿色,需要再加几滴溴液,再煮沸除去之。

冷却后,定容至1000mL,用细菌漏斗(No4～5)过滤,置于棕色瓶中保存。

此溶液使用时加2倍蒸馏水稀释。

即成已稀释的福林试剂。

碳酸钠溶液:称取无水碳酸钠(Na2CO3),定容至1000mL。

三氯乙酸(TCA)溶液:称取三氯乙酸(CCL3COOH),定容至1000mL。

磷酸盐缓冲液:称取磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O),定容至1000mL,即成溶液(A液)。

称取磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O),定容至1000mL,即成溶液(B液)。

取A液28mL和B液72mL,再用蒸馏水稀释1倍,即成的磷酸盐缓冲液。

2%酪蛋白溶液:准确称取干酪素2g,称准至,加入氢氧化钠10mL,在水浴中加热使溶解(必要时用小火加热煮沸),然后用磷酸盐缓冲液定容至100mL即成。

配制后应及时使用或放入冰箱内保存,否则极易繁殖细菌,引起变质。

100μg/mL酪氨酸溶液:精确称取在105℃烘箱中烘至恒重的酪氨酸,逐步加入6mL1N盐酸使溶解,用盐酸定容至100mL,其浓度为1000μg/mL,再吸取此液10mL,以盐酸定容至100mL,即配成100μg/mL的酪氨酸溶液。

1适用范围本标准适用于由大豆制得的产品和副产品中尿素酶活性的测定。

本法可确认大豆制品的湿热处理程度。

2参考标准GB8622 -883定义本标准所指尿素酶活性定义如下：在30±0.5℃和pH7的条件下，每分钟每克大豆制品分解尿素所释放的氨态氮的毫克数。

4原理将粉碎的大豆制品与中性尿素缓冲溶液混合，在30℃保持30 min，尿素酶催化尿素水解产生氨的反应。

用过量盐酸中和所产生的氨，再用氢氧化钠标准溶液回滴。

5仪器设备5.1样品筛：孔径200 μm；5.2酸度计：精度0.02 pH，附有磁力搅拌器和滴定装置；5.3恒温水浴：可控温30±0.5℃；5.4试管：直径18 mm，长150 mm，有磨口塞子；5.5精密计时器；5.6粉碎机：粉碎时应不生强热（例如球磨机）；5.7分析天平：感量0.1 mg；5.8移液管：10 mL。

6试剂和溶液6.1尿素（GB 696—77）：分析纯；6.2磷酸氢二钠（GB 1263—77）：分析纯；6.3磷酸二氢钾（GB 1274—77）：分析纯；6.4尿素缓冲溶液（pH6.9至7.0）：4.45 g磷酸氢二钠（5.2）和3.40 g磷酸二氢钾（5.3）溶于水并稀释至1000 mL，再将30 g尿素（5.1）溶在此缓冲溶液中，可保存1个月。

6.5盐酸（GB 622—77）：分析纯，c（HCl）＝0.1 mol/L溶液；6.6氢氧化钠（GB 629—77）：分析纯，c（NaOH）＝0.1 mol/L标准溶液，按GB 601标准溶液制备方法的规定配制。

7试样的制备用粉碎机（4.6）将10 g试样粉碎，使之全部通过样品筛（4.1）。

对特殊试样（水分或挥发物含量较高而无法粉碎的产品）应先在实验室温度下进行预干燥，再进行粉碎，当计算结果时应将干燥失重计算在内。

8测定步骤称取约0.2 g已粉碎的试样，称准至0.1 mg，转入试管（4.4）中（如活性很高只称0.05 g试样），移入 10 mL尿素缓冲溶液（5.4），立即盖好试管并剧烈摇动，马上置于30±0.5℃恒温水浴（4.3）中，准确计时保持30 min。

大豆中尿酶活性的测定原理
大豆中尿酶活性的测定原理基于尿酶催化尿素分解产生氨和二氧化碳的反应。

其测定步骤如下：
1.取适量大豆样品，加入磷酸盐缓冲液中，使其均匀混合。

2.分别加入尿素和尿酰酸，使其与大豆中的尿酶反应。

3.等待一定时间后，加入酚和氯化铁，使其产生褐色化合物，然后用紫外光谱仪测量其吸光度。

4.根据标准曲线计算大豆中尿酶的活性。

其中，尿酸的浓度会随着尿酶的活性增加而降低，而产生的氨和二氧化碳则随同反应中的尿酶一同释放出来。

通过相应的化学反应，可以将其转化为吸光度可测量的化合物，最终得到尿酶的活性值。

一、实验目的1. 了解大豆脲酶的提取方法和纯化过程；2. 探究大豆脲酶的活性变化；3. 分析大豆脲酶在不同条件下的稳定性。

二、实验方法1. 实验材料：大豆、蒸馏水、NaCl、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、pH缓冲液、脲、考马斯亮蓝G-250、酶活性测定试剂盒等。

2. 实验步骤：（1）大豆脲酶的提取：称取一定量的大豆，用蒸馏水浸泡过夜，研磨成匀浆，加入适量的磷酸氢二钠和磷酸二氢钠溶液，调节pH至7.0，离心取上清液，即为大豆脲酶粗提液。

（2）大豆脲酶的纯化：取大豆脲酶粗提液，依次用不同浓度的NaCl溶液进行盐析，收集沉淀，复溶于磷酸缓冲液，重复上述操作，直至达到所需纯度。

（3）大豆脲酶的活性测定：采用酶活性测定试剂盒，测定大豆脲酶在不同浓度脲溶液中的活性，以脲的消耗量作为酶活性的指标。

（4）大豆脲酶在不同条件下的稳定性研究：将纯化后的大豆脲酶置于不同pH、温度、离子强度条件下，观察酶活性的变化。

三、实验结果1. 大豆脲酶的提取与纯化：经过提取和纯化，得到纯度较高的大豆脲酶。

2. 大豆脲酶的活性变化：在脲浓度为0.1-1.0 mmol/L时，大豆脲酶活性随脲浓度增加而增强，当脲浓度超过1.0 mmol/L时，酶活性逐渐降低。

3. 大豆脲酶在不同条件下的稳定性：（1）pH稳定性：在pH 6.0-8.0范围内，大豆脲酶活性较高，当pH低于5.0或高于9.0时，酶活性显著降低。

（2）温度稳定性：在37℃时，大豆脲酶活性最高，随着温度升高，酶活性逐渐降低，当温度超过60℃时，酶活性基本消失。

（3）离子强度稳定性：在离子强度为0.1-1.0 mol/L范围内，大豆脲酶活性较高，当离子强度超过1.0 mol/L时，酶活性显著降低。

四、讨论1. 大豆脲酶提取与纯化过程中，采用盐析法可以有效去除杂质，提高酶的纯度。

2. 大豆脲酶活性受脲浓度、pH、温度和离子强度等因素的影响，本研究结果表明，大豆脲酶在适宜的条件下具有较高的活性。