三聚氰胺奶粉检测方法

乳品中三聚氰胺快速检测解决方案

作者：暂无

来源：《食品安全导刊》 2010年第11期

张德红 扶胜 杜祥乐 北京望尔生物技术有限公司

自2008年三聚氰胺事件爆发以来，乳品安全直备受关注。为了加大对乳品行业的监管力度，使中国乳品行业迅速恢复元气，相关职能部、]出台了多项措施：在质量控制方面，要求对奶源做到严格把关，有效提高乳品质量安全系数。因此，在奶站收奶环节，企业对原料奶的检测把关显得尤为重要，同时为保证牛奶不发生腐败变质的现象，必须在最短的时间内对其进行检测并立即入罐冷藏，这些都对乳品的检测技术提出了挑战。常规的三聚氰胺残留量检测方法主要有液相色谱／质谱法(LC-MS)、高效液相色谱(HPLC)、液相色谱串联质谱( LC-MS-MS)等，这些方法因为存在仪器设备昂贵、检测过程繁琐、检测时间太长和对检验人员的技能要求高等局限，所以不适合现场监控和大量样品的筛查，在鲜奶收购环节使用不现实。鉴于此，如何选择 种快速、低成本的检测方法，构建从奶站、企业到政府监管的安全检测网络已成为当前迫切需要解决的问题。

目前，快速筛查技术主要有两大类：生物分析技术和化学分析技术。生物分析技术又包含免疫学方法，该方法具有检出限低、准确性好、灵敏度高、重现性好等特点，是现在和未来快速筛查技术发展的主流技术，非常适合对原料乳的快速检测。依托此项技术，北京望尔生物技术有限公司（以下简称北京望尔）开发出三聚氰胺酶联免疫试剂盒和胶体金试纸卡等检测产品，为广大乳品企业及相关机构提供了有效的三聚氰胺快速检测方案。

三聚氰胺试剂盒采用间接竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被偶联抗原，样本中残留的三聚氰胺将和微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗三聚氰胺抗体，在加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光值与残留物三聚氰胺的含量成负相关，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样本中三聚氰胺的含量。 牛奶样本前处理：吸取牛奶液体400uL加入800uL提取液，涡动，取上层清液10 0111加入500uL稀释液混匀用于检测。

