PI染色检测细胞周期实验步骤

1.PI染液的配制;(工作液0.05mg/ml)
7ml（PI工作液0.05mg/ml）：
10% 柠檬酸钠70ul
10% NP40 70ul
10mg/ml RNaseA 70ul
10mg/ml PI（Propidium Iodide water 配制）35ul
Water 6755ul
实验步骤：（成功步骤）
1.去上清，PBS洗，消化细胞（胰酶+EDTA）后，加入1.5尖底的EP管中。

2000rpm 离
心10min，用枪头弃上清，不要吸干，留一点液体。

2.PBS洗1次2000rpm离心10min ，用枪头弃上清，留下大约80ul（注意：细胞消化后
不可吹打过度，减少细胞破碎；以后的吹打也要注意，尤其是固定后的细胞容易破碎）；
3.70%乙醇（用PBS配）（预冷-20度）1ml加入EP管中，固定（用20微的枪把细胞一点一点加到70%的酒精里，刚加进去就立刻用枪使劲吹打，这样不会成团，肉眼可以看到）
4. 4℃固定过夜固定12h
5. 2000rpm 10min离心收集沉淀，用枪头弃上清，不要吸干，留一点液体。

6. PBS洗1次用枪头弃上清，不要吸干，留一点液体。

2000rpm 10min离心。

7.500ul (如果细胞很少，就300ul) PI染液（工作液）37度or RT or 4度避光染30min
8. 用300目筛网过滤细胞悬液，将液体移入流式分析专用管中。

9. 用流式细胞仪分析细胞周期。

技师为了减少对流式细胞仪的损伤，就会选择高速流（一般的检测用低速流，误差小），检测的质量就会大大下降，数据的说服力就下降了！。

流式细胞术检测细胞周期
流式细胞术检测细胞周期（PI染色）操作步骤
1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm , 5min，弃上清液。

2、加入PBS 1ml离心洗涤1次，弃上清。

3、加入2ml预冷的70%酒精，4℃固定30min，或是-20℃固定过夜。

4、离心，弃上清液。

5、用1×PBS 1ml洗涤1次，离心。

6、加入RNase A (工作浓度20ug/ml)于500ul 1×PBS中，37℃孵育30min，离心。

7、用1×PBS 1ml洗涤1次，离心。

8、加入PI(工作浓度50ug/ml) 于500ul 1×PBS中，室温避光孵育30min。

9、混匀，过300目筛网，置流式管中，4℃冰箱保存，待测。

10、用流式细胞仪检测细胞周期
11、用Flowjo软件分析流式细胞仪检测数据，并导出细胞周期分析结果
备注：
1、RNase A：贮液浓度：1mg/ml ；
工作液配制：加1 mg/ml贮液10ul于500ul 1×PBS中，使终浓度为20ug/ml。

2、PI：贮液浓度：2.5mg/ml；
工作液配制：加2.5 mg/ml贮液10ul于500ul 1×PBS中，使终浓度为50ug/ml。

4、检测样品细胞浓度1x106 /ml。

流式检测细胞周期（PI染色法）准备：1.75%乙醇，由无水乙醇（分析纯）+DDW配制，实验前一天放入4度冰箱预冷保存2.外用PBS（置于4度保存），细胞室PBS3．流式管在公共平台流式机器处领取4．PI粉末用PBS配制成5mg/ml的储存浓度，RNaseA作用终浓度为20ug/ul. PI位于负二十冰箱第一层保存。

步骤：（以LN229 对照组为例）第一天：1．取生长状态良好，细胞活力佳的LN229细胞，6cm dish 中细胞密度约90~95%。

此时细胞密度约在106个/ml.2．用胰酶进行常规细胞消化（注意不要过度），用含血清的培养液终止（尽量将贴壁的细胞吹落下来，动作要轻柔）。

将细胞悬液（15ml离心管中）进行1000rmp离心5分钟.3．用移液器将上层培养液吸取干净，弃去。

加入约7ml的PBS重悬细胞沉淀，制成单细胞悬液，再次1000rmp,离心5min.4．取出离心管，于外部试验台上用移液器将上层PBS吸取干净，弃去。

再加入50ulPBS，重悬细胞，注意动作轻柔。

重悬要充分，整体呈不透明的浑浊状。

5．先取100ul预冷的75%乙醇沿着管壁缓慢加入（可绕着管壁螺旋加液），重复上述，一共三次，共加入300ul。

期间用移液器进行混匀，防止细胞聚集抱团。

再取700ul的预冷75%乙醇，加入上述约350ul的细胞悬液中，轻轻吹匀。

6．置于试管架上，4度冰箱过夜第二天：7．将4度过夜的细胞沉淀进行再重悬转入1.5ml的EP管中，进行离心：800转/分，5-10min，转速不能太高（用台式低速离心机也可以,约30s）。

