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第八章 工业微生物代谢控制育种

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《代谢控制和育种》课件

《代谢控制和育种》课件


代谢控制与育种目标的实现
1
代谢控制技术在育种过程中具有重要的应用价值 ，可以帮助育种家实现更高效的育种目标。
2
通过代谢控制技术，可以缩短育种周期、提高育 种效率、降低育种成本，为现代农业的发展提供 有力支持。
3
代谢控制技术还可以与其他育种技术相结合，如 基因编辑、基因转移等，进一步提高育种水平， 为人类创造更多的价值。
基因组学在育种中的应用
基因组学研究植物或动物的整个 基因组，帮助科学家了解基因的 结构和功能，以及基因之间的相
互作用。
通过基因组学研究，科学家可以 发现与特定性状相关的基因，并 利用这些信息来预测和选择具有
所需性状的个体。
基因组学还可以用于研究植物或 动物的进化过程，以及不同品种 之间的亲缘关系，为育种提供更
多选择和可能性。
代谢组学在育种中的应用
代谢组学研究生物体内代谢产物的组成和变化 ，帮助科学家了解生物体的代谢过程和生理状 态。
通过代谢组学研究，科学家可以发现与特定性 状相关的代谢物，并利用这些信息来预测和选 择具有所需性状的个体。
代谢组学还可以用于研究植物或动物在不同环 境条件下的适应性，以及不同品种之间的代谢 差异，为育种提供更多选择和可能性。
04 代谢控制育种的未来展望
代谢控制育种的发展趋势
基因编辑技术的广泛应用
随着基因编辑技术的发展，代谢控制育种将 更加精准和高效，能够更快地培育出具有优 良性状的新品种。
智能化育种
利用大数据和人工智能技术，实现代谢控制育种的 智能化，提高育种效率和准确性。
生物信息学在育种中的应 用
通过生物信息学手段，解析基因组、转录组 和蛋白质组等多层次信息，为代谢控制育种 提供更全面的数据支持。
代谢调控及育种

代谢调控及育种

代谢调控及育种从工业微生物育种史来看，诱变育种曾取得了巨大的成就，使微生物有效产物成百倍、乃致成千倍的增加。

但是诱变育种工作量繁重，盲目性大。

近年来由于应用生物化学和遗传学原理，深入研究了生物合成代谢途径以及代谢调节控制的基础理论，人们不仅可进行外因控制，通过培养条件来解除反馈调节而使生物合成的途径朝着人们所希望的方向进行，即实现代谢控制发酵；同时还可进行内因改变，通过定向选育某种特定的突变型，以达到大量积累有益产物的目的，即所谓代谢控制育种。

内因是变化的根据，所以改变微生物的遗传型往往是控制代谢的更为有效的途径。

代谢控制育种可以大大减少传统育种的盲目性，提高了效率。

代谢控制育种很快在初级代谢产物的育种中得到广泛的应用，成就也十分显赫，几乎全部氨基酸和多种核苷酸生产菌株都被打上了抗性或缺陷型遗传标记。

代谢调节控制育种通过特定突变型的选育，达到改变代谢通路、降低支路代谢终产物的产生或切断支路代谢途径及提高细胞膜的透性，使代谢流向目的产物积累方向进行。

一、克服反馈抑制和反馈阻遏的调控克服反馈调节，可从以下两方面着手：降低末端产物浓度；应用抗反馈突变株1、降低末端产物浓度（1）营养缺陷型的利用A、在直线式生物合成途径中营养缺陷型突变株的代谢流受阻，末端产物减少，解除了末端产物参与的反馈调节，可使代谢途径中的某一中间产物积累。

一个典型的例子是谷氨酸棒状杆菌的精氨酸缺陷型突变株进行鸟氨酸发酵(，由于合成途径中酶6(氨基酸甲酰转移酶)的缺陷，必须供应精氨酸和瓜氨酸，菌株才能生长，但是这种供应要维持在亚适量水平，使菌体达到最高生长，又不引起终产物对酶② (N—乙酰谷氨酸激酶)的反馈抑制，从而使鸟氨酸得以大量分泌累积。

B、利用营养缺陷型积累分支代谢途径中的中间产物营养缺陷型突变导致协同反馈调节某一分支途径的代谢阻断，使这一分支途径的终产物不能合成。

若控制供应适量的这一终产物，满足微生物生长，将使合成代谢流向另一分支途径，有利于另一终产物的大量积累。

工业微生物的代谢调控和代谢产物

工业微生物的代谢调控和代谢产物

酵母菌只有在pH3.5～4.5（弱酸性）和厌氧
条件下才能进行正常的酒精发酵，称之为酵母菌 的第一型发酵。
1分子 葡萄糖 2分子 2×乙醇
EMP途径
2×丙酮酸
NAD+
NADH2
丙 酮
酸
关键酶 脱
羧
NAD+
NADH2 酶
2×CO2
乙醇脱氢酶
2×乙醛
乙醇发酵对环境条件的变化十分敏感
A.O2的作用
乙醇发酵需在厌氧条件下进行。如果变 成好氧条件，乙醇形成就停止，葡萄糖分解
合成代谢又称同化作用，是指在合成酶系
的催化下，由简单分子、 ATP形式的能量和还原力 一起，共同合成复杂的生物大分子的过程。
复杂分子
（有机物）
分解代谢 合成代谢
简单小分子 ATP [H]
一切生物，在其新陈代谢的本质上具有高度的 统一性和明显的多样性。
根据代谢过程中产生的代谢产物对生物体 的作用不同，可分为：
在有氧条件下，可经呼吸链的氧化磷酸化反应
产生6ATP；
在无氧条件下，则可还原丙酮酸产生乳酸或还
原丙酮酸的脱羧产物——乙醛还原成乙醇。
1、EMP途径（糖酵解）
EMP途径是多种微生物所具有的代谢途径，其产 能效率虽低，但其生理功能极其重要：
① 供应ATP形式的能量和NADH2形式的还原力； ② 是连接其他几个重要代谢途径的桥梁，包括三羧酸 循环（TCA）、HMP途径和ED途径等； ③ 微生物合成提供多种中间代谢物； ④ 通过逆向反应进行多糖合成。
生 产能（ATP） 物
氧
化 产还原力［H］
的
生 呼吸
功
物
能 产小分子中间代谢物 氧
化 无氧呼吸
代谢控制育种

