代谢控制发酵-第五章代谢控制发酵育种的基本技术

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代谢控制发酵

磷酸盐调节(高于10mmol/L抑制许多抗生素合成)
A抑制酶的作用；B导致细胞能荷变化；C竞争某些金属离子的作用。
代谢工程
• 代谢网络理论：
将细胞的生化反应以网络整体来考虑，而不是孤立地来考虑。将代谢网络分流处的代谢产物称为节点，对终产物合成起决定作用的少数节点称主节点。根据节点下游分支的可变程度，节点分为柔性、半柔性和刚性三类。 1.改变代谢途径 2.扩展代谢途径 3.转移或构建新的代谢途径
1.改变代谢途径
• 改变分支途径流向，阻断其他产物合成，提高目标产物产量。 ①加速限速反应
如：头孢霉素C的代谢工程菌的构建。青霉素N积累，下一酶克隆、导
入、产量上升25％；
②改变分支途径流向
提高目的产物支路的酶活性，占据优势、提高产量；
③构建代谢旁路
将抑制物分解或转化成影响小的其他物质；如：乙酸→乙醇（乳酸）。
3.菌种遗传特性的改变
• 抗反馈调节突变株；
抗反馈调节突变株是指一种对反馈抑制不敏感或对阻遏有抗性的组成型菌株，或兼而有之的菌株。如苏氨酸发酵：
• 组成型突变株； • 抗性突变株。
次级代谢与次级代谢调节
• 主要包括：抗生素、刺激素、生物碱、维生素、色素、毒素等。 1.初级代谢和次级代谢
初级代谢：与生物生存有关的，涉及能量产生和能量消耗的代谢类型。生存必需；始终产；不同种，相同；环境敏感性小；酶专一。次级代谢：某些生物为避免某种代谢物积累造成不利作用而产生的一类有利生存的代谢。并非必需，但有一定价值；某一时产；不同种，不同；受环境敏影响大；酶专一性不强。
2.次级代谢的调节类型
①酶合成的诱导调节有些酶也是诱导酶，以底物或底物类似物（内源、外源）为诱导剂。 ②反馈调节次级代谢物的自身反馈抑制和反馈阻遏

《代谢控制和育种》课件

代谢控制与育种目标的实现
1
代谢控制技术在育种过程中具有重要的应用价值，可以帮助育种家实现更高效的育种目标。
2
通过代谢控制技术，可以缩短育种周期、提高育种效率、降低育种成本，为现代农业的发展提供有力支持。
3
代谢控制技术还可以与其他育种技术相结合，如基因编辑、基因转移等，进一步提高育种水平，为人类创造更多的价值。
基因组学在育种中的应用
基因组学研究植物或动物的整个基因组，帮助科学家了解基因的结构和功能，以及基因之间的相
互作用。
通过基因组学研究，科学家可以发现与特定性状相关的基因，并利用这些信息来预测和选择具有
所需性状的个体。
基因组学还可以用于研究植物或动物的进化过程，以及不同品种之间的亲缘关系，为育种提供更
多选择和可能性。
代谢组学在育种中的应用
代谢组学研究生物体内代谢产物的组成和变化，帮助科学家了解生物体的代谢过程和生理状态。
通过代谢组学研究，科学家可以发现与特定性状相关的代谢物，并利用这些信息来预测和选择具有所需性状的个体。
代谢组学还可以用于研究植物或动物在不同环境条件下的适应性，以及不同品种之间的代谢差异，为育种提供更多选择和可能性。
04 代谢控制育种的未来展望
代谢控制育种的发展趋势
基因编辑技术的广泛应用
随着基因编辑技术的发展，代谢控制育种将更加精准和高效，能够更快地培育出具有优良性状的新品种。
智能化育种
利用大数据和人工智能技术，实现代谢控制育种的智能化，提高育种效率和准确性。
生物信息学在育种中的应用
通过生物信息学手段，解析基因组、转录组和蛋白质组等多层次信息，为代谢控制育种提供更全面的数据支持。

