免疫组织化学实验

免疫组织化学及HE染色实验步骤免疫组织化学和HE（Hematoxylin and Eosin）染色是常用的组织学研究技术。

免疫组织化学用于检测组织中特定抗原的表达，可以帮助研究者了解细胞和组织的功能和性质。

HE染色则是常用的常规组织染色方法，用于观察组织的形态学特征。

下面将分别介绍免疫组织化学和HE染色的实验步骤。

1.获取组织标本：首先，需要获取要研究的组织标本，可以是活体组织或固定的组织。

固定的组织标本一般使用10%缓冲福尔马林进行固定。

2.制备标本切片：将标本切割成适合光镜观察的薄片。

切片厚度一般为3-5微米。

3.去蜡：将蜡包埋组织切片放入蜡溶液中，加热脱蜡，使组织切片恢复水化。

4.抗原修复处理：将切片放入抗原修复液中，通过高温或酶解方法进行抗原修复处理，使细胞或组织中的抗原保持完整。

修复液的选择和具体实验要求有关。

5.阻断非特异性结合：将切片浸入阻断液中，阻断非特异性结合位点，减少假阳性结果。

6.一抗孵育：将合适浓度的一抗溶液加到切片上，使其孵育一段时间。

根据要检测抗原的性质选择合适的一抗。

7.二抗孵育和信号增强：将与一抗结合的二抗溶液加到切片上，同时可以加入信号增强剂，提高检测灵敏度。

8.反应显色：将切片加入显色液中，使阳性细胞或组织部分显示出颜色反应。

常用的显色方法有原位杂交、过氧化物酶法和碱性磷酸酶法等。

9.脱水和封片：经过显色后，将切片在酒精中进行脱水处理，然后用透明介质嵌片，并保护封片，以便于观察。

HE染色的实验步骤如下：1.获取组织标本：同样，首先需要获取组织标本，可以是活体组织或固定的组织。

2.制备标本切片：将标本切割成适合光镜观察的薄片。

切片厚度一般为3-5微米。

3.去蜡和水化：将蜡包埋组织切片放入蜡溶液中，加热脱蜡，然后用醇和水进行水化，使组织切片恢复水化。

4.酸性染料处理：将标本切片放入染色液中，使用血红素作为酸性染料，将细胞核染成蓝色。

5.碱性染料处理：将标本切片放入染色液中，使用溴化钡和噻唑蓝作为碱性染料，将细胞质和胞浆染成红色。

免疫组织化学染色实验步骤1. 实验准备确保所有实验所需的试剂、器材和设备都已准备齐全。

主要试剂包括抗体、抗原、染色液、封闭液等。

器材包括显微镜、离心机、微量移液器、培养箱等。

设备应进行适当的清洁和消毒，保持实验环境的无菌状态。

2. 组织样本的准备选择合适的组织样本并进行固定处理。

通常使用10%中性缓冲福尔马林固定液进行组织固定，固定时间一般为24小时，固定后应将组织转移至PBS缓冲液中保存。

固定后的组织样本需经过脱水、透明化和浸蜡等步骤，进行切片。

切片厚度通常为46微米，将切片放置于玻片上，进行后续的处理。

3. 切片的脱蜡和再水化4. 抗原修复抗原修复是提高抗体特异性的重要步骤。

选择适当的抗原修复液（如柠檬酸缓冲液或EDTA缓冲液），将其加热至沸腾并保持一定时间（通常为1020分钟），以去除固定过程中可能产生的抗原遮蔽效应。

之后将切片转移至冷却缓冲液中，待其冷却至室温。

5. 封闭非特异性结合位点用封闭液（如含有5%牛血清白蛋白的PBS溶液）处理切片，以封闭组织中可能存在的非特异性结合位点。

封闭液通常需要在室温下孵育30分钟。

6. 加入一抗（初级抗体）将一抗稀释至适当浓度，滴加在切片上。

抗体稀释液的选择应根据抗体的说明书进行，常见的稀释液包括PBS或含有0.1% TritonX100的PBS。

覆盖切片后，置于湿箱中在4°C下孵育过夜，以保证抗体与抗原充分结合。

7. 洗涤切片用PBS洗涤切片，去除未结合的一抗。

洗涤液的选择应为无菌PBS，洗涤次数通常为3次，每次5分钟。

8. 加入二抗（次级抗体）将二抗稀释至适当浓度，滴加在切片上。

二抗应选择针对一抗的相应标记抗体，常用的标记物包括荧光素、酶（如HRP、AP）等。