代谢控制育种


（一）解除碳源调节突变株的选育
在次级代谢中，高浓度的葡萄糖对青霉素转 酰酶、链霉素转咪基酶和放线菌色素合成酶等 抗生素的关键酶均有分解阻遏作用。
在实际生产中，采用流加葡萄糖或应用混合 碳源可以控制中间代谢产物的积累，来减少不 利影响。
根本的解决办法是筛选抗碳源分解调节突变 株。
（一）解除碳源调节突变株的选育
CHO HH HO H H OH H OH
CHO H OHO H3C-O H H OH H OH
CH2OH
CH2OH
CH2OH
葡萄糖 2-脱氧－葡萄糖 3－O－甲基－ 葡萄糖
特 性： 1、结构与葡萄糖类似。
2、不被微生物代谢， 也不阻抑微 生物生长。
3、和葡萄糖 一样 会阻遏诱导酶的 合成，其 阻遏作用 甚至比葡萄糖还 要强。
2. 截流或减少终产物堆积
借
助营养缺陷型或采用渗漏缺陷型
3. 移去产物
借
助膜透性突变
抗反馈调节突变株获得途径
（一）回复突变引起的抗反馈调节突变株 （二）耐自身产物突变株选育 （三）抗终产物结构类似物突变株的选育 （四）累积前体和耐前体突变株的选育
（一）回复突变引起抗反馈调节突变株
正向突变：
微生物从野生型经自然突变或人工诱 变突变成有益突变型。
（1）初级代谢途径障碍性回复突变型
原养型 诱变 营缺型 诱变 原养型
酶活力恢复，但调节中心已发生改变， 不能与阻遏物结合，因此解除了反馈调节机制
例： 5-磷酸核糖焦磷酸
次黄嘌呤核苷
酶缺失 酸
酶活力恢复， 调节中心改变
琥珀酸腺核苷 黄嘌呤核苷酸
酸
腺核苷酸
鸟核苷酸
（2）次级代谢途径障碍性回复突变
工业微生物育种

工业微生物育种

工业微生物育种摘要：本文综述了工业微生物遗传育种的历史地位，介绍了遗传育种的方法和机理，并对其前景进行了展望。

关键词：工业微生物；遗传育种；方法；机理工业微生物育种也就是菌种改良，是运用遗传学原理和技术对某种具有特定生产目的的菌株进行改造，去除不良性质，增加有益新性状，以提高产品的产量和质量的一种育种方法[1]，使我们获得所需要的高产、优质和低耗的菌种，其目的是改良菌种的特性，使其符合工业生产的要求。

当前菌种选育的基本内容是根据菌种自然变异而进行的自然选育，以及用人工方法引起菌种变异，再按照工业生产的要求进行筛选来获得新的变种。

工业微生物遗传育种的主要方法有经典的自然选育和诱变育种技术，使菌种发生突变，存优去劣，这是目前普遍采用的方法，容易施行，易见成效；另一条途径是研究目的物的基因结构及基因调控、表达的方式，进行基因重组、转殖，使之高效表达。

工业微生物菌种的选育，不仅可提高目的物的产量，使目的物产量上百上千倍的提高，大大降低生产成本，提高经济效益，而且通过微生物菌种的选育，可简化工艺，减少副产品，提高产品质量，改变有效成分组成，甚至获得活性更高的新成分[2]。

本文主要从工业微生物遗传育种的历史地位、方法与技术、理论机理和发展前景综述了工业微生物育种的研究进展。

1 历史地位工业微生物菌种选育在发酵工业历史有着重要的地位，是决定发酵产品能否具有工业化价值及发酵过程成败与否的关键。

菌种选育技术的广泛应用为我们提供了各种类型的突变菌株，使得在食品工业、医药、农业、环境保护、化工能源、矿产开发等领域产生众多新的产品，促使传统产业的技术改造和新型产业的产生，同时使诸如抗生素、有机酸、维生素、色素、生物碱、激素以及其它生物活性物质等产品的产量成倍甚至成千万倍地增长，并且产品的质量也不断的提高。

如青霉素是于1929 年英国Flemirlg 发现的，当时的利用表面培养只能获得1~2U/ml 青霉素，经过数十载的诱变育种使其产量提高到目前的90000U/ml，以及由最初的纯度20%和得率35%提高到纯度99.9%和得率90%[3]，与此同时链霉素、土霉素、金霉素和氯霉素等抗生素也大规模的生产起来；在代谢控制育种的推动下使得产氨基酸、核苷酸、有机酸等次生代谢产物的高产菌株大批投入生产；由基因工程构建的工程菌株使得微生物次生代谢产物生产能力迅速提高，而且生产出微生物本生不能生产的外源蛋白质，如胰岛素、生长激素、单克隆抗体和细胞因子等等。