代谢控制发酵育种的基本技术1

4
诱变育种的程序：诱变育种的程序：
出发菌种纯化细胞或孢子悬浮液制备诱变剂量确定活细胞计数诱变剂处理活细胞计数中间培养目的突变株分离初筛复筛生产性试验
5
诱变育种中的几个问题：
出发菌株的选择：对诱变剂敏感，变异幅度大。细胞悬浮液的制备：同步培养，菌龄，浓度。诱变剂的选择及处理方法：中间培养：克服表型延迟
9
④ ⑤ ⑥
⑦
对霉菌发芽孢子有选择性杀死作用。亚硫酸法对霉菌发芽孢子有选择性杀死作用。杀死野生型酵母细胞。制霉菌素法杀死野生型酵母细胞。过滤法：适用于丝状真菌。野生型呈丝状，过滤法：适用于丝状真菌。野生型呈丝状，缺陷型孢子不能萌发差别杀菌法：芽孢较营养细胞耐热。差别杀菌法：芽孢较营养细胞耐热。
6
突变菌株的分离：突变菌株的分离
1 营养缺陷型菌株的分离 2 抗性突变株的分离 3 温度敏感型突变株的分离 4 产量性状突变株的分离
7
1，营养缺陷型菌株的分离：，营养缺陷型菌株的分离
1.1营养缺陷型的浓缩营养缺陷型的浓缩目的：目的：选择性地除去经中间培养后群体细胞中的野
生型细胞，从而提高缺陷型细胞的分离和检出效率。生型细胞，从而提高缺陷型细胞的分离和检出效率。
29
30
4 再生
融合的原生质体必须使胞壁再生，恢复原来的状融合的原生质体必须使胞壁再生，态再生培养基为完全培养基，再生培养基为完全培养基，含Ca2+，Mg2+，并须加入渗透压稳定剂。加入渗透压稳定剂。
31
5 融合子的选择
原生质体融合会产生两种情况：原生质体融合会产生两种情况：
真正的融合：即产生杂合双倍体或单倍重组体。真正的融合：即产生杂合双倍体或单倍重组体。短暂的融合：即产生异核体。短暂的融合：即产生异核体。

微生物代谢控制发酵第五章

PGE3、就不能合成，免疫、心脑血管生殖内分泌等系统就会出现异常，发生紊乱，从而引起高血脂、高血压、血栓症、动脉粥样硬化、风湿病、糖尿病、皮肤粗糙、加速衰老化等一系列疾病。特别是对脑组织的生长发育相当重要，因为脑重量的20%是由必需脂肪酸组成的。
γ-亚麻酸 Gamma linolenic Acid （十八碳三烯酸，维生素F，Octadecatrienoic Acid，GLA）
诱变育种（breeding by induced mutation）
指通过人工方法处理均匀而分散的微生物细胞群，在促进其突变率显著提高的基础上，采用简便、快速和高效的筛选方法，从中挑选出少数符合目的突变株的过程。
在此过程中，诱变和筛选是两个主要环节。
诱发突变（induced mutation）物理因素
柠檬酸为无色晶体，常一分子结晶水。易溶于水和乙醇。具有多元羧酸的性质，易与金属离子形成络合物。
柠檬酸与酒石酸、苹果酸一样，广泛用作食品的酸味剂。在食品和医学上用作多价螯合剂，也是化学中间体，临床上，用柠檬酸作矫味剂。许多柠檬酸盐具有特定的生理活性，如：枸橼酸铁铵（抗贫血药），枸橼酸铋钾（抗溃疡药）等。柠檬也可用于与碱性药物成盐，成为溶于水的制剂，如枸橼酸哌嗪（抗蠕虫药）。
用以柠檬酸为唯一碳源的培养基，选择菌体不生长或生长微弱的突变株。
柠檬酸发酵优良突变株的筛选
6、选育某些氨基酸缺陷的突变株如：谷氨酸缺陷型、精氨酸缺陷型等
7、选育抗药性突变株如：寡霉素抗性、萘啶酮酸抗性等
8、选育强化CO2固定反应的突变株如：将磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因
克隆到高拷贝载体上，使之扩增
1、柠檬酸的发酵机制
2C6H12O6 + 3O2