孵育时间为30分钟，孵育条件为室温，避免光照。

9. 洗涤切片用PBS洗涤切片，去除未结合的二抗。

洗涤操作与步骤7相同。

10. 显色反应根据使用的标记物不同，选择相应的显色试剂进行显色反应。

九、细胞免疫组化实验
1. 细胞爬片的制作
(1) 细胞用消化液消化后，用完全培养基重悬细胞，调整细胞浓度为2-5×10^5ml ；
(2) 在无菌培养皿中铺上3 块细胞爬片（圆片），圆片间不要重叠；
(3) 取细胞悬液分别滴到圆片或载玻片上，注意不要滴到片外，让细胞贴片30min 左右;
(4) 30min后，在培养皿中补加完全培养液（轻微的加入，以免冲力将贴壁的细胞打下来），放于37°C，5%CO2培养箱中培养3h左右（让其贴壁更牢)
2. 组化前处理
(1) 取出培养皿，用PBS 漂洗3 次×2min （PBS 可以不灭菌）；
(2) 4%多聚甲醛处理（室温）10-30min ；
(3) PBS 漂洗，3 次×2min ；
(4) 0.2%Txiton X-100 处理（室温）10-15min ；
(5) PBS 漂洗，3×2min；
(6) 3%H2 O2 处理（室温）10min ，以消除过氧化物酶；
(7) PBS 漂洗，3 次×2min ；
3. 组化（同免疫组化）。

贴壁细胞需要做免疫组化时，可以在培养皿里放入盖玻片，让细胞长在上面后，在取出来进行实验。

需要注意的是：取出培养好细胞的盖玻片后，PBS洗两次后，室温晾干用PFA或丙酮室温或4度固定都可以，10～15分钟。

之后可按组化常规方法进行。

封片时将有细胞的面向下盖在载玻片上即可。

另外，用丙酮固定细胞的同时即对细胞膜进行了打孔的步骤，如果用PFA进行固定，则需要再使用打孔剂打孔（细胞内表达）。

使用过氧化氢去除内源性过氧化物酶时，细胞要比石蜡切片的组织反应强烈，偶尔会掉片。

免疫组织化学实验流程免疫组织化学实验是一种利用抗原-抗体特异性结合的原理，通过标记的抗体来定位抗原的生物学技术。

以下是免疫组织化学实验的基本流程：一、实验准备组织样本处理：获取的组织样本需要经过固定、脱水、透明和浸蜡等处理步骤，以便于切片和后续的免疫组织化学实验。

抗体选择：根据实验目的选择相应的抗体，确保抗体的特异性高、亲和力强，并且与抗原的结合效果好。

实验试剂准备：准备好免疫组织化学实验所需的抗体、二抗、底物、DAB染色剂等试剂，确保试剂的质量和有效性。

二、切片制作将经过处理的组织样本切成薄片，厚度一般为3-5微米。

将切片放置在载玻片上，用滤纸吸去多余的蜡滴。

在切片上滴加适量的抗体，使其与抗原充分结合。

三、免疫组织化学染色在切片上加入适量的二抗，与一抗结合，形成抗原-抗体复合物。

加入底物溶液，使其与抗原-抗体复合物反应，生成有色产物。

用DAB染色剂对有色产物进行染色，使其呈现明显的颜色。

四、观察与记录在显微镜下观察染色结果，根据抗原的分布和染色强度进行记录。

可以使用图像分析系统对染色结果进行定量分析，进一步了解抗原的表达情况。

五、结果分析根据染色结果，分析抗原在组织中的分布和表达情况，与正常组织进行比较，判断其与疾病的关系。

将结果与其他实验室指标相结合，进行综合分析，为临床诊断和治疗提供依据。

需要注意的是，免疫组织化学实验的结果受到多种因素的影响，如抗体的质量、抗原的特异性、组织处理的方法等。

因此，在进行实验时需要严格控制实验条件，确保实验结果的准确性和可靠性。

同时，对于结果的解读需要结合临床背景和实验室其他指标进行综合分析，避免出现误判或漏诊的情况。

免疫组化的相关知识！一、免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)免疫组织化学是利用抗原抗体的特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。