第八章__工业微生物代谢控制育种

第八章__工业微生物代谢控制育种


4.2 抗分解调节突变株的选育
1. 解除碳源调节突变株的选育
涂布诱 变后的 菌体
含有葡萄 糖的琼脂 平板
第一节 概论
1、初级代谢产物和初级代谢 2、次级代谢产物和次级代谢 3、初级代谢与次级代谢的关系
1.1 初级代谢产物和初级代谢
–1. 概念
• 微生物产生的对自身生长和繁殖必须的物质称为初级 代谢产物(可细分为中间产物和终产物)，产生这些物 质的代谢体系称为初级代谢(primary metabolism)。
• 一方面，细胞内合成代谢的产物不能分泌到胞外， 必然会产生反馈调节作用，影响发酵产物的生产量； • 另一方面，细胞外的营养物质不能进入细胞内，从 而影响产物的合成，造成产量下降。
第四节 代谢调节控制育种
代谢调节控制育种通过特定突变型的选育，达到改变代 谢通路、降低支路代谢终产物的产生或切断支路代谢途径 及提高细胞膜的透性，使代谢流向目的产物积累方向进行。
3.3 次级代谢产物氮源分解调节
1.定义：氮源分解调节主要指含氮底物的酶(如
蛋白酶、硝酸还原酶、酰胺酶、组氨酸酶和脲酶) 的合成受快速利用的氮源，尤其是氨的阻遏。
3.3 次级代谢产物氮源分解调节
2. 氮源分解调节的可能机制：
NH4+影响：
(1）pH值＋质子梯度 改变能量代谢 细胞壁物质和 结构的功能； (2)谷氨酰合成酶和 丙氨脱氢酶的合成； (3)高度磷酸化的核 苷，如ppGpp和 pppGpp可能通过 级联机制调节次级 代谢，而ppGpp等 受氨基酸过量的负 控制调节。
2. 分支代谢初级代谢 物反馈调节对次级代 谢的影响
(1) 次级途径和初级途径 具有共同的分叉中间体
实例2：色氨酸对杀假 丝菌素生物合成的 反馈调节
《代谢控制和育种》课件

《代谢控制和育种》课件

了解育种的基本概念，以及如何通过育种来改 善作物品质和提高农业生产。
代谢控制
1
代谢通路的类型
介绍不同类型的代谢通路，如合成代谢、分解代谢和转运代谢，以及它们在植物 生理中的重要性。
2
代谢通路的调节机制
探讨植物中代谢通路的调控机制，包括基因调控、酶活性调节以及信号传导。
3
代谢控制在农业生产中的应用
介绍利用代谢控制技术改良作物特性以提高农业生产效益的实际案例。
探讨科学家将在代谢控制和育种领域继续研 究的方向，以推动农业的可持续发展。
育种
基础遗传学知识
了解育种背后的基本遗传学原 理，如基因传递、基因型和表 型。
育种方法的分类和特点
探讨不同育种方法的优缺点， 如自交育种、杂交育种和转基 因技术。
新一代育种技术与应用
介绍新兴的育种技术，如基因 编辑和组织培养，以及它们在 农业领域的前景。
实例分析
代谢控制与作物品质改良
通过代谢控制技术优化植物的营 养组成、香味和色泽，提供更高 品质的农产品。
《代谢控制和育种》PPT 课件
欢迎来到《代谢控制和育种》PPT课件。通过本课件，我们将带你深入了解代 谢控制和育种领域的基本原理、调节机制以及最新的育种技术与应用。让我 们开始探索这个引人入胜的话题吧！
概述
代谢控制的基本原理
探索植物代谢通路的类型和调节机制，揭示代 谢控制在植物生长中的重要作用。
育种的目的和意义
育种方法在病虫害抗性育 种中的应用
探索如何利用育种方法培育具有 抗病虫害特性的作物品种，提高 农业生产的稳定性。
新一代育种技术对粮食生 产的影响
分析新兴育种技术对粮食产量、 品质和可持续性的影响，展望农 业未来的发展方向。
代谢调控育种(袁丽红)

代谢调控育种(袁丽红)


通过酶的定位控制酶与底物的接触
• 真核微生物酶定位在相应细胞器上；细胞器各 自行使某种特异的功能；
• 原核微生物在细胞内划分区域集中某类酶行使 功能： 与呼吸产能代谢有关的酶位于膜上； 蛋白质合成酶和移位酶位于核糖体上； 同核苷酸吸收有关的酶在G-菌的周质区。
通过 酶的 定位 控制 酶与 底物 的接 触
控制代谢物流向( 通过酶促反应速度来调节)
可逆反应途径由同种酶催化，可由不同辅基或辅酶控制代谢物流 向。 例如：两种Glu脱氢酶：以NADP为辅基 以NAD为辅基 Glu合成 Glu分解
通过调节酶的活性或酶的合成量。
关键酶（调节酶）: 某一代谢途径中的第一个酶或分支点后的第 一个酶。
①粗调：调节酶的合成（酶合成诱导、酶合成阻遏） ②细调：调节现有酶分子的活性（催化活力）
一、正常微生物代谢调节与控制－ 自我调节
• 微生物有着一套可塑性极强和极精确的代 谢调节系统，以保证上千种酶能正确无误、 有条不紊地进行极其复杂的新陈代谢反应。
正常的微生物代谢调控方式
• 调节细胞膜对营养物质的渗透性 • 通过酶的定位控制酶与底物的接触 • 控制代谢物流向－－最主要的调节
1.控制营养物质透过细胞膜进入细胞 如：只有当速效碳源或氮源耗尽时，微生物才合 成迟效碳源或氮源的运输系统与分解该物质的酶 系统。
E
二氢吡啶二羧酸 R 六氢吡啶二羧酸 二氨基庚二酸
天冬氨酸 4-磷酸天冬氨酸
E,R
天冬氨酸半醛
同型丝氨酸 E,R
E,R
E 同型丝氨酸磷酸 苏氨酸 E,R 2-酮丁酸
O-琥珀酰同型丝氨酸 胱硫醚 R 同型半胱氨酸 R 甲硫氨酸
赖氨酸
异亮氨酸
合作反馈抑制——cooperative feedback inhibition
工业微生物育种学8精品PPT课件