氨基酸代谢控制发酵机制及育种策略

氨基酸代谢控制发酵机制及育种策略
徐庆阳
中国氨基酸技术服务中心
目录
• • • • • Chapter1 Chapter2 Chapter3 Chapter4 Chapter5 代谢机制理论基础 L-谷氨酸 L-亮氨酸 L-缬氨酸 L-异亮氨酸
Chapter1 代谢机制理论基础
氨基酸发酵机制
• 在一般情况下，微生物细胞只合成本身需要的中间代谢产物，严格防止氨基酸、核苷酸等中间物质的大量积累。当氨基酸或核苷酸等物质进入细胞后，微生物细胞立即停止该物质的合成，一直到所供应的养料消耗到很低浓度，微生物细胞才能重新开始进行该物质的合成。微生物细胞中这种调节控制作用主要靠两个因素，即参与调节的有关酶的活性和酶量
积累反馈抑制（Cumulative feedback inhibition）
• 在积累反馈抑制中，每一个最终产物只单独地、部分地抑制共同步骤的第一个酶，并且各最终产物的抑制作用互不影响。所以几个最终产物同时存在时，它们的抑制作用是积累的
顺序反馈抑制(Sequential feedback inhibition)
• 参与氨基酸生物合成的关键酶主要有12种：①磷酸果糖激酶；②柠檬酸合成酶；③N-乙酰谷氨酸激酶；④鸟氨酸转氨基甲酰酶；⑤天冬氨酸激酶；⑥高丝氨酸脱氢酶；⑦苏氨酸脱水酶；⑧α-乙酰乳酸合成酶；⑨DAHP（2-酮-3-脱氧 -D-阿拉伯糖型庚糖酸-7-磷酸）合成酶；⑩分支酸变位酶； 11预苯酸脱水酶；12预苯酸脱氢酶。
入谷氨酸生成期，为了大量生成、积累谷氨酸，最好没有异柠檬酸裂解酶催化反应，封闭乙醛酸循环
谷氨酸生物合成的调节机制
• 优先合成与反馈调节
• 糖代谢的调节
• 氮代谢的调节

5第五章代谢调控育种

⑷利用营养缺陷型回复突变株或条件突变株的方法，解除终产物对关键酶的调节；
⑸应用遗传工程技术，创造理想微生物（即构建目的工程菌株）。
此外，发酵条件如pH值、NH3的供应、溶氧水平、营养浓度控制及表面活性剂的使用等也非常重要。
一. 切断支路代谢
1. 营养缺陷突变株的应用
营养缺陷型即菌株发生基因突变，合成途径中某一步骤发生缺陷，丧失了合成某些物质的能力，必须在培养基中添加该营养物质才能生长。
第五章微生物代谢控制育种
第一节代谢控制育种的基础
代谢控制发酵理论的建立
代谢控制发酵理论最开始是应用于氨基酸高产菌株的选育中；随后，核苷类物质发酵生产菌也以代谢控制理论去选育，并奋起直追成为后起之秀。
随着研究的深入，代谢控制发酵理论的作用，已由野生型菌株的发酵向高度人为控制的发酵转移，由依赖于微生物分解代谢的发酵向依赖于生物合成代谢的发酵，即向代谢产物大量积累的发酵转移。
一个菌株经过突变和回复突变后，某一结构基因编码的酶会经历失活→恢复活性的过程，但酶的调节部位的结构常常并没有恢复。所以经过此过程后，该酶的反馈抑制被解除或削弱。因此可以利用营养缺陷型的回复突变来获得解除反馈抑制从而提高产量的菌株。
例如，先将金霉素生产菌绿链霉菌诱变成蛋氨酸缺陷型，然后再回复突变成原养型，结果其中有85% 的回复突变株的金霉素产量提高了1.2~3.2倍。
通过选育某些营养缺陷型或结构类似物抗性突变株以及克隆某些关键酶的基因，也可以使目的产物前体的合成增加，从而有利于目的产物的大量积累。
1. 在分支合成途径中，切断控制共用酶的非目的终产物的分支合成途径，增多目的产物的前体，使目的产物的产量提高。
在谷氨酸棒状杆菌、北京棒状杆菌、黄色短杆菌、大肠杆菌等微生物中，Lys、Thr、Met的合成关键酶是天冬氨酸激酶，该酶受Lys、Thr的协同反馈抑制，即天冬氨酸激酶在Lys或Thr单独存在时不受抑制，仅当两者同时过量时才引起抑制作用。因此，在Thr限量培养时，即使Lys过剩，也能进行由天冬氨酸生成天冬酰磷酸的反应（即第一步反应）。