FOOD INDUSTRY·

97原料乳及乳制品中三聚氰胺检测方法　楚雪 郑州谱尼测试技术有限公司众所周知，三聚氰胺是一种常见的工业原料，在纺织、橡胶、塑料等行业得到了广泛的应用，而且它的含氮量极高，如果添加到原料乳以及乳制品中，可以造成数据假象，让人们误以为里面含有较多的蛋白质成分。典型的三聚氰胺检测方法三聚氰胺是一种无色无味的晶体，低毒，微溶于乙醇，可溶于甲醇、甘油、乙酸，不溶于乙醚、苯酚。目前，三聚氰胺的主要用途是加工塑料、胶水、涂料和阻燃剂。虽然三聚氰胺毒性较低，但是对于幼儿而言，如果一次性摄入量过多，就会导致肾功能衰竭。我国明确规定婴幼儿配方奶粉中三聚氰胺的含量不得超过１．０ｍｇ／Ｌ，其他食品中三聚氰胺的含量不得超过２．０ｍｇ／Ｌ。色谱检测。第一种，高效液相色谱法。这种方法简称ＨＰＬＣ法，适用的范围特别广，而且分析速度很快，能够实现自动化检测，是最普遍的检测方法。目前人们已经加大了研究的力度，并且对检测条件进行了优化，明显缩短了检测时间，而且高效液相色谱法日渐成熟，已经成为了人们检测三聚氰胺的首选方法，具体的检测内容会在本文的第二章节详细介绍。第二种，气相色谱质谱法。这种方法简称ＧＣ－ＭＳ法，灵敏度很高，但是由于三聚氰胺的分子质量较小，不容易挥发，所以需要进行衍生处理，提高挥发性，这一过程会造成一定的样品损失。如果使用硅烷进行衍生处理，可以降低外界环境的干扰，而结合反吹技术，可以省略固相萃取柱净化的环节，这样简化了处理流程。第三种，液相色谱－串联质谱法。这种方法使用三氯乙酸溶液对目标分析物进行提取，然后通过离子固相萃取柱净化，在对三聚氰胺进行检测时，方法检测低限为１８μｇ／ｋｇ，与上述两种方法相比，这种方法更加便捷，并且可以使用外标法和内标法进行测量。光谱检测。第一种，拉曼法。ＳＥＲＳ技术可以增强金属表面附着物质的散射信号，并且搜集到具体的结构信息，所以检测人员可以建立一套拉曼光谱扫描系统，对原料乳与三聚氰胺颗粒的混合样本进行检测，就会发现拉曼强度与三聚氰胺的比例存在明显的线性关系。在具体的检测过程中，需要事先对原料乳以及乳制品的样品进行提取，使用三氯乙酸溶液，浓度在１３％左右，这样能够除去样品中的氧化铝杂质，然后再进行ＳＥＲＳ检测，这样可以极大地缩短检测时间。第二种，红外法。红外光谱技术不会对样品造成破坏，所以可以算作绿色技术，这种技术能够对样品进行定量分析，即使不断变化样品中三聚氰胺的浓度，也可以很好地识别未知样品中三聚氰胺的真实含量。第三种，荧光法。这种方法需要利用还原剂将胆酸钠合成为ＡｕＮＣｓ，而三聚氰胺遇到ＡｕＮＣｓ后，会增强荧光的效果，这种方法操作比较简单，人们可以用它对超市中出售的牛奶进行检测。另外，还可以使用试纸条对三聚氰胺进行检测，而且便于肉眼观察，检测时间大概１５分钟左右。免疫检测。目前，免疫检测方法不是十分常见，而且涉及到免疫反应，核心原理是抗原抗体的特异性结合，并且需要借助大孔径的微孔过滤膜。在制作三聚氰胺抗原时，要使用活化脂法，然后将三聚氰胺抗体以及ＨＲＰ抗体作为检测层，这种方法耗时较短。高效液相色谱法简析试验。使用的材料包括甲醇、氨水、三氯乙酸、柠檬酸、辛烷磺酸钠以及乙酸铅。将５０ｍＬ的甲醇注入到含有５０ｍＬ水的试管中，得到甲醇水溶液。用天平称取１０ｇ的三氯乙酸，然后放入到１Ｌ的容量瓶中，之后用水将容量瓶注满，并且进行均匀的晃动，得到浓度为１％的三氯乙酸溶液。将５ｍＬ的氨水与９５ｍＬ的甲醇混合在一起，得到浓度为５％的氨化甲醇溶液。将１ｇ乙酸铅放入到１００ｍＬ的容量瓶内，然后注满水，得到１％的乙酸铅溶液。这里需要注意的是离子对试剂缓冲液的配制，需要将２．０５ｇ的柠檬酸钠与２．１８ｇ的辛烷磺酸钠混合在一起，然后加入９６０ｍＬ的水，混合均匀后还要加水调节ＰＨ，当ＰＨ达到３．２时，停止加水。使用的仪器包括高效液相色谱仪、天平、固相萃取装置、氮气吹干仪等，在配制三聚氰胺储备液时，需要准确称取０．０９９６６ｇ含量为９９．９８％的三聚氰胺标准品，并且与甲醇水溶液混合在一起，这样就得到了浓度为９８６．３２４μｇ／ｍＬ的储备液，保存时要注意避光，同时温度控制在６℃左右。在试验过程中，分别选取０．０６ｍＬ、０．１５ｍＬ、３ｍＬ以及６ｍＬ的储备液，进行分组，并且放入到１００ｍＬ的容量瓶中，用流动相定容，根据浓度的高低进行检测。ＨＰＬＣ的检测条件：色谱柱Ｋｒｏｍａｓｉｌ１００－５－Ｃ１８，流速１．２ｍＬ／ｍｉｎ，柱温３８℃，波长２３０ｎｍ。如果调节流动相ＰＨ，可以发现当ＰＨ下降时，目标峰拖尾情况出现的次数明显降低，所以可以在２．３～３．６之间合理调节ＰＨ。这里需要注意的是，试验过程会使用蛋白沉降剂，乙酸铅可以保证沉降效果符合要求，而使用其他物质，会发现储备液十分混浊，经过离心机处理后，过（下转第99页）Copyright©博看网 . All Rights Reserved.

高效液相色谱内标法测定奶粉中三聚氰胺

邸万山

【摘 要】以双氰胺为内标物,采用高效液相色谱内标法测定奶粉中三聚氰胺的含量,通过对色谱条件的优化,最后确立了有效的检测方法.样品经20 mL 50℃热水,0.5g无水硫酸镁,10 mL乙腈提取后,采用Nova-PakC18色谱柱(3.9 mm×15 mm×5

μm)分离,以0.01 mol/L乙酸铵∶乙腈=90∶10 (V∶V)作为流动相,218nm为检测波长.结果表明,双氰胺在该条件下能够与三聚氰胺完全分离,可以作为测定三聚氰胺的内标物.在0.500～1.500 mg/kg的添加范围内,三聚氰胺的回收率为98.2％～100.5％.精密度实验结果相对标准偏差为0.44％.所测定奶粉样品中三聚氰胺为0.223 mg/kg.此法处理样品处理简便易行,回收率、准确度高,分析速度快,具有良好的重复性和再现性,适于测定奶粉中的三聚氰胺.

