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竹叶黄酮的分离提取、检测与成分分析姓名：周胤潇班级:微生物121学号：201201220414摘要：竹叶黄酮(Bamboo- leaf-flavonoid, BLF)是我们于上世纪90年代末创制的一种新型植物黄酮制剂,具有优良的抗自由基、抗氧化、抗疲劳、耐缺氧、抗病毒、抗菌、抗炎、降脂、扩冠和免疫增强活性等（1-2）。
竹叶总黄酮以其巨大的资源优势和良好的药理活性将成为一种非常有前途的天然药物,具有广阔的开发前景.本实验主要对竹叶中黄酮类物质的含量用紫外分光法进行测定以及高效液相色谱法对竹叶提取物的成分分析。
关键词：竹叶黄酮类物质紫外分光法高效液相色谱法前言竹子为禾本科Poaceae竹亚科Bambusoideae多年生常绿植物，在我国分布很广，资源十分丰富。
竹子在建筑、水利、农业等领域都有广泛的应用，然而，竹子加工利用后，竹叶却总是被弃置，造成了极大浪费。
近年来的研究发现竹叶中含有多种活性物质，其主要活性物质是黄酮类物质,含量平均在2%,竹叶提取物中的有效成分主要是以荭草苷、异荭草苷、牡荆苷和异牡荆苷为代表的碳苷黄酮和以对香豆酸、绿原酸、咖啡酸和阿魏酸为代表的植物酚酸为主，竹叶黄酮中的功能因子主要是黄酮糖苷和香豆素内酯,黄酮类物质是一类天然植物成分，具有显著的生理及药理活性，黄酮类成分有明显的抗溃疡、解痉、抗菌、抗炎、降血脂、镇痛和雌性激素等生物活性和生理活性作用⑶。
实验目的：（1）掌握样品的前处理的方法（2）掌握竹叶黄酮的提取、分离与纯化（3）用硝酸铝-亚硝酸钠比色法测定竹叶子中总黄酮（4）采用超高效液相色谱（UPLC）定量分析竹叶中荭草苷、异荭草苷、牡荆苷、异牡荆苷、对香豆酸、绿原酸、咖啡酸、阿魏酸8 个特征性成分的量。
1 实验材料和仪器1.1实验材料：竹叶（摘自浙江农林大学校园内）标准样品：甲醇（分析纯）、乙醇（分析纯）、亚硝酸钠、硝酸铝、石油醚（分析纯）、氢氧化钠、芦丁标准品（购自中国药品生物制品检定所，纯度均大于98%）、去离子水。
基于UPLCQTOFMSMS技术快速鉴定降香中化学成分一、本文概述随着现代科学技术的发展，对天然植物产品的化学成分研究已成为中医药现代化的重要组成部分。
降香，作为一种传统中药材，广泛用于活血化瘀、消肿止痛等方面。
由于降香化学成分复杂，传统分析方法在鉴定其中的有效成分时存在一定的局限性。
为此，本研究采用超高效液相色谱四极杆飞行时间质谱（UPLCQTOFMSMS）技术，对降香中的化学成分进行快速鉴定。
本文首先介绍了UPLCQTOFMSMS技术的基本原理及其在天然产物分析中的应用。
随后，详细阐述了实验方法，包括样品处理、色谱和质谱条件等。
通过对降香样品的分析，我们鉴定出多种化学成分，并对这些成分的结构进行了推测和验证。
本文讨论了这些化学成分的药理作用及其在中医药中的应用前景。
本研究不仅为降香的化学成分分析提供了新的方法，也为中医药的现代化研究提供了科学依据。
二、材料与方法降香样品：采集自我国某地区，经鉴定为降香（Dalbergia odorifera T. Chen）。
超高效液相色谱四极杆飞行时间串联质谱（UPLCQTOFMSMS）系统：由美国Waters公司提供，包括Acquity UPLC系统、evo G2S QTOF 质谱仪、MassLynx数据处理系统。
电子天平：购自瑞士Mettler Toledo公司，型号为ME104E。
超声波清洗器：购自昆山市超声仪器有限公司，型号为KQ500DE。
准确称取100 mg样品粉末，加入10 mL乙腈，超声提取30分钟。
提取液经22 m微孔滤膜过滤，滤液用于UPLCQTOFMSMS分析。
色谱柱：Waters Acquity UPLC HSS T3柱（1 mm 100 mm，8 m）。
梯度洗脱程序：05 min，595B510 min，95B1012 min，955B。
正离子模式：毛细管电压0 kV，锥孔电压40 V，源温度100，去溶剂温度350，去溶剂气体流量600 Lh。
黄芩中黄酮类化合物药理学作用研究进展一、本文概述黄芩，作为中国传统中药的瑰宝，自古以来就在中医药理论中占据重要地位。