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第二节 诱变育种的步骤与方法
本节的主要内容
▪ 出发菌株的选择 ▪ 出发菌株的纯化 ▪ 菌悬液的制备 ▪ 诱变剂和诱变剂量的选择 ▪ 诱变剂处理的方式和方法 ▪ 突变株的分离与筛选
一、出发菌株
▪ 出发菌株的选择是诱变育种的第一个环节，直接 关系到诱变的成败。
▪ 因此在诱变前要对出发菌株的生物学特性做全面 的了解。
▪ 包括菌种的遗传背景，稳定性，纯一性以及形态、 生理、生化等方面的研究。
出发菌株有如下几类
▪ 1 自然界分离出来的野生菌株
▪ 特点；产量低，但对诱变因子敏感，变异幅度 大，正突变率高。
▪ 2 生产中正在使用的菌株
▪ 特点：有一定的生产能力，并且在长期生产中 经过了自然选育。适应现有的发酵设备和工艺。
二、出发菌株的纯化
▪ 为什么？ ▪ 因为微生物容易发生变异和混杂，一般丝状菌
的野生菌多数为异核体。生产菌种在不断移代 过程中，菌丝间接触、吻合后，易产生异核体、 部分结合子、杂合二倍体等，还有自然突变体， 这些都会造成细胞内遗传物质的异质性，使遗 传物质不稳定。如果一个菌种遗传物质不稳定， 用诱变剂处理后，突变体中的负变率增加。
▪ 如果能得到这种具有增变基因的变异菌株作为出 发菌株，对大幅度提高突变率是有利的。
选择怎样的出发菌株
▪ 5 选择符合育种需要的生物学和代谢的特性。如 产孢子较多、不产或少产色素、生活能力强、生 长速度快、周期短以及糖氮利用快、耐消泡、黏 度小等形状的作为出发菌株。
选择怎样的出发菌株
▪ 6 采用多出发菌株 ▪ 选择多种遗传类型的菌株作出发菌株比较稳妥，
容易在较短时间内达到育种目的。诱变育种工作 中，一般采用3~4个出发菌株，在逐个处理比较 后，将产量高、特性好的菌株留作继续诱变的出 发菌株。当一个菌株经长期诱变后，产量仍然得 不到明显提高时，应考虑更换出发菌株或可以重 新筛选野生型菌株，或许会收到更好的效果。
第八章 代谢控制育种的生理学依据

第八章 代谢控制育种的生理学依据


二、微生物代谢产物的过量合成
野生菌株在它们天然栖息地也有可能合成人们所 希望的代谢产物，但它们通常只在特定条件下合 成，并且合成的量不会多，这是由细胞经济所决 定的。 代谢控制发酵的目标是，要让目的代谢产物在细 胞中过量合成并被排出细胞。
适用于发酵生产的微生物必须是其目的产物的合 成量大大高于它通常的合成量，即有过量的合成 能力。 这不仅要求合成目的产物的途径畅通，还必须有 将目的产物排出细胞的满意机制。 过量合成的速率取决于微生物的遗传机制，以及 在培养条件下细胞的生理状态。
因为葡萄糖的高速消耗并不会附带形成酒精（或 醋酸）下游（downstream）足够高的呼吸能力， 而且葡萄糖的异生作用途径因受到高浓度葡萄糖 的调节而受阻，更加强了瓶颈效应。
实例2：柠檬酸的溢出代谢
黑曲霉能在特定环境下累积柠檬酸，也是因为代 谢流前段的运转速率大于后段的运转速率。 柠檬酸的溢出代谢是黑曲霉菌特有的生化机制与 培养条件共同起作用的结果。
如用于多糖合成的G-1-P，用于蛋白质合成的氨基 酸，用于核酸合成的核苷酸等。 这个体系的调节机制主要是反馈调节，包括反馈 抑制和反馈阻遏，还有由遗传因素决定的可能出 现的酶（或蛋白质）的缺失，主要表型是营养缺 陷型。
3、生物大分子的合成体系（体系Ⅲ）
指以生成蛋白质、DNA、RNA、各种多糖及类脂等细 胞结构物质为目的的生物大分子合成体系。 这个合成体系的调节控制主要由遗传因素决定的。
一、微生物的代谢流
1、代谢途径和代谢网络
中心代谢途径（central metabolic pathway）是指 由酵解途径（包括Glc→PYR的几条途径）和由DCA 循环补充的TCA循环等组成的可兼用于降解和合成 的途径。 它既可用于将代谢物氧化降解，又可将代谢物用 于合成或转换，在代谢中占中心位置。
第九章++代谢控制育种