【期刊名称】《中国酿造》

【年(卷),期】2016(035)003

【总页数】3页(P145-147)

【关键词】三聚氰胺;高效液相色谱法;奶粉

【作 者】邸万山

【作者单位】辽宁石化职业技术学院应用化学系,辽宁锦州121001

【正文语种】中 文

【中图分类】TS207.3 三聚氰胺作为一种价格低廉的有机化工原料，其最大的特点就是含氮量高（质量分数为66.6%），掺假增氮效果明显，成本低。因此，在技术上和经济上存在奶粉中掺加三聚氰胺的可能。研究表明，三聚氰胺长期累计摄入会导致肾、输尿管和膀胱结石，并有生殖系统损伤的可能性［1］。因此有必要对奶粉中的三聚氰胺进行监测，明确其实际含量，防患于未然。

奶粉中总氮质量分数测定国家标准中使用凯氏定氮法，该方法对设备要求低，操作相对简单，但精度差。国家规定奶粉中残留三聚氰胺限量＜1 mg/kg。液态奶（包括原料乳）、奶粉、其他配方乳粉中三聚氰胺的限量值为2.5 mg/kg，高于2.5 mg/kg的产品一律不得销售。含乳15%以上的其他食品中三聚氰胺的限量值为2.5 mg/kg，高于2.5 mg/kg的产品一律不得销售。目前，三聚氰胺的分析方法主要有高效液相色谱法（high performance liquid chromatography， HPLC）［2-5］、气质联用法（gaschromatography-mass spectrometry，GC-MS）［6-7］、液相色谱串联质谱法（liquid chromatography tandem mass

高效液相色谱(HPLC-UV)法测定奶粉中三聚氰胺的含量

一、实验目的：

测量奶粉中三聚氰胺的含量是否达标。

二、仪器：

高效液相色谱仪，离心机，固相萃取装置，柱温箱，紫外检测器，C18柱，超声波清洗器，pH 计，电子天平，氮气吹干仪，涡旋混合器；5mL移液管1支,1mL刻度移液管1支，25mL容量瓶1个，100mL容量瓶6个，100mL烧杯1个，微量进样器一支。

三、试剂：

三聚氰胺标准品，1%三氯乙酸，氨水，柠檬酸，庚烷磺酸钠（色谱纯），甲醇（色谱纯），乙腈（色谱纯），二次水，甲醇水溶液（准确量取50mL甲醇和50mL水，混合备用），5%氨化甲醇（量取5mL氨水和95mL甲醇混合备用），离子对缓冲溶液（准确称取柠檬酸和庚烷磺酸钠加水溶解后调节pH=3，定容至1L备用），三聚氰胺储备液（准确称取100mg三聚氰胺，在100mL容量瓶中用甲醇水溶液定容），净化柱（固相萃取柱，基质为苯磺酸化的聚苯乙烯），氮气。

四、实验步骤：

1.样品预处理：

准确称取2g样品，用10mL 1%三氯乙酸溶解后转移至25ml容量瓶中，乙腈定容。超声提取10分钟后离心，干过滤。用5mL移液管准确移取5mL过滤后的溶液过净化柱，依次用3mL水和3mL甲醇洗涤并抽干后后用约6mL 5%氨化甲醇洗脱。洗脱液用氮气吹干后用1mL流动相定容，涡旋混合1分钟后经 μm有机相滤膜过滤后进样。

2.色谱条件：

C18 色谱柱（150 mm× mm，5 μm），以离子对缓冲溶液+乙腈（85+15）作为流动相，流量为 ml/min，柱温为35 ℃，检测波长为240 nm，进样量为20 μl。

3. 标准曲线的绘制：

将三聚氰胺标准储备液（×10^3 mg/L）用甲醇-水溶液（1+1） 逐级稀释得到浓度为、、、、、 mg/L的标准系列溶液，以峰面积（y）对浓度（x）绘制标准曲线。

4.回收率实验：

称取2g样品，用10mL 1%三氯乙酸溶解后转移至25ml容量瓶中，用5mL刻度移液管准确移取 10μg/mL三聚氰胺溶液至容量瓶中，后续处理与1相同，进样。测量回收率。