第五章微生物的代谢与发酵控制

高丝氨酸脱氢酶
中间产物Ⅰ高Biblioteka 氨酸中间产物Ⅱ甲硫氨酸
苏氨酸
赖氨酸
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人工控制黄色短杆菌的代谢过程生产赖氨酸
天冬氨酸
人工诱变的菌种不能产生
高丝氨酸脱氢酶
天冬氨酸激酶
中间产物Ⅰ
高丝氨酸
不能合成
甲硫氨酸
苏氨酸
中间产物Ⅱ
赖氨酸
可以大量积累
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一、发酵过程控制
微生物发酵的过程控制应该从两个方面来实现：
（二）发酵过程需要过程控制
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（三）发酵过程控制的基本途径
1. 发酵原料的控制 2. 发酵菌体的控制 3. 发酵条件的控制
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二、微生物代谢调节与发酵控制实例分析谷氨酸棒状杆菌合成谷氨酸的途径
葡萄糖
中间产物
a－酮戊二酸
NH4＋
谷氨酸
谷氨酸脱氢酶
抑制
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菌种的选择
谷氨酸发酵最重要的无疑就是选择菌种了，应该选育什么样的谷氨酸棒状杆菌作为菌种呢?
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1.好氧呼吸
以分子态的氧作为最终电子受体的生物氧化过程。
彻底氧化，放能最多。
2.厌氧呼吸
在无氧的条件下，微生物以无机氧化物作为最终电子受体的生物氧化过程。不需要氧气，放能多。
3.发酵作用电子供体是有机化合物，而最终电子受体也是有机化合物的生物氧化过程。不彻底氧化，放能最少。
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（二）多菌种的协同发酵
多菌种协同发酵的特点： 1. 多菌种的协同作用 2. 发酵界面复杂且产品风味多样化 3. 产品的区域性特征显著 4. 设备投入少，生产灵活性强 5. 发酵机理不清，生产经验性强

《代谢控制和育种》课件

了解育种的基本概念，以及如何通过育种来改善作物品质和提高农业生产。
代谢控制
1
代谢通路的类型
介绍不同类型的代谢通路，如合成代谢、分解代谢和转运代谢，以及它们在植物生理中的重要性。
2
代谢通路的调节机制
探讨植物中代谢通路的调控机制，包括基因调控、酶活性调节以及信号传导。
3
代谢控制在农业生产中的应用
介绍利用代谢控制技术改良作物特性以提高农业生产效益的实际案例。
探讨科学家将在代谢控制和育种领域继续研究的方向，以推动农业的可持续发展。
育种
基础遗传学知识
了解育种背后的基本遗传学原理，如基因传递、基因型和表型。
育种方法的分类和特点
探讨不同育种方法的优缺点，如自交育种、杂交育种和转基因技术。
新一代育种技术与应用
介绍新兴的育种技术，如基因编辑和组织培养，以及它们在农业领域的前景。
实例分析
代谢控制与作物品质改良
通过代谢控制技术优化植物的营养组成、香味和色泽，提供更高品质的农产品。
《代谢控制和育种》PPT 课件
欢迎来到《代谢控制和育种》PPT课件。通过本课件，我们将带你深入了解代谢控制和育种领域的基本原理、调节机制以及最新的育种技术与应用。让我们开始探索这个引人入胜的话题吧！
概述
代谢控制的基本原理
探索植物代谢通路的类型和调节机制，揭示代谢控制在植物生长中的重要作用。
育种的目的和意义
育种方法在病虫害抗性育种中的应用
探索如何利用育种方法培育具有抗病虫害特性的作物品种，提高农业生产的稳定性。
新一代育种技术对粮食生产的影响
分析新兴育种技术对粮食产量、品质和可持续性的影响，展望农业未来的发展方向。