免疫组织化学染色技术不仅有较高的敏感性和特异性，其特点是将形态学改变与功能、代谢变化结合起来，直接在组织切片，细胞涂片或培养细胞爬片上定位一些蛋白质和多肽类物质的存在，并可精确到亚细胞结构水平，结合电子计算机图像分析系统或激光扫描共聚集显微术等技术，对被检物质进行定量分析。

二、免疫组化实验所用的组织和细胞标本有哪些？实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类，前者包括石蜡切片(病理大片和组织芯片)和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。

其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究；石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原修复，是免疫组化中首选的组织标本制作方法。

三、石蜡切片为什么要做抗原修复？有哪些方法？石蜡切片标本均用甲醛固定，使得细胞内抗原形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇，同时蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。

所以要求在进行IHC染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。

常用的抗原修复方法有微波修复法，高压加热法，酶消化法，水煮加热法等，常用的修复液是pH6.0的0.01 mol/L的柠檬酸盐缓冲液。

四、免疫组化实验用抗体的选择1、一抗选择要点(1)选择单克隆还是多克隆抗体。

由一种克隆产生的特异性抗体叫做单克隆抗体，单克隆抗体能目标明确地与单一特异抗原决定簇结合，就象导弹精确地命中目标一样。

另一方面，即使是同一个抗原决定簇，在机体内也可以由好几种克隆产生抗体，形成好几种单克隆抗体混杂物，称为多克隆抗体。

免疫组化操作规程一、实验原理与意义免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。

它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。

二、实验器材微波炉、吹风机、组化笔、湿盒、烤箱、振荡器、染缸、光学显微镜、纯木浆卫生纸、计时器和通风橱等。

三、试剂配制1. 0.01 M PBS(pH 7.34 )：9.0 g NaCl + 50 ml 0.2 M PB 加双蒸水至1000 ml；1000 ml0.2M PB (pH 7.4)＝5.93 g NaH 2 PO 4 ·2H 2 O＋58.02 g Na 2 HPO 4 ·12H 2 O in 1000 ml 双蒸水或＝190 ml A + 810 ml B（A. 0.2 M NaH 2 PO 4 ·2H 2 O：15.6 g in 500 ml ddH 2 O；B. 0.2M Na 2 HPO 4 ·12H 2 O：71.632 g in 1000 ml dH 2 O）。

2. Citrate Buffered Saline（0.01 M 柠檬酸缓冲液，PH6.0）：28 ml A + 72 ml B + 200 ml ddH 2 O（A.Citrate acid（柠檬酸）：10.5 g 加双蒸水至1000 ml；B.Citrate sodium（柠檬酸钠）：29.41 g 加双蒸水至1000 ml）。

3. 细胞通透液：由终浓度分别为0.3%双氧水和0.3%Triton X-100 混合而成。

配制方法是先用微波加热的36 ml PBS，再接着加120 ul TritonX-100，并加热一会儿，冷却至临用前加0.4 ml 30％H 2 O 2 。

免疫组织化学及HE染色实验步骤免疫组织化学（immunohistochemistry，简称IHC）是一种用于检测组织切片中特定蛋白质的方法，其原理是通过特异性抗体识别目标蛋白质并将其可视化。

