PI染色检测细胞周期

细胞周期检测（PI法）一、实验方法原理细胞周期（cell cycle)：是指细胞从前一次分裂结束起到下一次分裂结束为止的活动过程，通常由G0/G1期、S期、G2期和M期组成。

G1期：细胞开始RNA和蛋白质的合成，但DNA含量仍保持二倍体。

S期：DNA开始合成，这时细胞核内DNA的含量介于G1期和G2期之间。

当DNA复制结束成为4倍体时，细胞进入G2期。

G2期的细胞继续合成RNA及蛋白质，直到进入M期。

因此，单纯从DNA含量无法区分G2期和M期。

一旦有丝分裂发生，细胞分裂成两个细胞，这两个细胞或者进入下一个细胞周期，或者进入静止期（G0期），而G0期从DNA含量上同样无法与G1期区分。

因此，整个复制周期可以描述为G0/G1、S、G2/M期。

通过核酸染料PI标记DNA,并由流式细胞仪进行分析，可以得到细胞各个时期的分布状态，计算出G0/G1%、S%、G2/M%，了解增殖能力，在肿瘤病理学研究中，通常以S期细胞比率作为判断肿瘤增殖状态的指标。

流式细胞仪的工作原理：是将待测细胞放入样品管中，在气体的压力下进入充满鞘液的流动室。

在鞘液的约束下细胞排成单列由流动室的喷嘴喷出，形成细胞柱。

通过对流动液体中排列成单列的细胞进行逐个检测，得到该细胞的光散射和荧光指标，分析出其DNA特征。

细胞周期检测的原理：PI法是较常见的一种周期检测方法。

PI 为插入性核酸荧光染料，能选择性的嵌入核酸DNA和RNA双链螺旋的碱基之间与之结合，其结合的量与DNA的含量成正比例关系，用流式细胞仪进行分析，就可以得到细胞周期各个阶段的DNA分布状态，从而计算出各个期的百分含量。

PI染色后，假设G0/G1期细胞的荧光强度为1，那么含有双份基因组DNA的G2/M期细胞的荧光强度的理论值为2，正在进行DNA复制的S期细胞的荧光强度为1-2之间。

细胞周期示意图如（图一）所示（图一）二、材料及准备工作1.材料准备试剂、耗材名称品牌货号细胞培养瓶corning6孔板corning10ml离心管国产1.5ml EP管国产胰酶（无EDTA）贝博试剂盒中包括RNase-A 贝博试剂盒中包括PI 贝博试剂盒中包括无水乙醇国产PBS 自配2. 试剂配制10XPBS液体配方（0.1MPBS pH 7.4）以1L量为例：NaCl 80gNa2HPO4·12H2O 32.3gNaH2PO4·2H2O 4.5g（十二水合磷酸氢二钠和二水合磷酸二氢钠）加双蒸水900mL 左右，用HCl/NaOH 调pH至7.4，最后定容为1000mL。

PI染色法检测细胞周期一．实验原理及试剂配置1.实验原理P I , 即碘化丙锭，可以与细胞内DNA 和RNA 结合，采用RNA酶将RNA 消化后, 通过流式细胞术检测到的与DNA 结合的P I 的荧光强度直接反映了细胞内DNA含量的多少。

由于细胞周期各时相的DNA 含量不同, 通常正常细胞的G 1/ G 0 期具有二倍体细胞的DNA 含量( 2N) ,而G 2/ M 期具有四倍体细胞的DNA 含量( 4N) ,而S 期的DNA含量介于二倍体和四倍体之间。

因此，通过流式细胞术P I染色法对细胞内DNA 含量进行检测时，可以将细胞周期各时相区分为G 1/ G 0 期，S 期和G 2/ M 期，并可通过特殊软件计算各时相的百分率。

值得注意的是，PI不能通过细胞膜完整的细胞(如活细胞和早期凋亡细胞) ,在标本制备时, 必须先用乙醇或其他破膜剂增强细胞膜的通透性, 才能使P I进入细胞内与细胞内的核酸结合。