弃去乙醇8．加PBS至1ml，将细胞沉淀重悬，再次离心800转/分，5-10min，（用台式低速离心机也可以，约30s）弃去上清，吸干净。

再加入PBS 300ul重悬细胞沉淀。

9加入RNaseA（终作用浓度20μg/ml）0.6ul，用手将沉淀弹匀，37度下作用30min10．向300ul细胞悬液中，加入PI（1mg/ml）10ul左右，用手将沉淀弹匀，使得细胞悬液整体呈粉红色。

p r o t o c o l：P I染色检测细胞周期1、收集细胞：胰酶含EDTA消化收集对数生长期细胞加热处理后损失多的组宜多收集细胞保证细胞有0.5-2×106个,吸取旧培养基到一个新离心管里；少量常温PBS根据培养皿大小决定量,PBS洗可以保证消化效率洗2次,清洗的PBS也要收集到上述离心管内检测凋亡才需收集旧培养基及清洗的PBS；然后胰酶消化注意一定要消化完全,显微镜下观察细胞呈单个,而不是成片脱落后利用旧培养基中和胰酶；离心1000r/300g5min收集细胞沉淀;
2、用预冷的PBS清洗细胞两次;
3、固定细胞：用0.5ml预冷的PBS重悬细胞沉淀,使细胞充分悬浮成单细胞,再将重悬细胞加入1.2ml预冷的99.7%无水乙醇乙醇终浓度7 0%,吹打混匀以免细胞团聚,4℃固定2H至过夜;
4、细胞染色：离心1000r/300g5min收集固定的细胞,以1.8mL的PB S洗细胞一次,离心第一次实验时用7000rpm才把细胞离心下来,但最后流式结果显示细胞没有碎再次获取细胞沉淀后加入100μlRNaseA 于37℃水浴30min,最后加入400μlPI避光染色30min常温或4℃均可
有的试剂盒说明是：每个样本加入500uL染色剂据样本数,用PBS临时配好总量,其中PI50ug/ml、RNaseA100ug/mL、TritonX-1000.2%4℃避光染色30分钟
5、流式分析
以标准程序用检测,一般计数2-3万个细胞,结果用细胞周期拟和软件ModFit分析;分析时,使用FL2-w和FL2-A显示,去除联体细胞;。

细胞周期：PI染色
荧光染料PI（碘化丙啶）是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂，常用于细胞凋亡检测，英文全称是PropidiumIodide。