本文将介绍IHC实验的基本步骤和HE染色实验的步骤。

IHC实验步骤：1.组织切片制备：从取材到固定、包埋和切片，保证组织样本的质量和完整性。

2.抗原修复：将组织切片放入含有钠胼胝土缓冲液或其它抗原修复液中进行抗原修复。

可以选择使用高温或酶解等方法。

3.阻断非特异性结合：将组织切片浸泡在阻断液中，如BSA、牛血清蛋白等，以防止抗体与非特异性的蛋白质结合。

4.一抗孵育：将含有一抗的抗体溶液滴在组织切片上，孵育一段时间，使一抗与目标蛋白质发生特异性结合。

5.二抗孵育：选择与一抗宿主不同的二抗标记物，如荧光素、过氧化物酶等，将含有二抗的溶液滴在组织切片上进行孵育。

6.吸附剂清洗：将组织切片用洗涤缓冲液洗去未与标记物结合的二抗。

7.标记物检测：根据所选择的标记物，可以进行荧光显微镜观察、酶反应等，将目标蛋白质可视化。

8.盖片封装：将组织切片用适当的缓冲液封装至玻璃盖片上。

HE染色实验步骤：1.组织切片制备：从取材到固定、包埋和切片，保证组织样本的质量和完整性。

2.脱蜡：将组织切片放入甲醇中脱去石蜡包埋。

3. 染剂处理：将组织切片依次浸泡在嗜铬酸钾溶液中，漂洗后浸泡在碱性染剂中，如伊红（Eosin）染料。

4. 酸性染剂处理：将组织切片浸泡在酸性染剂中，如苏木红（Hematoxylin）染料。

5.脱染：将组织切片用酒精和醋酸溶液进行脱染。

6.脱水：将组织切片依次浸泡在酒精梯度中，脱去水分。

7.透明化：将组织切片逐渐浸泡在透明剂中，如苯酚乙醇、二甲苯等，使组织切片透明。

8.盖片封装：将组织切片用适当的透明剂封装至玻璃盖片上。

以上是免疫组织化学和HE染色实验的基本步骤。

通过这些步骤，可以标记和可视化组织切片中的特定蛋白质，进而获得研究和诊断所需的信息。

免疫组化实验方法免疫组化（Immunohistochemistry，简称IHC）是一种利用特异性抗体与组织或细胞特定抗原结合的方法，以此可以检测细胞或组织中蛋白质的表达和分布情况。

IHC技术已广泛应用于病理学、癌症诊断、生物医学研究等领域。

以下是免疫组化实验的常用方法：1.样本处理：通常以石蜡包埋切片作为实验样本。

首先，从固定的组织或细胞中取得标本，然后进行脱水、透明化和浸蜡等处理。

接下来，使用切片机将组织或细胞切割成厚度为3-5μm的切片。

2.抗原恢复：由于样本的固定和包埋可能导致抗原的损伤，因此需要对切片进行抗原恢复处理。

常见的抗原恢复方法包括热处理、酶解法和酸性水解法。

热处理是将切片置于缓冲液中，在高温下进行退火。

酶解法是使用胰蛋白酶等酶对切片进行消化。

酸性水解法则使用盐酸或酶进行酸性处理。

3.抗体结合：选择特异性的一抗体与目标抗原结合。

一抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，可以经商业采购或自家制备。

将一抗体加入待检测切片上，让其与目标抗原结合。

4. 第二抗体结合：待检测切片上结合了一抗体的抗原后，需要添加第二抗体与一抗体结合。

第二抗体通常是反相应物免疫球蛋白（Secondary Antibody），如反人IgG，反兔IgG等。

第二抗体上常会标记有发光物质、酶标记物或荧光染料，用于可视化结果。

5.可视化和显色：根据选择的第二抗体，可以选择显色方法。

例如，辣根过氧化物酶（HRP）结合的第二抗体可以使用3,3'-二氨基联苯思（DAB）作为底物，呈棕色或棕黄色；荧光标记的第二抗体可以用荧光显微镜进行观察。

6.伪染色：为了辅助观察和识别目标组织或细胞，可以进行伪染色。

常见的伪染色方法有对比染色、核染色和细胞质染色等。

7.阴性对照和阳性对照：为了确保实验结果的准确性和可靠性，同时进行阴性对照和阳性对照实验。

阴性对照是在实验中将第一抗体替换为非特异性抗体或缺少抗体的处理组织或细胞组织；阳性对照是在实验中使用已知表达目标蛋白的组织或细胞进行处理。

免疫组化操作步骤一、实验原理与意义免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。

它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。

（一）、仪器设备1. 18cm不锈钢高压锅或电炉或用微波炉.2. 水浴锅（二）、试剂1. PBS缓冲液（ph7.2―7.4）：NaC137mmol/L，KCl2.7mmol/L ,Na2HPO4 4.3mmol/L, KH2PO4 1.4mmol/L. 2．0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液（CB,ph6.0,1000ml）：柠檬酸三钠3g,柠檬酸0.4g。