黄芩的药用价值主要来源于其含有的黄酮类化合物，这些化合物具有多种药理学作用，如抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗菌等。
随着现代科学技术的进步，对黄芩中黄酮类化合物的药理学作用研究不断深入，为黄芩在临床治疗中的应用提供了更为科学的依据。
本文旨在综述近年来黄芩中黄酮类化合物的药理学作用研究进展，以期为黄芩的进一步开发利用和临床应用提供理论支持。
本文将首先介绍黄芩及其黄酮类化合物的概述，包括黄芩的生物学特性、黄酮类化合物的种类及结构特点等。
然后，重点综述黄酮类化合物在抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗菌等方面的药理学作用及其机制。
还将对黄芩中黄酮类化合物的提取分离方法、含量测定以及药代动力学等方面的研究进展进行简要概述。
对黄芩中黄酮类化合物的临床应用前景及存在的问题进行展望，以期为其在医药领域的深入研究和应用开发提供参考。
二、黄芩黄酮类化合物的提取与分离黄芩黄酮类化合物作为黄芩的主要活性成分，其提取与分离技术的研究对于深入理解其药理学作用具有重要意义。
近年来，随着科学技术的进步，黄芩黄酮类化合物的提取与分离方法得到了不断的优化和创新。
提取方法：黄芩黄酮类化合物的提取主要采用有机溶剂提取法、水提法、超声波提取法、微波提取法以及超临界流体萃取法等多种方法。
其中，有机溶剂提取法因其操作简便、提取效率高等优点而被广泛应用。
然而，由于有机溶剂可能对人体和环境造成危害，因此，寻求环保、高效的提取方法仍是研究的热点。
分离技术：黄芩黄酮类化合物的分离主要依赖于色谱技术，包括硅胶柱色谱、聚酰胺柱色谱、大孔树脂柱色谱等。
近年来，随着色谱技术的不断发展，高效液相色谱（HPLC）、超高效液相色谱（UPLC）以及液相色谱-质谱联用（LC-MS）等技术在黄芩黄酮类化合物的分离中得到了广泛应用。
这些技术不仅提高了分离效率，而且有助于化合物的准确鉴定。
食品中黄酮类化合物含量分析方法研究黄酮类化合物是一类具有多种生物活性的天然化合物，广泛存在于蔬菜、水果和谷物中。
它们被认为具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、降低胆固醇和抗衰老等多种保健功能，因此备受关注。
为了准确测定食品中黄酮类化合物的含量，科学家们进行了大量研究，提出了多种分析方法。
其中一种常用的分析方法是高效液相色谱（HPLC）法。
这种方法通过将食品样品中的黄酮类化合物分离并与特定检测剂发生反应，利用检测剂和产物之间的荧光性质进行定量分析。
HPLC法不仅能够准确地分离食品样品中的黄酮类化合物，还能够快速、灵敏地测定它们的含量。
然而，该方法在实际应用中存在一些局限性，比如需要耗费较多的时间和昂贵的仪器设备。
为了解决HPLC法的局限性，科学家们着手研究其他分析方法。
其中一种是质谱联用技术（LC-MS），它结合了高效液相色谱和质谱技术的优势。
该方法通过先利用HPLC将食品样品中的黄酮类化合物分离，然后通过质谱技术进行定性和定量分析。
与HPLC法相比，LC-MS具有更高的选择性、灵敏度和分析速度。
然而，这种方法的复杂性和高昂的成本限制了其在实际应用中的推广。
除了HPLC和LC-MS，还有其他一些新兴的分析方法被应用于食品中黄酮类化合物的含量分析。
例如，基于表面增强拉曼光谱（SERS）的方法，通过将食品样品与金属纳米颗粒混合，利用纳米颗粒引起的电磁增强效应来提高黄酮类化合物的信号强度，从而实现灵敏的定性和定量分析。
此外，还有一种名为电化学法的分析方法，它利用电化学技术测定黄酮类化合物的电化学行为来推断其含量。
这些新兴方法在提高分析效率和降低成本方面具有巨大潜力。
综上所述，食品中黄酮类化合物含量分析方法的研究一直在不断深入。
HPLC法作为传统的分析方法，已经取得了一定的成绩。
然而，为了提高分析的速度和灵敏度，科学家们不断探索新的方法。
LC-MS、SERS和电化学法等新兴方法在提高分析效率和降低成本方面具有潜力，但仍需要进一步研究和改进。