它是一种溴化乙啶的类似物，在嵌入双链DNA后释放红色荧光。

尽管PI不能通过活细胞膜，但却能穿过破损的细胞膜而对核染色。

PI经常被用来与Calcein-AM或者FDA等荧光探针一起使用，能同时对活细胞和死细胞染色。

PI-DNA复合物的激发和发射波长分别为535nm 和615nm。

实验方法：
取生长期的XXX细胞，加入3mL PBS，去掉液体加入1mL胰蛋白酶消化1~5min。

加入5mL PBS制成细胞悬液，移至15mL离心管中1500rpm离心5min，去上清液。

加入500μL PBS轻轻吹打细胞团成细胞悬液，在旋涡状态下逐滴加入2 mL 20℃95%冷乙醇，混匀后固定30 min。

加入5mL PBS，1500 rpm离心5min，去上清液。

加入5mL PBS重悬细胞，1500rpm离心5min，去上清液。

加入800μL PI染液，用枪轻轻吹打细胞团，混匀，室温避光染色30min。

用流式细胞仪上机检测。

PI染色检测细胞周期实验步骤细胞周期是细胞分裂和增殖的过程，通常可以通过PI（propidium iodide）染色来检测。

PI是一种DNA结合染料，能够与DNA结合形成荧光化合物，通过检测荧光信号的强度可以推断细胞处于细胞周期的哪个阶段。

以下是PI染色检测细胞周期的实验步骤：材料和试剂：1.培养皿：可容纳细胞的培养皿。

2.培养基：细胞所需的培养基。

3. Propidium iodide（PI）：DNA结合染料。

4. RNase A：消化RNA的酶，可用于将RNA从细胞样品中降解。

5.细胞刮板：用于收集细胞。

6.离心管：用于离心细胞样品。

7.显微镜幻灯片：用于观察染色后的细胞。

步骤：1.准备培养皿：在培养皿中加入适量的培养基，使其能够完全覆盖细胞。

2.培养细胞：将需要检测细胞周期的细胞加入培养皿中，按照细胞的培养要求进行培养，培养至细胞密度适合进行实验。

3.收集细胞：用细胞刮板或其他方法，将细胞从培养皿中收集到离心管中。

4.细胞固定：将收集到的细胞进行固定，可以使用70%乙醇或其他细胞固定剂进行处理，固定时间通常为30分钟。

5.细胞孵育：将固定的细胞在4℃下孵育过夜，以保证细胞完全固定。

6. 细胞溶解：在离心管中加入RNase A（最终浓度一般为1mg/ml），以降解细胞中的RNA，避免对细胞周期分析结果的干扰。

7. 细胞染色：在离心管中加入适量的PI溶液（一般最终浓度为50μg/ml），将PI与DNA结合，产生荧光信号。

8.染色孵育：将含有PI的细胞溶液在4℃下孵育30分钟至1小时，使PI完全结合到DNA上。

9.细胞分析：将染色后的细胞用离心机离心，去除上清液，保留细胞沉淀。

10.流式细胞仪分析：将细胞沉淀重新悬浮在PBS缓冲液中，使用流式细胞仪进行细胞周期分析，记录和分析PI的荧光信号的强度。

11.显微镜观察：将细胞沉淀取出，在显微镜幻灯片上制备细胞悬液，并使用荧光显微镜观察细胞的DNA染色情况。

PI染色法检测细胞周期一．实验原理及试剂配置1.实验原理P I , 即碘化丙锭，可以与细胞内DNA 和RNA 结合，采用RNA酶将RNA 消化后, 通过流式细胞术检测到的与DNA 结合的P I 的荧光强度直接反映了细胞内DNA含量的多少。

由于细胞周期各时相的DNA 含量不同, 通常正常细胞的G 1/ G 0 期具有二倍体细胞的DNA 含量( 2N) ,而G 2/ M 期具有四倍体细胞的DNA 含量( 4N) ,而S 期的DNA含量介于二倍体和四倍体之间。

因此，通过流式细胞术P I染色法对细胞内DNA 含量进行检测时，可以将细胞周期各时相区分为G 1/ G 0 期，S 期和G 2/ M 期，并可通过特殊软件计算各时相的百分率。

值得注意的是，PI不能通过细胞膜完整的细胞(如活细胞和早期凋亡细胞) ,在标本制备时, 必须先用乙醇或其他破膜剂增强细胞膜的通透性, 才能使P I进入细胞内与细胞内的核酸结合。

乙醇通常为终浓度为70 %的冷乙醇。

2.试剂配制RNase A，注意分装保存，防止反复冻融。

PI 购自Sigma公司货号P-4170，通常用过滤除菌的PBS配置成500μg/ml的储液避光保存备用，细胞染色时用PBS稀释到50μg/ml。

二．实验步骤1.细胞的收集：将处理好的细胞样品组用含EDTA的0.25%胰酶消化细胞呈单细胞悬液，DMEM+10%FBS终止消化后，200g离心3min沉淀细胞。

2.细胞的固定：将离心收集的细胞用500μL预冷的PBS悬起，200g离心3min沉淀细胞，弃上清，以充分去除残留的FBS和胰酶；加入-20℃预冷的70%乙醇500μL悬浮细胞，于4℃固定30min或-20℃固定过夜。

（此处，加乙醇时应注意边加入变吹起细胞，放置固定时细胞结成团，难以吹散而影响后续的检测）3.RNA的去除：将固定好的细胞，200g离心5min沉淀细胞弃去上清液；500μL预冷的PBS悬浮细胞，200g离心3min沉淀细胞，弃去上清液；用500μL 100μg/ml的RNase A 在37℃下温育30min以充分降解细胞内RNA。

PI染色检测细胞周期实验步骤细胞周期是指细胞从一个开始时期，经过一系列的生长、分裂和分化过程后，再次回到原点开始的一个完整周期。

细胞周期是细胞生物学中一个重要的研究领域，对于理解细胞生物学的基本规律以及细胞增殖和分化过程具有重要意义。

其中，PI染色是一种常用来检测细胞周期的方法，下面将详细介绍PI染色检测细胞周期的实验步骤。

实验所需材料和仪器：1.细胞培养液2.细胞培养器具（细胞培养板、培养瓶等）3.离心机4. PI染色溶液（含有荧光染料Propidium Iodide的溶液）5.双色流式细胞仪6.PBS缓冲液实验步骤：1.细胞培养及处理a.选择需要研究的目标细胞，并进行适当的处理。