代谢调控育种(袁丽红)

通过酶的定位控制酶与底物的接触
• 真核微生物酶定位在相应细胞器上；细胞器各自行使某种特异的功能；
• 原核微生物在细胞内划分区域集中某类酶行使功能：与呼吸产能代谢有关的酶位于膜上；蛋白质合成酶和移位酶位于核糖体上；同核苷酸吸收有关的酶在G-菌的周质区。
通过酶的定位控制酶与底物的接触
控制代谢物流向( 通过酶促反应速度来调节)
可逆反应途径由同种酶催化，可由不同辅基或辅酶控制代谢物流向。例如：两种Glu脱氢酶：以NADP为辅基以NAD为辅基 Glu合成 Glu分解
通过调节酶的活性或酶的合成量。
关键酶（调节酶）: 某一代谢途径中的第一个酶或分支点后的第一个酶。
①粗调：调节酶的合成（酶合成诱导、酶合成阻遏） ②细调：调节现有酶分子的活性（催化活力）
一、正常微生物代谢调节与控制－自我调节
• 微生物有着一套可塑性极强和极精确的代谢调节系统，以保证上千种酶能正确无误、有条不紊地进行极其复杂的新陈代谢反应。
正常的微生物代谢调控方式
• 调节细胞膜对营养物质的渗透性 • 通过酶的定位控制酶与底物的接触 • 控制代谢物流向－－最主要的调节
1.控制营养物质透过细胞膜进入细胞如：只有当速效碳源或氮源耗尽时，微生物才合成迟效碳源或氮源的运输系统与分解该物质的酶系统。
E
二氢吡啶二羧酸 R 六氢吡啶二羧酸二氨基庚二酸
天冬氨酸 4-磷酸天冬氨酸
E,R
天冬氨酸半醛
同型丝氨酸 E,R
E,R
E 同型丝氨酸磷酸苏氨酸 E,R 2-酮丁酸
O-琥珀酰同型丝氨酸胱硫醚 R 同型半胱氨酸 R 甲硫氨酸
赖氨酸
异亮氨酸
合作反馈抑制——cooperative feedback inhibition

第五章发酵机制与代谢调控

高级醇（higher alcohol）

（1）杂醇油的生成杂醇油是C原子数大于2的脂肪族醇类的统称，主要由正丙醇、异丁醇（2-甲基-1-丙醇）、异戊醇（3-甲基-1-丁醇）和活性戊醇（d-戊醇、2-甲基-1丁醇）组成。氨基酸氧化脱氨作用：早在1907年Ehrlish提出了高级醇的形成来自氨基酸的氧化脱氨作用。后来 Sentheshani Nuganthan（1960）根据以啤酒酵母无细胞抽出液研究从氨基酸形成高级醇的机理，提出以下途径：转氨基是在α-酮戊二酸间进行。天冬氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸等均有此转氨作用。根据此机制，由缬氨酸产生异丁醇、异亮氨酸产生活性戊醇、酪氨酸产生酪醇，苯丙氨酸产生苯乙醇等。
3 酒精发酵中副产物的形成主产物（product）：酒精（alcohol）
副产物（by product ）：二氧化碳（carbon dioxide）甘油（glycerol）乙醛（acetaldehyde）琥珀酸（ succinic acid ）乙酸（acetic acid）酯（ester）
（1）好氧性发酵(aerobic fermentation)：在发酵过程中需要不断地通入一定量的无菌空气，如利用黑曲霉进行柠檬酸的发酵、利用棒状杆菌进行谷氨酸的发酵、利用黄单孢菌进行多糖的发酵等等。
（2）厌氧性发酵(anaerobic fermentation) ：在发酵过程中不需要供给无菌空气，如利用乳酸杆菌引起的乳酸发酵、梭状芽孢杆菌引起的丙酮、丁醇发酵等等。（3）兼性发酵 (facultative fermentation) ：酵母菌是兼性厌氧微生物 (facultative aerobe) ，它在缺氧条件下进行厌气性发酵积累酒精，而在有氧条件下则进行好氧发酵，大量繁殖菌体细胞。