3．0.5mol/L EDTA缓冲液（ph8.0）：700ml水中溶解186.1g EDTA& 8226;2H2O,用10mmol/L NaOH调至ph8.0,加水至1000ml.4. 1mol/L的TBS缓冲液（ph8.0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至pH8.0, 加水1000ml。

5. 酶消化液：a.0.1%胰蛋白酶:用0.1%CaCl 12(ph7.8)配制。

b.0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。

6. 3%甲醇―H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制7. 风裱剂：a.甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（pH9.0–9.5）等量混合 b 油和TBS(PBS)配制8．TBS/PBS PH9.0–9.5,适用于荧光纤维镜标本;ph7.0-7.4适合光学纤维标本（三）、操作流程1、脱蜡和水化：脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。

a 组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟,更换二甲苯后在浸泡10分钟b 无水乙醇中浸泡五分钟c 95%乙醇中浸泡五分钟d 75%乙醇中浸泡五分钟2、抗原修复：用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片：A 抗原热修复a 高压热修复在沸水中加入EDTA(ph8.0)或0.01m枸橼酸钠缓冲溶液（ph6.0）.盖上不锈钢锅盖，但不能锁定。

免疫组化的原理及实验步骤一免疫组化的原理免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。

二免疫组化的实验步骤固定１．浸入式：将组织样本直接放入固定液（4%的多聚甲醛等固定液）内，4℃浸泡2小时，不超过12小时２. 灌注式：主要适用于脑部组织，用从心室灌注生理盐水排空血管中血液后灌注固定液切片1.石蜡切片：(1) 使用从低浓度到高浓度的乙醇使组织脱水；(2)将组织浸入二甲苯中透明；(3)在溶蜡箱中，组织被石蜡包埋；(4)将包埋好的蜡块冷却后固定于切片机上，切成薄片，并将薄片贴于玻片上；(5)用二甲苯脱蜡并重新从高到底浸泡乙醇；注意：石蜡切片制备好后还需要进行抗原修复以解开被甲醛交联的抗原决定簇上的氨基或羧基，常用方法有微波热修复，煮沸热修复，酶消化方法２. 冰冻切片：将固定的组织放入液氮或干冰-丙酮中迅速冷却，然后切片机切片，并将片贴于玻片上封固1.防止脱片，可以使用树脂胶或多聚赖氨酸进行黏附。

2.避免内源性过氧化酶的影响，可以用3%双氧水处理15min,(针对用过氧化酶标记的抗体)3.避免内源生物素的影响，可以鸡蛋清或卵白素进行封闭；4.避免非特异性染色，可以用二抗来源的血清进行封闭染色1.滴加稀释后的一抗，4℃过夜，PBS或者脱脂牛奶洗5min 3次；2.滴加稀释后的二抗，37℃孵育30min,PBS或者脱脂牛奶洗5min 3次；显色：选择与二抗配套的显色系统，进行反应，PBS终止反应后，用苏木素村然胞核，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，37℃干燥48小时，显微镜下观察。