b.将目标细胞培养在合适的培养液中，并在37摄氏度、5%CO2的恒温培养箱中培养至所需的状态。

2.细胞收获和处理a.将细胞培养液转入培养细胞的容器中（如培养板、培养瓶等），通过离心机低速离心收集细胞。

b.将细胞沉淀在PBS缓冲液中，然后再次进行离心，去除上清液，并将细胞沉淀用PBS缓冲液进行重悬。

3.细胞固定a.用PBS缓冲液溶解适量的细胞固定剂（如乙醛或甲醛）制备1%细胞固定液。

b.向细胞悬液中加入1%细胞固定液并充分混合，使细胞固定。

4.细胞染色a.将固定的细胞用PBS缓冲液进行洗涤，去除细胞固定剂。

b.向细胞悬液中加入适量的PI染色溶液，并在暗处孵育30分钟。

5.流式细胞仪检测a.将染色后的细胞用PBS缓冲液进行洗涤，去除多余的染色剂。

b.将洗涤后的细胞悬液用PBS缓冲液进行重悬。

c.将细胞悬液转移到流式细胞仪的样品管中。

d.使用流式细胞仪进行细胞周期的检测，记录细胞的荧光强度和数量，得到细胞的周期分布。

6.数据分析a.使用流式细胞仪软件分析细胞周期的数据。

b.统计不同细胞周期阶段的细胞数量，并绘制相应的细胞周期分布图。

c.分析细胞周期分布的差异，并进一步探究细胞周期调控的机制。

需要注意的事项：1.在实验过程中，要保持实验环境的洁净和无菌，以避免细胞污染和结果失真。

组织中的细胞周期和凋亡检测方法之一－－PI法schoman无论是肿瘤或其它正常新鲜组织均可用PI（碘化丙啶）的方法来检测，这是一种常见而且便宜的方法。

主要操作步骤如下：1、组织块用0.25%胰酶消化30min－1h。

2、200－400目筛网过滤细胞，获得单细胞悬液。

3、75％乙醇（－20度预冷）固定细胞1h。

4、加入PI（终浓度50ug／ml）和无DNA酶污染的RNA酶（终浓度50ug／ml）1ml染色30min－1h。

5、流式细胞仪检测细胞周期和凋亡。

注意事项：1、组织消化后使细胞形成单个细胞悬液是本检测方法的关键。

如组织难以消化，可加入适量胶原酶。

另外，消化前，用剪刀将组织剪成小块也不要忘了。

2、细胞可尽量的多准备（at least 100 thousand），这样流式检测方便，结果可靠。

3、每次消化的时间等条件应尽量一致，否则使实验结果CV值偏大。

4、细胞用乙醇固定后可以访置48小时（4度保存）后检测，便于无法立即检测的实验者，对实验结果基本没有影响。

其它也有一些检测凋亡的方法，均有商品化试剂盒。

在此不赘述。

yanzishenyang：我看相关的说明：碘化丙啶（propidium iodide,PI）检测早期死亡细胞膜通透性状态的不同是区分细胞凋亡和坏死的一个重要指标，凋亡细胞在进入最终溶解阶段前，胞膜通透性无明显改变，相对分子质量大的与DNA 结合的荧光染料（如PI）不能时入凋亡细胞内，而相对分子质量小的荧光染料（如Hoechest 3342或33258等）仍能被细胞摄取。

应用流式细胞仪或荧光显微镜可区分和坏死细胞，细胞内DNA出现Hoechest 3342标记而不出现PI标记的为凋亡细胞。

偶得细胞是用PI染色的，经过流氏细胞仪检测出现一个亚二倍体峰，是否能和坏死区别？因为偶用的作用细胞的蛋白本身可以造成细胞膜的损伤，所以PI可以进入细胞，这是否意味着我检测的结果无法区分凋亡和坏死？hdhdhd0000：用PI法识别凋亡时，有一种方法叫SUB-G1法，这种方法需要在染PI前加入适量的破膜剂（磷酸盐－枸橼酸盐缓冲盐），我们称之为PC液，它会让晚期凋亡所形成的DNA小碎片部分出膜而使胞内的DNA总含量减少，从而使流式上的DNA直方图的G0/G1峰前出现一个亚二倍体峰，也就是SUB－G1峰（凋亡峰）！用荧光2的面积做直方图可以清楚的看见凋亡峰，但是要区分APo和Nec需要少量的经验，而在荧光2高度图上，因为是用的是对数，所以可以把凋亡和坏死拉开，凋亡峰在不同的细胞周期特异性细胞凋亡时，都特异性的出现在10的2次方荧光道数处，坏死在10的1次方处，从而可以清楚的分清它们。