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一、诱变育种
遗传稳定性
Ø遗传稳定性测定：在无选择压力的完全固定培养基及液体培养基中连续不断传代，淘汰不稳定的突变株，保存能稳定遗传的目的突变株
高通量筛选
二、原生质体融合
原生质体
Ø原生质体：植物或微生物细胞去掉壁以后的内含物
ü 无细胞壁，为圆球形 ü 对环境敏感：渗透压，震荡，离心，易溶菌 ü 有鞭毛，而不能运动 ü 不被噬菌体感染（因为失去吸附位点）
ü 移码突变：基因中插入或者缺失一个或几个碱基对，会使DNA的阅读框架（读码框）发生改变，导致插入或缺失部位之后的所有密码子都跟着发生变化，结果产生一种异常的多肽链
谢谢！
Ø 菌龄、再生时的温度、溶菌酶用量和溶壁时间等因素都会影响原生质体的再生
二、原生质体融合
融合子筛选
Ø 利用营养缺陷型作为遗传标记选择融合子 ü融合的双亲株带有不同缺陷型标记, 融合后采用基本
培养基可以很容易检出融合子 Ø 利用抗药性作为遗传标记选择融合子 ü 融合的双亲株对带有不同抗药性标记，利用这种差异
基本原则
Ø选择简便有效的诱变剂 Ø挑选优良的出发菌株 Ø处理单细胞或单孢子悬液 Ø选用最适的诱变剂量 Ø充分利用复合处理的协同效应 Ø利用和创造形态、生理与产量间的相关指标 Ø设计高效筛选方案 Ø创造新型筛选方法
一、诱变育种
出发菌株
Ø出发菌株的来源 ü野生型菌株 ü从生产中选育的自发突变菌株 ü诱变获得的高产菌株 Ø出发菌株的选择标准 ü具有有利性状（如高产、生长速度快、营养
Ø化学诱变剂：烷化剂，碱基类似物，抗生素等化学药物
一、诱变育种
诱变育种步骤
Ø诱变（随机） ü选用合适的诱变剂和诱变剂量处理大量均匀、
分散的微生物细胞，以引起绝大多数细胞致死的同时，使存活个体中的突变频率大大提高 Ø筛选（定向） ü设计有效的筛选方法，将少量正变株中的优良菌株挑选出来
一、诱变育种
ü 通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的
三、基因工程育种
基因突变
Ø 基因突变是指由于DNA碱基对的置换、增添或缺失而引起的基因结构的变化，亦称点突变
ü 碱基置换突变：由一个错误的碱基对替代一个正确的碱基对的突变叫碱基置换突变。例如在DNA分子中的 GC碱基对由CG或AT或TA所代替，AT碱基对由TA或GC或 CG所代替
二、原生质体融合
原生质体制备
Ø原生质体的制备主要是在高渗压溶液中加入细胞壁分解酶，将细胞壁分离剥离，结果剩下由原生质膜包住的类似球状的细胞，它保持原细胞的一切活性
Ø在放线菌和细菌中，制备原生质体主要采用溶菌酶；酵母和霉菌一般可用蜗牛酶或纤维素酶等
二、原生质体融合
原生质体制备
Ø 菌体的前处理：如细菌加入亚抑制剂量的青霉素。 Ø 菌体的培养时间：一般选择增殖期的菌体 Ø 酶浓度：对于不同种属的微生物，不仅对酶的种类要
要求粗放、标记明显等） ü对诱变剂敏感
一、诱变育种
菌悬液的制备
Ø同步培养：细胞处于同一生长阶段 Ø菌龄：对诱变剂最敏感时期 ü细菌、酵母菌取对数生长期细胞 ü真菌、放线菌取刚成熟的孢子或经培养脱离