乙醇通常为终浓度为70 %的冷乙醇。

2.试剂配制RNase A，注意分装保存，防止反复冻融。

PI 购自Sigma公司货号P-4170，通常用过滤除菌的PBS配置成500μg/ml的储液避光保存备用，细胞染色时用PBS稀释到50μg/ml。

二．实验步骤1.细胞的收集：将处理好的细胞样品组用含EDTA的0.25%胰酶消化细胞呈单细胞悬液，DMEM+10%FBS终止消化后，200g离心3min沉淀细胞。

2.细胞的固定：将离心收集的细胞用500μL预冷的PBS悬起，200g离心3min沉淀细胞，弃上清，以充分去除残留的FBS和胰酶；加入-20℃预冷的70%乙醇500μL悬浮细胞，于4℃固定30min或-20℃固定过夜。

（此处，加乙醇时应注意边加入变吹起细胞，放置固定时细胞结成团，难以吹散而影响后续的检测）3.RNA的去除：将固定好的细胞，200g离心5min沉淀细胞弃去上清液；500μL预冷的PBS悬浮细胞，200g离心3min沉淀细胞，弃去上清液；用500μL 100μg/ml的RNase A 在37℃下温育30min以充分降解细胞内RNA。

细胞周期：PI染色
荧光染料PI（碘化丙啶）是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂，常用于细胞凋亡检测，英文全称是PropidiumIodide。