细胞周期分析（PI染色）*以6孔板为例，每孔0.1-1X106细胞1.收集培养液; PBS洗一次并收集；胰酶消化后加入培养液，移液器吹打至单细胞悬液，收集细胞；置于冰上；(注意将培养液，PBS及消化后的细胞一并收集)2.低温4度300g离心5分钟；3.弃上清，加入2mL PBS重悬细胞，低温4度300g离心5分钟；4.弃上清，加入1mL PBS重悬细胞，移液器吹打均匀后，轻柔涡旋的同时缓慢加入3mL无水乙醇（预冷至-20度）；5.在4度或-20度至少固定2小时，过夜最好（>12小时）。

样品在这种情况下可保存数周；6.低温4度300g离心10分钟，弃去乙醇；7.用5mL PBS洗涤细胞，低温4度300g离心10分钟，弃去上清；8.加入0.5mL RNaseA 溶液（PBS，200ug/mL RNase A）重悬细胞；9.37度5-10分钟以去除RNA；10.加入0.5mL PI染色液（PBS，100ug/mL PI）；11.避光孵育，室温30分钟，或37度15分钟；12.过滤后置于冰上，避光，上机（BD FACScaliber）；13.设置机器，设置文件位于BD application/DNA quality control/FACScaliber inst settings；14.画FSC v SSC，FL2W v FL2A散点图，FL2A直方图；15.调节FL2电压，FL2A增益，使各族群很好地显示在FL2W v FL2A散点图上，FL2A直方图上第一个峰位于200道；16.在FL2W v FL2A散点图上，在FL2W较低的族群上画Region R1；17.为FSC v SSC设gate G1=R1；在FSC v SSC上画Region R2，以排除碎片；18.为FL2A直方图设gate G2=R2；19.收集数据，至少收集20000个细胞。

*若FSC v SSC散点图上并无明显细胞碎片，可省去15、16，直接为FL2A直方图设gate G1=R1。

PI标记法检测细胞周期1.实验原理：PI染料即碘化丙啶，是流式检测细胞周期应荣最为广泛的荧光染料。

PI能与细胞内的双链DNA和RNA结合，被488nm激光激发后发射红荧光，与核酸结合后其发射荧光信号的能力会提高20~30倍。

PI染料不能自由穿过活细胞完整的细胞膜，标记时需先用乙醇固定细胞，使细胞膜的通透性增加，这样PI染料就能通过细胞膜进入细胞内与核酸结合，标记时需同时加入RNA酶消化细胞内的RNA，使PI只能与细胞内的DNA 结合，反映细胞内DNA的含量，继而通过细胞内DNA的含量确定细胞周期。

后来发展了用低渗的柠檬酸溶液一步标记PI燃料法，细胞在低渗的条件下其细胞膜的通透性增加，PI染料就可以进入细胞膜如细胞内的DNA结合，此法简便，快捷，应用更为广泛。

2.试验步骤PI标记方法一（乙醇固定法）：（1）将需要分析的目标细胞制成单细胞悬液，取2x106细胞，离心沉淀，弃上清。

（2）200μl PBS重悬沉淀于1.5mlEppendorf管中，缓慢加入1ml预冷的（保存于4℃）的70%乙醇固定目标细胞。

充分混匀，4℃静置30min。

（3）离心沉淀，弃上清，200μl适当浓度的PI染液重悬细胞，同时加入RNA酶，充分混匀，4℃静置30min。

（4）离心沉淀，弃上清，200μl流式PBS重悬沉淀，流式上样分析。

PI标记方法二（低渗法）（1）低渗柠檬酸标记液配制：柠檬酸三钠0.25g，TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚)0.75ml,PI 0.025g，RNA酶0.005g，用双蒸水补足至250ml。

（2）将需要分析的目标细胞制成单细胞悬液，取2x106细胞，离心沉淀，弃上清（3）1ml低渗柠檬酸标记液重悬沉淀，充分混匀，4℃静置30min.（4）离心沉淀，弃上清，200μl流式PBS重悬沉淀，流式上样分析。

3.注意事项检测细胞内DNA含量时必须保证样品内的细胞都是处于单细胞状态，但是在实际样品中经常会出现粘连的双细胞和多细胞团块，而流式细胞仪可能会将粘连在一起的两个二倍体细胞当作是一个四倍体的细胞，如果粘连的细胞较多而没有在分析时排除流式分析时就会得到比实际情况高很多的G2/M期细胞的比例，得到的流式结果就不准确。