LC—MS／MS法同时测定葛根药材中14种异黄酮类成分的含量目的：建立同时测定葛根药材中14 种异黄酮类成分含量的方法。
方法：采用液相色谱串联质谱法同时测定14批葛根药材（野葛：PL-1～PL-7，粉葛：PT-1～PT-7）中14种异黄酮类成分的含量。
色譜柱为Extend C18，流动相为甲醇-水（梯度洗脱），流速为0.8 mL/min，柱温为22 ℃，进样量为5 μL；离子源为电喷雾离子源，检测方式为负离子检测，扫描方式为多级反应监测模式，喷射电压为-4 500 V，离子源温度为600 ℃，雾化气为60 psi ，辅助气为60 psi，碰撞气为7 psi，气帘气为30 psi。
采用SIMCA 13.0软件对上述14批药材进行聚类分析。
结果：14种待测异黄酮类成分在10～1 000 ng/mL（葛根素为10～5 000 ng/mL）范围内具有良好的线性关系（r均大于0.990 0），精密度、稳定性和重复性试验的RSD均小于5%，加样回收率范围为95%～105%，RSD范围为0.8%～4.5%（n=6）。
野葛与粉葛中异黄酮类总含量差异较大，不同产地的葛根药材异黄酮含量差异较大；14种异黄酮类成分中，葛根素含量最高。
聚类分析结果显示，14批葛根药材可聚为4类，PL-2为Ⅰ类，PL-3、PL-4为Ⅱ类，PL-5、PL-6、PL-7为Ⅲ类，其余为Ⅳ类。
结论：该方法操作简单、重复性良好，可用于检测葛根药材中14 种异黄酮成分的含量，适用于该药材的整体质量控制。
ABSTRACT OBJECTIVE：To establish the method for simultaneous determination of 14 kinds of isoflavones in Pueraria radix. METHODS：LC-MS/MS was adopted to detect 14 kinds of isaflavones in 14 batches of P. radix （P. radix：PL-1 to PL-7，P. thomsonii：PT-1 to PT-7）. The determination was performed on Extend C18 with mobile phase consisted of methanol-water （gradient elution）at the flow rate of 0.8 mL/min. The column temperature was set at 22 ℃. The sample size was 5 μL. Ion source was ESI source. The detection mode was negative ion detection. Scanning mode was MRM with jet voltage of -4 500 V；ion source temperature was set at 600 ℃，and atomization gas was 60 psi. The auxiliary gas was 60 psi，collision gas was 7 psi，air curtain gas was 30 psi. SIMCA 13.0 software wasused for cluster analysis of above batches. RESULTS：The linear range of 14 kinds of isoflavones ranged 10-1 000 ng/mL（puerarin of 10-5 000 ng/mL，r>0.990 0）. RSDs of precision，stability and reproducibility tests were all lower than 5%. The recoveries were 95%-105%（RSD were 0.8%-4.5%，n=6）. The total content of isoflavones were different significantly between