静止期的孢子 Ø选用单细胞悬液（均匀、分散） ü使每个细胞能均匀接触诱变剂 ü减少表型延迟现象（诱变后性状的分离及退
遗传标记制作 Ø筛选的方法 ü高于临界浓度的平板进行分离 ü梯度平板法
一、诱变育种
梯度平板法
抗性突变株筛选
加入不含抗性药物的底层
加入含抗性药物的上层
抗性菌落
敏感菌落
一、诱变育种
复筛
Ø复筛：对突变株的生产性能做比较精细的测定 Ø复筛是诱变育种的重要一环，需要对突变株发
酵培养基的组成（包括碳源、氮源、无机盐、生长因子等）、种子培养、接种量、培养温度、培养时间、pH值、供氧等参数进行精确地测定，找出最佳发酵条件，以便放大
Ø 基因工程育种：运用基因工程技术进行定向育种的新技术
三、基因工程育种
基因导入（பைடு நூலகம்程菌）
Ø 目的基因的获得 Ø 载体的选择与制备 Ø 目的基因与载体连接成重组重组体 Ø 转化或转染受体细胞 Ø 重组菌的筛选及目的基因的表达
三、基因工程育种
基因敲除
Ø 基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术
二、原生质体融合
Ø原生质体融合：通过人为方法,使遗传性状不同的两个细胞的原生质体融合,继而遗传重组, 借以获得兼有双亲性状,遗传性稳定的融合子的过程，是基因重组育种的一种重要方法
甲生长快、产量低
乙生长慢、产量高
多基因重组
生长快、产量高
二、原生质体融合
育种步骤
Ø标记菌株的筛选和稳定性验证 Ø原生质体制备 Ø等量原生质体加聚乙二醇促进融合 Ø涂布于再生培养基，再生出菌落 Ø选择性培养基上划线生长，分离验证，挑取
化现象）
一、诱变育种
诱变剂
Ø高效，简便 Ø物理诱变剂：频度低、大损伤，难修复，且
操作简便 Ø化学诱变剂：频度高，点突变，易回复突变，
操作麻烦
常压室温等离子体
（Atmospheric and Room Temperature Plasma, ARTP ）诱变系统
一、诱变育种
诱变剂量
Ø常以杀菌率来表示相对剂量（剂量-存活率曲线）
突变株筛选
Ø初筛（以量为主）、简便、快速 ü利用形态变异：需预先测定形态与产量的相
关性 ü根据平板颜色反应直接挑选
透明圈法（蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶）抑菌圈法（抗生素）变色圈法（柠檬酸）、显色圈（氨基酸）沉淀圈法（外毒素） Ø复筛（以质为主，定量测定） Ø遗传稳定性
一、诱变育种
营养缺陷型筛选
一、诱变育种
中间培养
Ø中间培养：将一定量的诱变后菌液接入完全液体培养基中培养过夜
Ø目的：克服表型延迟 Ø表型延迟：表型的改变落后于基因型改变的
现象 ü分离性延迟：突变的基因经DNA复制和细胞分
裂后变成纯合状态，表型才能表现出来。 ü生理性延迟：由杂合状态变为纯合状态，突
变表型仍不能表现出来
一、诱变育种
二、原生质体融合
基因组重排
三、基因工程育种
Ø 基因工程：用人为的方法将所需的某一供体生物的遗传分子提取出来，在离体条件下进行切割，获得代表某一性状的目的基因，把该目的基因与作为载体的分子连接起来，然后导入某一受体细胞中，让外来的目的基因在受体细胞中进行正常的复制和表达，从而获得目的产物或性状