1.消化：将细胞用不含EDTA的胰蛋白酶消化1-3min，（时间尽可能长，以减少吸管吹打），待消化充分，弃去胰酶，加入PBS5ml。

2.收集细胞：吸管吹打，移入离心管。

3.低速度离心：1000转5min弃去上清。

4.反复漂洗离心：加入PBS5-8ml，低速离心，同上步，重复3次，以除去细胞碎片。

5.获得单细胞悬液：加入1mlPBS，调整单细胞悬液至1-5*10^6/l，吸管吹打，制成单细胞悬液，4度保存。

6.PI染液制备：100ml去离子水加入5mgPI。

调PH值7,2-7。

4度棕色瓶保存。

4度避光保存。

7.、加入-20度预冷的乙醇。

4度过夜。

8.1000转5分钟离心弃去上清，
9.加入3mlPbs重悬。

10.1000转5分钟离心弃去上清，
11.加入100ulRNA酶37度水浴孵育30min
12.加入500ulPI染液4度避光孵育30min
13.上机前轻弹试管，，设立PI单染细胞组，检测。

Me PI单染检测细胞周期原理：细胞周期各个时期其DNA含量不同，利用荧光染料碘化丙啶(PI）能够和细胞内DNA结合的特性，根据不同DNA量结合的荧光染料量不同，因而流式细胞仪检测的荧光强度也不一样，可用来反应细胞周期的各个期的状况，即细胞增殖状况。

PI 单染检测细胞周期操作步骤： 1. 收集细胞：1) 悬浮细胞直接离心收集细胞，弃上清，用预冷PBS洗细胞两次。

2) 贴壁细胞用胰酶消化后离心收集细胞，弃上清，用预冷PBS洗细胞两次，胰
酶消化应严格控制，不能消化太过，操作过程要尽可能减少细胞机械损伤。

2. 固定细胞：加入预冷70%乙醇，于4℃固定30min以上或过夜，-20℃也可长时间
固定。

这一步必须说明下，乙醇固定时间不能太短，此步的目的有2个：1) 为
了后续染色时PI能顺利进入细胞。

2) 增加膜通透性后，让小片段核酸游离出细胞，减少非基因组DNA核酸的干扰。

3. 细胞染色：1) 离心收集固定过夜的细胞，以1mL的PBS洗细胞一次；2) 加入
300~400uL含50ug/mL(1:100)溴化乙锭（PI）的PBS缓冲液，加100ug/mL RNase A和0.2% Triton X-100；3) 37℃避光孵育30分钟。

特别说明：RNase A 和Triton两个都是非必须品，实践显示对实验结果没有太大影响。

4. 流式分析：以标准程序用流式细胞仪检测，一般计数2-3万个细胞，结果用细胞
周期拟和软件分析。

PI单染检测细胞周期特别说明：1) 细胞收集和洗涤操作需尽可能减少细胞的机械损伤，机载损伤可造成细胞DNA丢失而影响结果准确性。

1、离心收集细胞，弃上清，用预冷PBS洗细胞两次。

2、加入预冷70%乙醇，于4℃固定过夜，或-20℃长期固定（4℃过夜一般隔天就进行检测，如果想推迟几天测，那就保存在-20℃，有资料说-20℃可以保存一个月，个人建议尽量在最短时间内检测，有些实验是在不同时间点上收细胞，这时我就等最后一次固定完了一块测，基本上也多在一周内检测完毕，没有特地去比较保存时间对检测结果的影响）。

3、细胞染色离心收集细胞，以1mL的PBS洗细胞一次，加入500uLPBS含50ug/mL溴化乙锭（PI），100ug/mL RNase A，0.2% Triton X-100，4℃避光孵育30分钟（PI我是直接用PBS配成工作浓度，然后加入细胞沉淀混匀，RNA酶现加，但有时不加发现对实验结果也没太大的影响）。

4、流式分析以标准程序用流式细胞仪检测，一般计数2-3万个细胞，结果用细胞周期拟和软件ModFit分析。

分析时，使用FL2-w和FL2-A显示，去除联体细胞，具体如下图。

细胞周期流式后一般分为G0/G1,S,G2/M期三部份，如果有凋亡，在G0/G1期前面有个凋亡峰(也称sub-G0期),而如果分析时细胞窗口没设置好，可能在最前面还有细胞碎片峰。

结果解读G0/G1期细胞占总的61.2%，峰位于横座标的45.76G2/M期占13.07，峰位于横座标的91.43S期占25.73G2/G1为2.0（即G2期为4倍体细胞，而G1期为2倍体细胞，比值为2）峰的变异系数为4.54%（好）细胞碎片为0.48%，细胞聚集体有0.06%。