病理学中的免疫组织化学技术使用教程免疫组织化学技术是一种常见且广泛应用于病理学研究的分析方法。

它通过将特定的抗体与组织标本中的抗原相互作用，从而提供关于细胞或组织中蛋白质表达和定位的信息。

本文将为您介绍免疫组织化学技术的使用方法和注意事项。

一、实验所需材料和试剂在进行免疫组织化学实验之前，准备好以下材料和试剂是必要的：1. 抗体：选择特异性强、经过验证的一抗，可以有多种来源如商业供应商或自制。

2. 血液清晰剂：例如牛血清白蛋白（BSA）或牛血浆等。

3. 缓冲液：常用的有生理盐水、Tris缓冲液等。

4. 清洗液：例如磷酸盐缓冲液、Tween-20等。

5. 可可粉末或3,3'-二氨基联萘（DAB）显色底物。

6. 高质量的显微镜玻璃片、载玻片和封片剂。

二、步骤以下是进行免疫组织化学实验的通用步骤：1. 组织样本准备：采集病理标本并固定在适当的组织固定剂中，如4%的中性缓冲甲醛。

确保标本大小适宜，以便于透明度好和抗体能够充分作用。

2. 标本处理：将固定的组织样本进行去水和石蜡包埋等处理。

3. 反应抗原修复：使用热蒸汽或酶解剂（例如胰蛋白酶）进行抗原修复以恢复抗原的活性。

根据不同抗原的性质选择适当的修复方法。

4. 抗体染色：将组织样本与目标抗体进行孵育。

将抗体稀释到推荐浓度中，根据实验要求选择合适的时间和温度进行孵育。

5. 清洗：用缓冲液或PBS清洗标本，以去除未结合的抗体。

6. 二抗处理：加入适用于一抗的二抗，例如抗IgG。

二抗通常与标记物（如酶或荧光染料）结合，以便于检测。

7. 清洗：再次用缓冲液或PBS清洗标本，以去除未结合的二抗。

8. 显色：接下来加入可可粉末或DAB等显色底物，观察标本是否出现所需的显色反应。

9. 染色修复：在显色后，如果需要的话，可以执行染色修复以增强显色效果。

10. 去水和挂片：用梯度酒精进行去水，然后将样本挂片，以便于后续显微镜观察。

三、注意事项在进行免疫组织化学实验时，需要注意以下几点：1. 实验室安全：实验时应遵守实验室安全操作规范，戴上手套和口罩，避免接触到可能有害的试剂和组织样本。

免疫组化法实验操作步骤免疫组织化学(Immunohistochemistry, IHC)是一种利用抗体与组织中的抗原特异性结合的技术。

它是一种重要的研究方法，可以用于检测和定位组织中的特定蛋白质和其他生化分子。

以下是免疫组织化学实验的一般操作步骤：1.样本处理：a.固定：将待检测的组织样本进行固定处理，以保持其形态结构并保留组织内的抗原。

b.切片：将固定的组织样本切成非常薄的切片（通常为3-5微米厚），并将其放置在载玻片上。

2.抗原解蓝（抗原恢复）：a.对于不同类型的组织样本，选择适当的抗原解蓝方法。

b.抗原解蓝可以通过加热、酶解或其他方法来恢复组织样本中的抗原。

3.阻断非特异性结合：a. 使用一种非特异性的蛋白质来阻断载玻片上未特异性结合的位点，例如牛血清蛋白(Bovine Serum Albumin, BSA)或小鼠免疫球蛋白(Mouse IgG)。

b.加入适当浓度的阻断剂，并孵育片玻片上的切片，以阻断非特异性结合位点。

4.主抗体孵育：a.加入含有特定抗原的主抗体溶液，其可以与组织样本中特定的抗原结合。

b.孵育片玻片上的切片，使主抗体与待检测的抗原结合。

5.洗涤：a.用缓冲液或PBS等洗涤溶液洗涤载玻片上的切片，以去除未结合的主抗体。

6.二抗孵育：b.孵育片玻片上的切片，使辅助抗体与主抗体结合。

7.洗涤：a.再次用缓冲液或PBS洗涤载玻片上的切片，以去除未结合的辅助抗体。

8.信号放大：a.可根据需要，使用染色剂或底物来增强或显色识别待检测抗原的结合位置。

b.例如，使用荧光染料或酶底物，通过显微镜观察或光镜观察，可使抗原可视化。

9.洗涤：a.最后一次用缓冲液或PBS洗涤载玻片上的切片，以去除未结合的染色剂或底物。

10.封片：a.加入适当的封片剂，如富含丙酮的溶液，将载玻片上的切片封装起来，以保护切片和保存染色结果。

免疫组织化学是一种复杂的实验技术，需要仔细的操作和精确的控制条件才能得到准确的结果。

实验5 小鼠脑片免疫组织化学（SABC法）实验一、实验目的了解免疫组织化学实验原理，熟练掌握实验操作步骤。

二、实验原理免疫组织化学技术（Immunohistochemistry）是指用免疫学原理（从组织细胞水平进行抗原和抗体结合），通过特异的抗原抗体反应标记上可见的显示物系统来检查细胞及组织上原位抗原或抗体成分的方法。