即可对融合子进行选择 Ø 应用灭活原生质体作为遗传标记选择融合子 ü 在原生质体融合前，对单亲或双亲原生质体进行灭活
标记，使其丧失再生的能力，与另一亲株融合后，融
合子损伤互补存活
二、原生质体融合
Ø 原生质体融合的优点： ü 由于原生质体融合选用了已知性状的供体菌作为亲本，
因此，不论在方向性还是自觉性方面，均比诱变育种前进了一大步 ü 利用原生质体融合往往还可以消除某一菌株在经过长期诱变处理后所出现的产量上升缓慢的现象，因此，它是一种重要的育种手段
营养缺陷型筛选
Ø 诱变剂处理 Ø 中间培养：CM或SM培养基，培养过夜，克服表型延迟 Ø 淘汰野生型：在诱变后的存活个体中，营养缺陷型的比例一般较低。
通过以下的抗生素法或菌丝过滤法就可淘汰为数众多的野生型菌株即浓缩了营养缺陷型 ü 抗生素法：有青霉素法和制霉菌素法等数种。青霉素法适用于细菌，青霉素能抑制细菌细胞壁的生物合成，杀死正在繁殖的野生型细菌，但无法杀死正处于休止状态的营养缺陷型细菌 ü 菌丝过滤法：适用于进行丝状生长的真菌和放线菌。其原理是：在基本培养基中，野生型菌株的孢子能萌发成菌丝，而营养缺陷型的孢子则不能。通过过滤就可除去大部分野生型，保留下营养缺陷型 Ø 检出缺陷型：夹层培养法、限量补充培养法、逐个检出法和影印接种法
Ø DHA：二十二碳六烯酸 Ø 生产菌株：裂殖壶菌，以葡萄糖为碳源 Ø 黑曲霉，能够利用淀粉 Ø 经原生质体融合，获得融合菌株M-3
融合子M-3 利用淀粉的特性
融合子M-3 油脂气相色谱图 M-3 培养1 代和5 代干重和油脂含量的比较
二、原生质体融合
基因组重排
Ø基因组重排（Genome shuffling）：也称基因组改组，是微生物育种的新技术。基因组重排只需在进行首轮改组之前，通过经典诱变技术获得初始突变株，然后将包含若干正突变的突变株作为第一轮原生质体融合的出发菌株，此后经过递推式的多轮融合，最终使引起正性突变的不同基因重组到同一个细胞株中
Ø基本培养基（MM, minimal medium）：某野生型能生长的最低成分的组合培养基
Ø完全培养基（CM, complete medium）：各种营养缺陷型能生长的天然或半组合培养基
Ø补充培养基（SM, supplemental medium）：相应营养缺陷型能生长的组合或半组合培养基
一、诱变育种
原生质体融合
聚乙二醇（PEG）－脱水剂助融剂
Ca2+－提高融合频率
二、原生质体融合
原生质体再生
Ø 原生质体再生：原生质体重新长出细胞壁，恢复完整的细胞形态结构
Ø 不同微生物的原生质体的最适再生条件不同，甚至一些非常接近的种，最适再生条件也往往有所差别，如再生培养基成分及培养温度等。但最重要的一个共同点是都需要高渗透压
求不同，就是对酶的浓度也有差异。另外，最佳酶浓
度还随不同的生长期的菌体而变化 Ø 酶处理温度：20-40℃ Ø pH值 Ø 渗透压稳定剂：等渗透压在原生质体制备中，不仅起
到保护原生质体免于膨裂，而且还有助于酶和底物的
结合，渗透压稳定剂多采用甘露醇，山梨醇，蔗糖等

代谢控制发酵-第五章代谢控制发酵育种的基本技术

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