总的细胞数（仪器检测到的）为17525个，在细胞周期中分析的细胞数为17431个（即排除了碎片及聚集体后）CV是变异系数。

一般CV越小，峰形越好，越尖锐。

能控制在5%左右是比较好的结果，一般小于10%就可以认可了。

PI单染检测细胞周期和细胞凋亡(Apoptosis)PI（碘化丙啶）染色特点：一是能够与双链DNA/RNA螺旋的大沟部位结合，二是不能通过功能正常的完整细胞膜。

PI单染检测细胞周期操作步骤：1、铺板：5×105 cells/ml，六孔板，每孔1ml。

2、血清饥饿法进行细胞同步化处理：无血清培养基培养8-12h，然后才加药。

注意：实验细胞应处于对数生长期，而不能是完全长满，一般在50～80％比较好。

自然状态下，不增殖的细胞应该处于G0/G1期。

周期特异性药物阻滞哪一期，哪一期就升高，不会使其他阶段细胞增多。

3、收集细胞悬浮细胞：直接离心收集细胞，弃上清，在4 ℃、1200rpm用预冷的PBS洗细胞2次；贴壁细胞：a.将上清转入离心管（其中含有脱落的凋亡细胞）b.PBS冲洗液c.不含EDTA的0.25%的胰酶消化1-5min后，将细胞吹打成单细胞悬液将a、b、c合并后1200rpm离心5min；弃上清；用PBS清洗一次，再次弃上清，加入1.5ml PBS重悬细胞；注：为了既保持初始条件相同，又可搜集到足够的细胞，可选用多孔培养板；在搜集细胞时，浓度大、抑制强的组可多搜集些孔，以保证检测的细胞数量。

4、固定：将细胞悬液加入预冷（-20℃）无水乙醇3.5ml，使乙醇终浓度为70%，4℃固定过夜。

注意：（1）加入无水乙醇的时候要逐滴、慢速；（2）不是向细胞中加70%乙醇，而是向细胞悬液中加无水乙醇，这样是为了减少细胞聚集；（3）在染色之前细胞4 ℃固定可保存3周；5、离心收集细胞：以预冷（4℃）PBS洗细胞一次，调整细胞浓度≧1.0×106；6、PI综合染液：弃上清，在106细胞中加入0.5ml综合染液，重悬细胞后37 ℃水浴30 min。

PI stocking solution:5mg PI+5ml PBS--------混匀于15ml避光离心管RNase A stocking solution: 10mg +1ml PBS--------混匀于1.5ml避光离心管Triton X-100:0.5ml+25ml PBS--------混匀于50ml避光离心管注：（1）RNase A于－20 ℃保存，其它4℃保存并避光；（2）Triton-X-100（曲拉通）主要是通透细胞膜使PI能进入细胞核，提前两小时配，难溶；（3）在测细胞周期时，因为已经在细胞膜打孔了，PI易透过细胞膜和核酸结合，为避免干扰染色前需用RNAse A降解RNA。

.
染色检测细胞周期：protocolPI）消化收集对数生长期细胞（加热处含EDTA1、收集细胞：胰酶（*6个），吸取旧10理后损失多的组宜多收集细胞保证细胞有0.5-2×（根据培养皿大小决定量，PBS培养基到一个新离心管里；少量常温也要收集到上述离PBSPBS洗可以保证消化效率）洗2次，清洗的然后胰酶消化心管内【检测凋亡才需收集旧培养基及清洗的PBS】；而不是成片脱落）显微镜下观察细胞呈单个，（注意一定要消化完全，后利用旧培养基中和胰酶；离心(1000r/300g 5min)收集细胞沉淀。

PBS清洗细胞两次。

2、用预冷的重悬细胞沉淀，使细胞充分悬浮预冷的PBS3、固定细胞：用0.5ml乙醇终无水乙醇(1.2ml预冷的99.7%成单细胞，再将重悬细胞加入浓度70%)，吹打混匀以免细胞团聚，4℃固定至过夜。

2H1.84、细胞染色：离心（1000r/300g）收集固定的细胞，以5min才把细胞离mL的7000rpm(第一次实验时用PBS 洗细胞一次，离心1再次获取细胞沉淀后加入但最后流式结果显示细胞没有碎)心下来，30避光染色lPI，最后加入400μ30minlRNaseA00μ于37℃水浴℃均可）min（常温或4P用染色剂（据样本数，500uL 【有的试剂盒说明是：每个样本加入Triton 、A PI BS临时配好总量，其中50ug/ml、RNase 100ug/mL 染色30分钟】避光4）X-100
0.2% ℃、流式分析52
/ 1
.
结果用细胞万个细胞，2-3以标准程序用流式细胞仪检测，一般计数
去FL2-A显示，和使用分析。