它是一种溴化乙啶的类似物，在嵌入双链DNA后释放红色荧光。

尽管PI不能通过活细胞膜，但却能穿过破损的细胞膜而对核染色。

PI经常被用来与Calcein-AM或者FDA等荧光探针一起使用，能同时对活细胞和死细胞染色。

PI-DNA复合物的激发和发射波长分别为535nm 和615nm。

实验方法：
取生长期的XXX细胞，加入3mL PBS，去掉液体加入1mL胰蛋白酶消化1~5min。

加入5mL PBS制成细胞悬液，移至15mL离心管中1500rpm离心5min，去上清液。

加入500μL PBS轻轻吹打细胞团成细胞悬液，在旋涡状态下逐滴加入2 mL 20℃95%冷乙醇，混匀后固定30 min。

加入5mL PBS，1500 rpm离心5min，去上清液。

加入5mL PBS重悬细胞，1500rpm离心5min，去上清液。

加入800μL PI染液，用枪轻轻吹打细胞团，混匀，室温避光染色30min。

用流式细胞仪上机检测。

PI染色检测细胞周期实验步骤细胞周期是细胞分裂和增殖的过程，通常可以通过PI（propidium iodide）染色来检测。

PI是一种DNA结合染料，能够与DNA结合形成荧光化合物，通过检测荧光信号的强度可以推断细胞处于细胞周期的哪个阶段。

以下是PI染色检测细胞周期的实验步骤：材料和试剂：1.培养皿：可容纳细胞的培养皿。

2.培养基：细胞所需的培养基。

3. Propidium iodide（PI）：DNA结合染料。

4. RNase A：消化RNA的酶，可用于将RNA从细胞样品中降解。

5.细胞刮板：用于收集细胞。

6.离心管：用于离心细胞样品。

7.显微镜幻灯片：用于观察染色后的细胞。

步骤：1.准备培养皿：在培养皿中加入适量的培养基，使其能够完全覆盖细胞。

2.培养细胞：将需要检测细胞周期的细胞加入培养皿中，按照细胞的培养要求进行培养，培养至细胞密度适合进行实验。

3.收集细胞：用细胞刮板或其他方法，将细胞从培养皿中收集到离心管中。

4.细胞固定：将收集到的细胞进行固定，可以使用70%乙醇或其他细胞固定剂进行处理，固定时间通常为30分钟。

5.细胞孵育：将固定的细胞在4℃下孵育过夜，以保证细胞完全固定。

6. 细胞溶解：在离心管中加入RNase A（最终浓度一般为1mg/ml），以降解细胞中的RNA，避免对细胞周期分析结果的干扰。

7. 细胞染色：在离心管中加入适量的PI溶液（一般最终浓度为50μg/ml），将PI与DNA结合，产生荧光信号。

8.染色孵育：将含有PI的细胞溶液在4℃下孵育30分钟至1小时，使PI完全结合到DNA上。

9.细胞分析：将染色后的细胞用离心机离心，去除上清液，保留细胞沉淀。

10.流式细胞仪分析：将细胞沉淀重新悬浮在PBS缓冲液中，使用流式细胞仪进行细胞周期分析，记录和分析PI的荧光信号的强度。

11.显微镜观察：将细胞沉淀取出，在显微镜幻灯片上制备细胞悬液，并使用荧光显微镜观察细胞的DNA染色情况。

P I染色检测细胞周期实
验步骤
标准化工作室编码[XX968T-XX89628-XJ668-XT689N]
p r o t o c o l：P I染色检测细胞周期1、收集细胞：胰酶（含EDTA）消化收集对数生长期细胞（加热处理后损失多的组宜多收集细胞保证细胞有0.5-2×10*6个），吸取旧培养基到一个新离心管里；少量常温PBS（根据培养皿大小决定量，PBS洗可以保证消化效率）洗2次，清洗的PBS也要收集到上述离心管内【检测凋亡才需收集旧培养基及清洗的PBS】；然后胰酶消化（注意一定要消化完全，显微镜下观察细胞呈单个，而不是成片脱落）后利用旧培养基中和胰酶；离心(1000r/300g5min)收集细胞沉淀。

2、用预冷的PBS清洗细胞两次。

3、固定细胞：用0.5ml预冷的PBS重悬细胞沉淀，使细胞充分悬浮成单细胞，再将重悬细胞加入1.2ml预冷的99.7%无水乙醇(乙醇终浓度70%)，吹打混匀以免细胞团聚，4℃固定2H至过夜。

4、细胞染色：离心（1000r/300g5min）收集固定的细胞，以1.8mL 的PBS洗细胞一次，离心(第一次实验时用7000rpm才把细胞离心下来，但最后流式结果显示细胞没有碎)再次获取细胞沉淀后加入100μlRNaseA于37℃水浴30min，最后加入400μlPI避光染色30min （常温或4℃均可）
【有的试剂盒说明是：每个样本加入500uL染色剂（据样本数，用PBS临时配好总量，其中PI50ug/ml、RNaseA100ug/mL、TritonX-10 00.2%）4℃避光染色30分钟】
5、流式分析
以标准程序用检测，一般计数2-3万个细胞，结果用细胞周期拟和软件ModFit分析。

分析时，使用FL2-w和FL2-A显示，去除联体细胞。

流式细胞仪应用——利用PI检测细胞周期和细胞凋亡(Apoptosis) 本文主要讲述PI单染检测细胞周期和细胞凋亡(Apoptosis)PI（碘化丙啶）染色特点：一是能够与双链DNA/RNA螺旋的大沟部位结合，二是不能通过功能正常的完整细胞膜。

基于以上特性，目前主要有两大方面的应用，配方也不同：细胞周期和细胞凋亡(Apoptosis)一方面的应用是检测细胞周期，检测细胞周期时，为了保证所有的细胞都能染上PI，因此要将细胞用乙醇固定，并加入Triton X-100 ，以增加膜的通透性；同时由于DNA使细胞的粘附性增大，加入EDTA以降低细胞粘附性；为了消除RNA的干扰，要加RNAase。