第九章++代谢控制育种


15
二、酶活性的调节
酶活性调节是以酶分子的结构为基础的， 酶活性调节是以酶分子的结构为基础的，在酶分子水平上 的一种代谢调节。 的一种代谢调节。它是通过改变现成的酶分子活性来调节 新陈代谢的速率。 新陈代谢的速率。 酶活性的激活系指在分解代谢途径中 系指在分解代谢途径中， 酶活性的激活系指在分解代谢途径中，后面的反应可被较 前面的中间产物所促进，称为前体激活。 前面的中间产物所促进，称为前体激活。 酶活性的抑制主要是反馈抑制 主要是反馈抑制(feedback inhibition)， 酶活性的抑制主要是反馈抑制(feedback inhibition)， 主要表现在某代谢途径的末端产物(即终产物)过量时， 主要表现在某代谢途径的末端产物(即终产物)过量时，这 个产物可反过来直接抑制该途径中第一个酶的活性， 个产物可反过来直接抑制该途径中第一个酶的活性，促使 整个反应过程减慢或停止， 整个反应过程减慢或停止，从而避免了末端产物的过多累 反馈抑制具有作用直接、 积。反馈抑制具有作用直接、效果快速以及当末端产物浓 度降低时又可解除等优点。 度降低时又可解除等优点。
7
第二节 初级代谢的调节控制
微生物细胞具备有一整套完善且严密的代谢调节系 通过代谢调节， 统，通过代谢调节，微生物可最经济地利用其营养 合成出能满足自身生长、 物，合成出能满足自身生长、繁殖所需要的一切中 间代谢物， 间代谢物，并做到既不缺乏也不剩余任何代谢物的 高效“经济核算” 虽然代谢调节方式很多， 高效“经济核算”。虽然代谢调节方式很多，由于 微生物细胞体内的所有生化反应都是在酶的催化下 进行的，因此，对酶的调节控制是最主要、 进行的，因此，对酶的调节控制是最主要、最有效 的调控方式。它包括两个方面， 的调控方式。它包括两个方面，一是调节酶的合成 反馈阻遏) 二是调节现成酶分子的催化活力( 量(反馈阻遏)，二是调节现成酶分子的催化活力(反 馈抑制)。两者密切配合和协调，以达到最佳的调节 馈抑制) 两者密切配合和协调， 效果。 效果。

工业微生物育种复习题解析

工业微生物育种复习题解析第一章绪论1.什么是工业微生物？作为工业微生物应具备哪些特征？答：工业微生物：对自然环境中的微生物经过改造，用于发酵工业生产的微生物。

具备特征：(1)菌种要纯(2)遗传稳定且对诱变剂敏感(3)成长快，易繁殖(4)抗杂菌和噬菌体的能力强(5)生产目的产物的时间短且产量高(6)目的产物易分离提纯2.工业微生物育种的基础是什么？答：工业微生物育种的基础是遗传和变异。

3.常用的工业微生物育种技术有哪些？答：常用技术：(1)自然选育【选择育种】(2)诱变育种(3)代谢控制育种(4)杂交育种(5)基因工程育种第二章微生物育种的遗传基础1.基因突变的类型有哪些？答：有碱基突变，染色体畸变2.叙述紫外线诱变的原理？答：原理：紫外线对微生物诱变作用，主要引起DNA的分子结构发生改变（同链DNA的相邻嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体），从而引起菌体遗传性变异。

3.基因修复的种类有哪些？答：种类：(1)光复活修复(2)切除修复(3)重组修复(4)SOS修复4.真核微生物基因重组的方式有哪些？答：方式：(1)有性杂交(2)准性生殖(3)原生质体融合第三章出发菌株的分离与筛选1.什么是富集培养？答：富集培养：指在目的微生物含量较少时，根据微生物的生理特点，设计一种选择性培养基，创造有利的生长条件，使目的微生物在最适的环境下迅速地生长繁殖，数量增加，由原来自然条件下的劣势种变成人工环境中的优势种，以利于分离到所需要的菌株。

2.哪些分离方法能达到“菌落纯”？哪些分离方法能达到“细胞纯（菌株纯）”？答：菌落纯：稀释分离法、划线法、组织法细胞纯：单细胞或单孢子的分离法3.分离好氧微生物常用的方法有哪些？答：(1)稀释涂布法(2)划线分离法(3)平皿生化反应分离法4.平皿生化反应分离法有哪些？分别用来筛选哪些菌？各自原理如何？答：(1)透明圈法原理：在平板培养基中加入溶解性较差的底物，使培养基混浊，能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明圈，圈的大小可以放映该菌株利用底物的能力。

代谢控制和育种..


二、抗分解调节突变株的选育 （三）解除磷酸盐调节突变株的选育 初级代谢必须
过量时影响次级代谢
磷酸盐基本耗竭，抗生素合成开始 发酵工业中，磷酸盐常被控制在亚适量。
4.2 抗分解调节突变株的选育
3. 解除磷酸盐调节突变株的选育
（A）磷酸盐对次生产物的调节机制

(1) 通过初级代谢的变化影响次级代谢


分解代谢阻遏现象：在初级或次级代谢中都存在，其含义 是指代谢过程中酶的合成往往受高浓度的葡萄糖或其他易 分解利用的碳源或氮源所抑制。 选育抗分解调节突变株(如碳源、氮源或磷酸盐分解调节)， 其实就是筛选合成酶的产生不受碳、氮、磷的代谢阻遏或 抑制的突变株，使抗生素提前到菌体生长期开始合成，延 长产抗期以提高产量。
筛选方法与实例

4.2 抗分解调节突变株的选育
1. 解除碳源调节突变株的选育
(1) 循环培养法
交 替 培 养
快速利用的 碳源培养基
慢速利用的 碳源培养基
突变型解除了阻遏现象，在乳糖的 培养基上比野生型生长速度快，
4.2 抗分解调节突变株的选育
1. 解除碳源调节突变株的选育
涂布诱 变后的 菌体
4.2 抗分解调节突变株的选育
1. 解除碳源调节突变株的选育
(4) 葡萄糖结构类似物