一般认为凡具有抗原性或半抗原性物质都可以用免疫细胞化学方法检测并显示出来。

在光学显微镜、荧光显微镜或电子显微镜下观察其性质定位，还可以利用细胞分光光度计、图像分析仪、共聚焦显微镜等进行细胞原位半定量测定。

免疫组织化学的显著特点是特异性强，因为免疫学的基本原理是抗原与抗体“一对一”的特异结合，所以免疫组织化学从理论上讲也是“一对一”的组织细胞中抗原的特定显示。

如角蛋白(keratin)显示上皮成分、LCA显示淋巴细胞成分。

只是当组织细胞中存在交叉抗原时才会出现交叉反应。

敏感性高：在应用免疫组化的起始阶段，由于技术上的限制，只有直接法、间接法等敏感性不高的技术，那时的抗体只能稀释几倍、几十倍，现在由ABC法或SP法的出现，使抗体稀释上千倍、上万倍甚至上亿倍乃至可在组织细胞中与抗原结合，这样高敏感性的抗体抗原反应，使免疫组化的方法越来越方便地应用于常规诊断工作中。

定位准确、形态与功能相结合：虽然聚合酶链反应(PCR)方法已经广泛地应用于疾病的诊断，但由于不能在组织和细胞内进行明确的定位而限制了PCR在病理组织学上的应用。

免疫组化则可在组织和细胞中进行抗原的准确定位，因而可以同时对不同抗原在同一组织或细胞中进行定位观察，这样就可以进行形态与功能相结合的研究，对于病理学研究的深入是十分有意义。

三、实验器材略四、实验步骤1. 载玻片准备将新载玻片置于洗涤剂中煮沸30min，先后用清水和蒸馏水冲洗干净，晾干，放入浓硫酸-重铬酸钾洗液中浸泡12小时，流水冲洗后再用蒸馏水清洗，干燥，在95%的酒精中浸泡24h，擦干。

免疫组织化学（immunohistochemistry）1组织脱水、包埋及切片（1）将剥离出瘤组织切成合适大小的组织块放于4%多聚甲醛中固定2天，固定时间最长不能超过1个月；（2）将组织块从固定液中取出，PBS漂洗1h，然后开始进行组织脱水，程序如下：70%乙醇浸泡30min—80%乙醇浸泡30min—90%乙醇浸泡30min—95%乙醇I浸泡30min—95%乙醇II浸泡30min—无水乙醇I浸泡30min—无水乙醇II浸泡30min—无水乙醇III浸泡30min—二甲苯I浸泡30min—二甲苯II浸泡30min；（3）将组织块完全浸泡在蜡液中60℃过夜；（4）打开包埋仪器，设置相应参数，2h后将蜡液中的组织块取出放入包埋机的蜡缸中，将包埋所用铁槽清理干净放入蜡缸，用镊子将组织块放于铁槽正中央，取出铁槽接取少量蜡液使凹槽填满，将包埋盒倒置卡在铁槽上，放于低温工作台上冷却凝固，待其完全凝固后，取下包埋好的蜡块；（5）在切片前，先将蜡块表面修平，切成连续的厚度为5µm的切片，放入冷水中展片，用刀片将连续蜡带分开，然后放入40℃水浴锅中，用防脱载玻片捞出目的蜡带，放入烤片机上过夜，组织切片4℃保存。