由于要鉴定DNA含量，因此PI染料必须过饱和，所以PI终浓度很高，一般50ug/mL。

由于晚期凋亡细胞DNA断裂形成亚二倍体峰，因此可同时检测凋亡。

另一方面的应用是检测膜通透性（凋亡），由于PI不能进入完整的活细胞膜，因此一般认为PI染色阳性的细胞是死细胞。

Annexin V/PI 凋亡检测试剂盒中就是这种染液，它的作用是鉴定死细胞，从而与凋亡细胞区分开来。

它的配制就是将PI溶于PBS，终浓度较低，一般2.5ug/mL。

所需试剂：1、PI染液：用于检测细胞周期的PI配制如下：方法一：10×PI配制方法,用时用PBS稀释至工作液：5mg-----PI0.1ml---Triton X-1003.7mg--EDTA10ml----PBS2、RNaseA——2mg方法二,直接配制PI工作液：PI -----5mgRNaseA——2mg1.0%Trition X-100——0.25ml枸椽酸钠——100mg生理盐水——65ml调pH值至7.2-7.5加蒸馏水至100ml, 棕色瓶分装，保存在4℃操作步骤1.细胞培养铺细胞至6孔板或者35mm培养皿，约4－5*10e5 cells/well, 如果要加药物，在此时可以加以不同种或不同浓度的药物。

PI染色检测细胞周期实验步骤细胞周期是指细胞从一个开始时期，经过一系列的生长、分裂和分化过程后，再次回到原点开始的一个完整周期。

细胞周期是细胞生物学中一个重要的研究领域，对于理解细胞生物学的基本规律以及细胞增殖和分化过程具有重要意义。

其中，PI染色是一种常用来检测细胞周期的方法，下面将详细介绍PI染色检测细胞周期的实验步骤。

实验所需材料和仪器：1.细胞培养液2.细胞培养器具（细胞培养板、培养瓶等）3.离心机4. PI染色溶液（含有荧光染料Propidium Iodide的溶液）5.双色流式细胞仪6.PBS缓冲液实验步骤：1.细胞培养及处理a.选择需要研究的目标细胞，并进行适当的处理。

b.将目标细胞培养在合适的培养液中，并在37摄氏度、5%CO2的恒温培养箱中培养至所需的状态。

2.细胞收获和处理a.将细胞培养液转入培养细胞的容器中（如培养板、培养瓶等），通过离心机低速离心收集细胞。

b.将细胞沉淀在PBS缓冲液中，然后再次进行离心，去除上清液，并将细胞沉淀用PBS缓冲液进行重悬。

3.细胞固定a.用PBS缓冲液溶解适量的细胞固定剂（如乙醛或甲醛）制备1%细胞固定液。

b.向细胞悬液中加入1%细胞固定液并充分混合，使细胞固定。

4.细胞染色a.将固定的细胞用PBS缓冲液进行洗涤，去除细胞固定剂。

b.向细胞悬液中加入适量的PI染色溶液，并在暗处孵育30分钟。

5.流式细胞仪检测a.将染色后的细胞用PBS缓冲液进行洗涤，去除多余的染色剂。

b.将洗涤后的细胞悬液用PBS缓冲液进行重悬。

c.将细胞悬液转移到流式细胞仪的样品管中。

d.使用流式细胞仪进行细胞周期的检测，记录细胞的荧光强度和数量，得到细胞的周期分布。

6.数据分析a.使用流式细胞仪软件分析细胞周期的数据。

b.统计不同细胞周期阶段的细胞数量，并绘制相应的细胞周期分布图。

c.分析细胞周期分布的差异，并进一步探究细胞周期调控的机制。

需要注意的事项：1.在实验过程中，要保持实验环境的洁净和无菌，以避免细胞污染和结果失真。

细胞周期分析（PI染色）*以6孔板为例，每孔0.1-1X106细胞1.收集培养液; PBS洗一次并收集；胰酶消化后加入培养液，移液器吹打至单细胞悬液，收集细胞；置于冰上；(注意将培养液，PBS及消化后的细胞一并收集)2.低温4度300g离心5分钟；3.弃上清，加入2mL PBS重悬细胞，低温4度300g离心5分钟；4.弃上清，加入1mL PBS重悬细胞，移液器吹打均匀后，轻柔涡旋的同时缓慢加入3mL无水乙醇（预冷至-20度）；5.在4度或-20度至少固定2小时，过夜最好（>12小时）。