P. radix and P. thomsonii. The contents of isoflavones in P. radix from different origins were different significantly. Among 14 kinds of isoflavones，the content of puerarin was the highest. Results of cluster analysis showed that 14 batches of P. radix could be clustered into 4 categories，including PL-2 as Ⅰcategory，PL-3 and PL-4 as Ⅱcategory，PL-5，PL-6 and PL-7 as Ⅲcategory，other as Ⅳcategory. CONCLUSIONS：The method is simple and reproducible. It can be used for content determination of 14 kinds of isoflavones in P. radix and quality control.KEYWORDS Pueraria radix；Pueraria thomsonii；Isoflavones；LC-MS/MS；Content determination 葛根和粉葛分別为豆科植物野葛[Pueraria lobata（Willd.）Ohwi]和甘葛藤（P.thomsonii Benth.）的干燥根，在中医用药史上二者均作为葛根（P. radix）药材使用，具有解肌退热、透发麻疹、生津止渴、升阳止泻的作用[1]。
保健食品中黄酮类功效成分的LC-MS检测技术研究目的：采用液质联用技术对保健食品中黄酮类功效成分进行快速筛选,建立准确可靠的定性定量方法,为保健食品的质量标准研究提供一定的研究思路和方法示范。
所建立的方法可应用于生产企业,也可应用于检测、监管机构,从而更好地对保健食品进行质量控制和监管,打击假冒伪劣商品,规范保健食品市场。
方法：对13个含银杏叶保健食品、13个含大豆异黄酮保健食品、葛根枳棋软胶囊和蜂胶液进行示范性研究。
1、保健食品样品收集。
从市面上收集具有代表性的不同批号、不同厂家、不同包装、不同剂型同一主要原料的保健食品,按照原标准《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)收载项下的质量评价方法进行检测,判断是否为合格产品。
2、采用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱法快速筛查保健食品中多种黄酮类化合物。
分别对色谱柱、流动相体系、数据采集模式、离子源参数和碰撞能量等参数进行优化,并通过与对照品对比、数据库匹配及文献数据分析,明确保健食品中所含的黄酮类成分。
3、采用超高效液相色谱-三重四极杆质谱法建立同时测定保健食品中多种黄酮类化合物的定量分析方法。
采用负离子电喷雾选择反应监测(SRM)模式,分别对管镜补偿电压、碰撞能量和定量离子对等参数进行优化,同时进行检测限、定量限、线性范围、精密度、重复性、稳定性和加样回收率等方法学考察。
4、以相关功效成分及其含量为指标,对不同来源含银杏叶保健食品和含大豆异黄酮保健食品的差异进行比较研究。
5、对所检测的每个黄酮类化合物的裂解途径进行解析,总结黄酮类化合物电喷雾质谱(ESI-MSn)特征裂解规律,为建立黄酮类成分目标物的精确分子量、二级MS2质谱图的数据库及一定色谱条件下保留时间的数据库奠定基础。
结果：1、参照原质量标准方法进行检测,市场上部分保健食品的功效成分含量未达到企业标准中功效成分的标示量。
2、采用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱法快速筛查了13个含银杏叶保健食品中16种黄酮类化合物、13个含大豆异黄酮保健食品中6种异黄酮类化合物、葛根枳棋软胶囊中20种黄酮类化合物及蜂胶液中16种黄酮类化合物。