周期拟和软件ModFit分析时，FL2-w 除联体细胞。

2
/ 2。

PI染色检测细胞周期1)细胞样品的准备：（1）对于贴壁细胞：小心收集细胞培养液到一离心管内备用。

用胰酶消化细胞，至细胞可以被轻轻用移液管或枪头吹打下来时，加入前面收集的细胞培养液，吹打下所有的贴壁细胞，并轻轻吹散细胞。

再次收集到离心管内。

1000g左右离心3-5分钟，沉淀细胞。

对于特定的细胞，如果细胞沉淀不充分，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。

小心吸除上清，可以残留约50微升左右的培养液，以避免吸走细胞。

加入约1毫升冰浴预冷的PBS，重悬细胞，并转移到1.5毫升离心管内。

再次离心沉淀细胞，小心吸除上清，可以残留约50微升左右的PBS，以避免吸走细胞。

轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团。

（2）对于悬浮细胞：1000g左右离心3-5分钟，沉淀细胞。

对于特定的细胞，如果细胞沉淀不充分，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。

小心吸除上清，可以残留约50微升左右的培养液，以避免吸走细胞。

加入约1毫升冰浴预冷的PBS，重悬细胞，并转移到1.5毫升离心管内。

再次离心沉淀细胞，小心吸除上清，可以残留约50微升左右的PBS，以避免吸走细胞。

轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团。

2)细胞固定：将细胞加入到1毫升冰浴预冷70%乙醇中，快速轻轻吹打混匀，4℃固定2小时或更长时间。

固定12-24小时可能效果更佳。

1000g左右离心3-5分钟，沉淀细胞。

对于特定的细胞，如果细胞沉淀不充分，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。

小心吸除上清，可以残留约50微升左右的70%乙醇，以避免吸走细胞。

加入约1毫升冰浴预冷的PBS，重悬细胞。

再次离心沉淀细胞，小心吸除上清，可以残留约50微升左右的PBS，以避免吸走细胞。

轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团。

3)碘化丙啶染色液的配制4)染色：每管细胞样品中加入0.5毫升碘化丙啶染色液，缓慢并充分重悬细胞沉淀，37℃避光温浴30分钟。

随后可以4℃或冰浴避光存放。

PI染色检测细胞周期实验步骤PI（Propidium Iodide）染色是一种常用的细胞周期分析方法，可用来定量分析细胞在不同细胞周期阶段的比例。

下面是一种常见的PI染色检测细胞周期实验步骤：实验步骤：1.细胞培养：将要进行细胞周期实验的细胞株在无菌条件下培养至富有活力的生长期，并确保细胞数目足够。

2.细胞收获：将培养皿中的细胞用PBS（磷酸缓冲盐溶液）洗涤2次，以去除残留的培养基和衰老细胞。

然后用细胞解离液将细胞从培养皿上彻底剥离。

3.细胞计数：采用显微镜或血球计算板等工具计数细胞数目。

确保每个实验条件下的细胞数相似。

4. 固定细胞：用70%（体积比）的乙醇在-20℃的环境中将细胞固定。

将乙醇均匀地加入细胞悬浮液中，一般细胞浓度为1×10^6/ml。

放置细胞悬液在-20℃的冰箱中固定1小时。

5.染色：将固定的细胞在室温下洗涤2次PBS。

制备PI染色液，可以选择适当的PI浓度（如50μg/mL）然后将染色液加入洗涤后的细胞悬液中，使之均匀包涵。

在黑暗中静置15分钟以便细胞充分染色。

6.流式细胞仪检测：使用流式细胞仪对染色后的细胞进行检测。

在流式细胞仪前，将细胞过滤，以去除聚团的细胞。

7.数据分析：使用流式细胞仪的软件或其他分析软件对所得数据进行细胞周期分析。

基于DNA含量，细胞可以被分为G0/G1、S和G2/M三个周期阶段，通过计算这些细胞的百分比可以得到细胞周期分布情况。

注意事项：1.实验要在无菌条件下进行，以避免细胞污染。

2.在染色时，应在黑暗的环境中操作，以避免PI受光照的影响。

3.使用流式细胞仪时，要注意正确设置仪器参数，以获取准确的测量结果。

4.实验前后仔细清洁工作区和实验设备，以防止交叉污染。

以上就是一种常见的PI染色检测细胞周期实验步骤，根据实验的需求和细胞类型的不同，还可以对实验步骤进行适当的调整。