① 特性：2-dG和3-mG既不被微生物代谢又具有分解阻遏作用， 因此可用来筛选抗分解阻遏的突变株。
2-dG
3-mG
4.葡萄糖结构类似物-------（1）筛选方法
出发菌株 诱变 涂琼脂平板
抗2-dG或 3-mG
4.2 抗分解调节突变株的选育
2. 解除氮源分解调节突变株的选育

第七章工业微生物代谢调控育种


乳糖代谢基因表达调控图解：(没有乳糖时)
调节基因
Ｒ
启动子 操纵基因
Ｐ
结构基因
Ｏ
lacZ
lacY
lacA
转录
信使RNA 翻译
RNA聚合酶
阻抑物
阻抑物与 操纵基因 结合，结 构基因转 录受阻．
乳糖代谢基因表达调控图解：(有乳糖时)
调节基因
Ｒ
启动子 操纵基因
Ｐ
结构基因
Ｏ
RNA聚合酶
lacZ
lacY
lacA
4．葡萄糖结构类似物（2-Dg,3-Mg） （1）筛选方法 （2）抗性突变株的性质
（二）解除氮源分解调节突变株的选育 氮源分解调节主要指含氮底物的分解 酶受快速利用的氮源阻遏。细菌、酵母、霉菌 等微生物对初级代谢产物的氮降解物具有调节 作用。次级代谢的氮降解物的阻遏主要指铵盐 和其他快速利用的氮源对抗生素生物合成具有 分解调节作用。 筛选芽孢杆菌中耐氨基酸菌株．是提 高蛋白酶产量的一种有效方法。因为高浓度氨 基酸会抑制芽胞的形成，并也阻遏蛋白酶的合 成。据试验若从高浓度葡萄糖培养基中筛选高 产蛋白酶芽孢杆菌，也能得到同样效果。
N-乙酰谷氨酸
N-乙酰-ᵞ -谷氨酰磷酸
N-乙酰谷氨酸半醛 N-2-乙酰鸟氨酸 鸟氨酸 瓜氨酸 精氨酰琥珀酸 精氨酸
2.在分支式生物合成 途径中 营养缺陷型突 变导致协同反馈调节 某一分支途径的代谢 阻断，使这一分支途 经的终产物不能合成。
葡萄糖
乙酰辅酶A 柠檬酸
生物素
硫胺素 ᵞ -酮戊二酸
脂肪酸 L-谷氨酸
一、初级代谢产物和初级代谢 初级代谢产物又可分为中间产物和 终产物，但这种定义往往是相对的. 二、次级代谢产物和次级代谢 这些物质有抗生素、生长刺激素、 生物碱、色素、毒素以及甾体等。通常 把以初级代谢产物为前体，合成次生产 物的代谢体系称为次级代谢。