样品在这种情况下可保存数周；6.低温4度300g离心10分钟，弃去乙醇；7.用5mL PBS洗涤细胞，低温4度300g离心10分钟，弃去上清；8.加入0.5mL RNaseA 溶液（PBS，200ug/mL RNase A）重悬细胞；9.37度5-10分钟以去除RNA；10.加入0.5mL PI染色液（PBS，100ug/mL PI）；11.避光孵育，室温30分钟，或37度15分钟；12.过滤后置于冰上，避光，上机（BD FACScaliber）；13.设置机器，设置文件位于BD application/DNA quality control/FACScaliber inst settings；14.画FSC v SSC，FL2W v FL2A散点图，FL2A直方图；15.调节FL2电压，FL2A增益，使各族群很好地显示在FL2W v FL2A散点图上，FL2A直方图上第一个峰位于200道；16.在FL2W v FL2A散点图上，在FL2W较低的族群上画Region R1；17.为FSC v SSC设gate G1=R1；在FSC v SSC上画Region R2，以排除碎片；18.为FL2A直方图设gate G2=R2；19.收集数据，至少收集20000个细胞。

*若FSC v SSC散点图上并无明显细胞碎片，可省去15、16，直接为FL2A直方图设gate G1=R1。

细胞周期检测（PI法）一、实验方法原理细胞周期（cell cycle)：是指细胞从前一次分裂结束起到下一次分裂结束为止的活动过程，通常由G0/G1期、S期、G2期和M期组成。

G1期：细胞开始RNA和蛋白质的合成，但DNA含量仍保持二倍体。

S期：DNA开始合成，这时细胞核内DNA的含量介于G1期和G2期之间。

当DNA复制结束成为4倍体时，细胞进入G2期。

G2期的细胞继续合成RNA及蛋白质，直到进入M期。

因此，单纯从DNA含量无法区分G2期和M期。

一旦有丝分裂发生，细胞分裂成两个细胞，这两个细胞或者进入下一个细胞周期，或者进入静止期（G0期），而G0期从DNA含量上同样无法与G1期区分。

因此，整个复制周期可以描述为G0/G1、S、G2/M期。

通过核酸染料PI标记DNA,并由流式细胞仪进行分析，可以得到细胞各个时期的分布状态，计算出G0/G1%、S%、G2/M%，了解增殖能力，在肿瘤病理学研究中，通常以S期细胞比率作为判断肿瘤增殖状态的指标。

流式细胞仪的工作原理：是将待测细胞放入样品管中，在气体的压力下进入充满鞘液的流动室。

在鞘液的约束下细胞排成单列由流动室的喷嘴喷出，形成细胞柱。

通过对流动液体中排列成单列的细胞进行逐个检测，得到该细胞的光散射和荧光指标，分析出其DNA特征。

细胞周期检测的原理：PI法是较常见的一种周期检测方法。

PI 为插入性核酸荧光染料，能选择性的嵌入核酸DNA和RNA双链螺旋的碱基之间与之结合，其结合的量与DNA的含量成正比例关系，用流式细胞仪进行分析，就可以得到细胞周期各个阶段的DNA分布状态，从而计算出各个期的百分含量。

PI染色后，假设G0/G1期细胞的荧光强度为1，那么含有双份基因组DNA的G2/M期细胞的荧光强度的理论值为2，正在进行DNA复制的S期细胞的荧光强度为1-2之间。

细胞周期示意图如（图一）所示（图一）二、材料及准备工作1.材料准备试剂、耗材名称品牌货号细胞培养瓶corning6孔板corning10ml离心管国产1.5ml EP管国产胰酶（无EDTA）贝博试剂盒中包括RNase-A 贝博试剂盒中包括PI 贝博试剂盒中包括无水乙醇国产PBS 自配2. 试剂配制10XPBS液体配方（0.1MPBS pH 7.4）以1L量为例：NaCl 80gNa2HPO4·12H2O 32.3gNaH2PO4·2H2O 4.5g（十二水合磷酸氢二钠和二水合磷酸二氢钠）加双蒸水900mL 左右，用HCl/NaOH 调pH至7.4，最后定容为1000mL。