2免疫组化染色（1）首先，用二甲苯脱蜡，然后用梯度酒精和水使切片充分复水，详细流程为：二甲苯I浸泡10min—二甲苯II浸泡10min—无水乙醇I浸泡5min—无水乙醇II浸泡5min—90%乙醇浸泡5min—80%乙醇浸泡5min—自来水冲洗5min；（2）抗原修复：微波炉中火预热配制好的枸橼酸缓冲液3min，将切片浸入修复液内，用微波炉中火加热3min，在此过程中注意不要让修复液溢出，以免切片变干，加热后室温冷却5min，加热冷却过程重复3次，修复完成后自然冷却至室温，用PBS清洗3次，每次5min；（3）滴加适量的3% H2O2覆盖组织，室温孵育10min，以阻断内源性过氧化物酶的活性，摇床上PBS清洗3次，每次5min；（4）用PBS配制5%的山羊血清，滴加适量至组织上封闭1h；（5）封闭结束后，甩干载玻片，用吸水纸吸去残留液体，将载玻片放人湿盒内，滴加由5%山羊血清稀释的一抗，一抗液体要完全覆盖组织，放入4℃冰箱内孵育过夜；（6）将组织切片从冰箱中取出，放于室温静置至室温，用PBS摇床清洗3次，每次10min，用5%山羊血清稀释生物素标记的二抗覆盖组织表面，室温孵育45min，PBS摇床洗3次，每次10min；（7）组织表面滴加适量亲和素标记的辣根过氧化物酶，室温孵育30min，PBS洗3次，每次5min；（8）DAB显色：配制DAB显色液，滴加至组织表面，在显微镜下观察着色，待出现明显棕色且背景无明显着色时放于自来水中终止显色；（9）苏木素染核1-2min，用自来水冲洗终止染色；（10）将组织依次放入80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、无水乙醇I、无水乙醇II各5min，再放入二甲苯I 10min，二甲苯II 10min，完成组织脱水和透明；（11）滴加一滴中性树胶封片，显微镜下观察并拍照，室温保存。

免疫组化实验步骤及配方免疫组化实验是一种用于检测和定位特定蛋白质在细胞、组织或器官中表达的技术。

免疫组化实验包括一系列步骤，如抗原修复、非特异性结合抑制、免疫原和次级抗体处理、显色/荧光染色等。

下面将详细介绍免疫组化实验的步骤及配方。

1.抗原修复：抗原修复是为了恢复因组织固定而引起的抗原性损失。

一般使用高温或酶解方法进行抗原修复。

-高温方法：将组织切片置于高温缓冲液中加热，一般在95°C下加热15-20分钟。

-酶解方法：如胰酶消化、蛋白酶消化等。

例如，可以使用0.1%胰酶在37°C下进行酶解。

2.非特异性结合抑制：非特异性结合抑制是为了防止免疫试剂（如次级抗体）与非特异性蛋白结合，从而降低假阳性结果。

一般使用正常动物血清或胶体等进行非特异性结合抑制。

-正常动物血清：根据动物源种类（如小鼠、兔子等）选择相应的正常动物血清。

-胶体：如牛血清蛋白、牛血清白蛋白等。

可以在最终稀释液中加入1-2%的胶体。

3.免疫原处理：免疫原处理是为了增强目标抗原与抗体的结合效率，一般通过与次级抗体或酵素结合。

根据具体实验需求，可以选择荧光标记、酶标记或金标记等不同的方式进行免疫原处理。

-荧光标记：如荧光素等。

-酶标记：如辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）等。

-金标记：如胶体金、纳米金等。

4.次级抗体处理：次级抗体处理是为了增强免疫原与目标抗原之间的结合效应。

一般使用来自其他物种的抗体作为次级抗体。

根据不同实验需求，可以选择与荧光标记、酶标记或金标记结合的次级抗体。

-荧光标记：如青蒿素标记的抗兔荧光标记抗体等。

-酶标记：如HRP标记抗体、AP标记抗体等。

-金标记：如碳标记抗体、金标记抗体等。

5.显色/荧光染色：显色/荧光染色是为了可视化目标抗原的分布和定位。

根据不同的免疫标记试剂，可以选择适当的染色方法。

-显色：如DAB（3,3'-二氨基联苯）染色。

-荧光染色：根据使用的荧光标记试剂选择相应的染色方法，如DAPI 染色、FITC染色等。