微生物遗传育种


原生质体融合操作示意图
五、基因工程育种
20世纪70年代 包括基因工程、分子定向进化等 以微生物本身为出发菌株利用基因工程方法进行改造而获得
的工程菌，或者是将微生物甲的某种基因导入到乙中，使后 者具有前者的某些性状或表达前者的某些基因产物而获得的 新菌种。 优点：克服远缘杂交的不亲和障碍、定向改变生物性状 缺点：可能会引起生态危机、技术难度大
3.溶源性转变
概念：当温和噬菌体感染宿主而使其发生溶源化时，因噬菌体的基因整合到宿主 的核基因组上，而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象，称为溶源转变。
区别： 当宿主丧失其原噬菌体时，通过溶源转变而获得的新性状也随之消失 温和噬菌体不携带来自供体菌的外源基因，是噬菌体自身基因使宿主获得新 性状 温和噬菌体是完整的，不是缺陷的 获得新性状的是溶源化的宿主细胞，不是转导子
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基因重组（gene recombination）：通过两个具有不同优良性状的亲本菌株 杂交达到基因重组，使两个亲本的优良性状集中到一个重组菌株内。
杂交育种(Hybridization breeding)：一般是指人为利用真核微生物的有性 杂交或准性生殖，或原核微生物的接合、转导和转化等过程，促使两个具不 同遗传性状的菌株发生基因重组，以获得性能优良的生产菌株。
诱变育种的特点
诱变育种存在一定的盲目性和随机性，但操作简便、突变率高、突 变谱广，不仅能提高产量、改进质量，还能扩大产品种类和简化工艺条 件，用于代谢控制育种和杂交育种。因此，发酵工业的优良菌种的选育 主要采用诱变育种方法。
长期诱变会出现产量性状难以继续提高的问题，菌株生活能力一般 会逐渐下降，例如生长周期延长，孢子量减少，代谢减慢，产量增加缓 慢等。
常见微生物菌种保藏方法比较
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2. 分支代谢初级代谢物反馈调节对次级代谢的影响
(1) 次级途径和初级途径 具有共同的分叉中间体
实例1 实例1：赖氨酸对青 霉素生物合成的反 馈调节
3.4 次级代谢反馈调节
2. 分支代谢初级代谢 物反馈调节对次级代 谢的影响
(1) 次级途径和初级途径 具有共同的分叉中间体
实例2 实例2：色氨酸对杀假 丝菌素生物合成的 反馈调节
3.4 次级代谢反馈调节
1. 次级代谢自身产物的反馈调节
抗生素对自身产物 抑制的规律： 抑制的规律：
抑制特定产生菌合成 抗生素所需浓度与生 产水平具有相关性， 产水平具有相关性， 产生菌产量高， 产生菌产量高，对自 身抗生素的耐受力强， 身抗生素的耐受力强， 反之则越敏感。 反之则越敏感。 实例： 实例：氯霉素对芳基氨合 成酶的 反馈调节
–活性中心：与底物结合的催化中心 活性中心： 活性中心 –变构中心：与调节因子相结合的调节中心 变构中心： 变构中心
2.3 反馈阻遏与反馈抑制的比较
第三节 次级代谢的调节控制
• 抗生素的生物合成途径中，反馈调节作用包括： 抗生素的生物合成途径中，反馈调节作用包括： 包括
– 抗生素本身积累起着反馈调节作用 抗生素本身积累起着反馈调节作用 – 作为抗生素合成前体的初级代谢产物，当其受到反馈调节时，必然会影响抗生 作为抗生素合成前体的初级代谢产物，当其受到反馈调节时， 合成前体的初级代谢产物 素的合成。 素的合成。
2.2 酶活性的调节
(B) 分支代谢途径中的反馈抑制
累积反馈抑制(cumulative (4) 累积反馈抑制(cumulative feedback inhibition)
2.2 酶活性的调节
(B) 分支代谢途径中的反馈抑制
(5) 同工酶调节
2.2 酶活性的调节
(B). 分支代谢途径中的反馈抑制
3.4 次级代谢反馈调节
2. 分支代谢初级代谢物反馈调节对次级代谢的影响 (2) 初级代谢终产物作 为前体合成次生产物。 为前体合成次生产物。 实例：缬氨酸对青霉 实例：缬氨酸对青霉 素生物合成的反馈 调节
3.4 次级代谢反馈调节
2. 分支代谢初级代谢物反馈调节对次级代谢的影响 (2) 初级代谢终产物作为前体合成次生产物。 初级代谢终产物作为前体合成次生产物。 在抗生素发酵中， 在抗生素发酵中， 加入前体可显著 增产， 增产，但前体加 入超过一定限度， 入超过一定限度， 将产生毒性。 将产生毒性。
(6) 顺序反馈抑制
2.2 酶活性的调节
2. 反馈抑制的机制
受反馈抑制的调节酶一般都是变构(allosteric (1) 受反馈抑制的调节酶一般都是变构(allosteric enzyme)，酶活力调控的实质就是变构酶的变构调节 变构调节。 enzyme)，酶活力调控的实质就是变构酶的变构调节。 变构酶一般由两个以上亚基组成 一般由两个以上亚基组成， (2) 变构酶一般由两个以上亚基组成，有两个和低分子 物质结合位点： 物质结合位点：
• 关键： 关键：
– 解除微生物代谢调控机制，打破微生物正常的代谢调节，人为地控制 解除微生物代谢调控机制，打破微生物正常的代谢调节， 微生物的代谢。 微生物的代谢。 • 代谢控制育种和发酵过程的代谢控制培养是实现这一目标的两个手段，而 代谢控制育种和发酵过程的代谢控制培养是实现这一目标的两个手段， 是实现这一目标的两个手段 其中前者是主要支柱技术。 其中前者是主要支柱技术。 • 与个学科密不可分：生物化学、分子生物学和分子遗传学、过程控制方法 与个学科密不可分：生物化学、分子生物学和分子遗传学、
3.3 次级代谢产物氮源分解调节
1.定义：氮源分解调节主要指含氮底物的酶( 1.定义：氮源分解调节主要指含氮底物的酶(如 定义
蛋白酶、硝酸还原酶、酰胺酶、组氨酸酶和脲酶) 蛋白酶、硝酸还原酶、酰胺酶、组氨酸酶和脲酶) 的合成受快速利用的氮源，尤其是氨的阻遏。 的合成受快速利用的氮源，尤其是氨的阻遏。
2.1 酶合成的调节
1. 酶合成调节的机制 诱导型操纵子－ (1) 诱导型操纵子－负调控
2.1 酶合成的调节
1. 酶合成调节的机制
阻遏型操纵子－ (2). 阻遏型操纵子－正调控
2.2 酶活性的调节
1. 反馈抑制的类型 (A) 直线式代谢途径中的反馈抑制
2.2 酶活性的调节
(B) 分支代谢途径中的反馈抑制
–分解代谢物阻遏(catabolite repression)：有两种碳源 分解代谢物阻遏(catabolite repression)： 分解代谢物阻遏 或氮源)分解底物同时存在时， (或氮源)分解底物同时存在时，细胞利用快的那种分解 底物时会阻遏利用慢的底物有关分解酶合成的现象。 底物时会阻遏利用慢的底物有关分解酶合成的现象。
3.1 次级代谢产物的诱导调节
1. 两种可能的诱导机制
• • 诱导物→刺激影响初级代谢，造成代谢流的改变→ 诱导物→刺激影响初级代谢，造成代谢流的改变→ 代谢流的改变 大量生成次生代谢物 诱导物→次生代谢物合成酶的合成→ 诱导物→次生代谢物合成酶的合成→大量生产次生 合成酶的合成 代谢物 色氨酸对麦角碱的作用 蛋氨酸对头孢霉素C 蛋氨酸对头孢霉素C的作用 过加入诱导物使酶的产量提高。 过加入诱导物使酶的产量提高。
因此，这些代谢调节机制实质上是提高抗生素发酵单位的天然屏障， 因此，这些代谢调节机制实质上是提高抗生素发酵单位的天然屏障， 如果使调节机制脱敏，将有可能提高抗生素的产量。 如果使调节机制脱敏，将有可能提高抗生素的产量。
第三节 次级代谢的调节控制
1. 次级代谢产物的诱导调节 2. 次级代谢产物碳源分解调节 3. 次级代谢产物氮源分解调节 4. 次级代谢反馈调节 次级代谢反馈调节 反馈 5. 磷酸盐调节 6. 细胞膜透性的调节
3.4 次级代谢反馈调节
2. 分支代谢初级代谢物反馈调节对次级代谢的影响
次级途径和初级途径具有共同的分叉中间体， 次级途径和初级途径具有共同的分叉中间体，由分叉中间体产生的 初级代谢产物的反馈调节可能影响次级代谢产物的形成。 初级代谢产物的反馈调节可能影响次级代谢产物的形成。
3.4 次级代谢反馈调节
1.3 初级代谢与次级代谢的关系
1. 从菌体生化代谢角度分析
1.3 初级代谢与次级代谢的关系
–2. 从遗传代谢角度分析 2.
第二节 初级代谢的调节控制
1、酶合成的调节 2、酶活性的调节 3、反馈阻遏与反馈抑制
2.1 酶合成的调节
1. 酶合成调节的类型 (1) 诱导 (induction)
根据酶的生成是否与环境中存在的该酶底物或其有 关物的关系，可分为： 关物的关系，可分为： 组成酶：细胞固有的酶，相应基因控制合成， 组成酶：细胞固有的酶，相应基因控制合成，不受底物影响。 诱导酶：适应外来物临时合成的酶，受底物影响。 诱导酶：适应外来物临时合成的酶，受底物影响。
–2. 初级代谢体系的组成 2.
• 分解代谢体系 • 生物合成体系
–素材性生物合成体系：小分子 素材性生物合成体系： 素材性生物合成体系 –结构性生物合成体系：大分子 结构性生物合成体系： 结构性生物合成体系
1.2 次级代谢产物和次级代谢
–次级代谢产物：对产生它们的生物体本身 次级代谢产物： 次级代谢产物 不需要的一种产物，也称为次生产物。 不需要的一种产物，也称为次生产物。 –次级代谢(secondary metabolism)：以初 次级代谢(secondary metabolism)： 次级代谢 级代谢产物为前体， 级代谢产物为前体，合成次生产物的代谢体 系。
3.2 次级代谢产物碳源分解调节
2. 抗生素受碳源分解调节的可能机制
• (1) 可能与菌体生长速率控制抗生素合成有关。 可能与菌体生长速率控制抗生素合成有关。 菌体生长最好的碳源能抑制抗生素合成，因此， 菌体生长最好的碳源能抑制抗生素合成，因此， 在低生长率的情况下( 在低生长率的情况下(例如青霉素合成中缓慢补加 葡萄糖)可减少葡萄糖的干扰作用。 葡萄糖)可减少葡萄糖的干扰作用。 • (2) 可能与分解代谢产物的堆积浓度有关。乳糖 可能与分解代谢产物的堆积浓度有关。 之所以比葡萄糖优越， 之所以比葡萄糖优越，是因为前者被水解为可利 用单糖的速度正好符合青霉素在生产期合成抗生 素的需要， 素的需要，而不会有分解代谢产物如丙酮酸的堆 积。
第八章 微生物代谢控制育种
• 第3个转折期：以1956年谷氨酸发酵成功为标志，发酵工业进 个转折期： 1956年谷氨酸发酵成功为标志， 年谷氨酸发酵成功为标志 入第3个转折期——代谢控制发酵时期。 代谢控制发酵时期。 入第3个转折期 代谢控制发酵时期 • 大体过程： 大体过程：
生物化学和遗传学为基础 为基础， – 以生物化学和遗传学为基础，研究代谢产物的生物合成途径和代谢调 节的机制，选择巧妙的技术路线，通过遗传育种技术 遗传育种技术获得解除或绕过 节的机制，选择巧妙的技术路线，通过遗传育种技术获得解除或绕过 微生物正常代谢途径的突变株， 微生物正常代谢途径的突变株，从而人为地使有用产物选择性地大量 合成和累积。 合成和累积。
2.1 酶合成的调节
1. 酶合成调节的类型
(2) 阻遏 (repression)
–末端产物阻遏(end-product repression)：由某代谢途 末端产物阻遏(endrepression)： 末端产物阻遏(end 径末端产物过量累积而引起的阻遏。 径末端产物过量累积而引起的阻遏。 • 对于直线式反应途径，情况较为简单 对于直线式反应途径， • 对于分支代谢途径，情况较复杂： 对于分支代谢途径，情况较复杂：
2. 实例
• •
大多数分解代谢酶属于诱导酶， 3. 大多数分解代谢酶属于诱导酶，可以通
3.2 次级代谢产物碳源分解调节
1. 涉及对终产物阻遏
• 实例1：青霉素发酵过程中，葡萄糖不利于青霉素合成，而乳糖虽 实例1 青霉素发酵过程中，葡萄糖不利于青霉素合成， 过程中 利用缓慢，但能提高青霉素产量。 利用缓慢，但能提高青霉素产量。 • 实例2：头孢霉素C的生物合成中，抗生素比产率递减顺序为：蔗糖 实例2 头孢霉素C的生物合成中 抗生素比产率递减顺序为： 半乳糖>果糖>麦芽糖>葡萄糖，其中蔗糖是葡萄糖的两倍多。 >半乳糖>果糖>麦芽糖>葡萄糖，其中蔗糖是葡萄糖的两倍多。