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实用标准文案细胞总蛋白的提取（1）离心后，弃去上清液，将收集的细胞用手指轻弹重悬于剩余的少量上清液中，转移至1.5ml 离心管内，用1×PBS溶液洗涤2次，每次加入1mL PBS溶液，1000r/min，4℃离心5min，弃上层液体。
洗涤两次后，将上清液完全去除，用手指轻弹细胞团，使其分散重悬（若不分散，则无法与裂解液充分混匀）。
（2）每管加入细胞团等体积的含蛋白酶抑制剂cocktail的RIPA细胞裂解液；如需检测磷酸化蛋白，则需另加入磷酸酶抑制剂。
使细胞裂解液与细胞充分混匀，冰上裂解30min。
如暂不提取蛋白，也可在洗涤细胞2次后加入含蛋白酶抑制剂cocktail和磷酸酶抑制剂的1×PBS约100μL，1000r/min，4℃离心5min后，完全弃上层液体，置于-80℃冰箱保存备用。
（3）冰上超声处理细胞，每次超声2s，间隔3s，约10-20次。
（4）13000r/min，4℃离心15min，收集上清溶液至另一干净并预冷的1.5mL离心管中，于-80℃冰箱保存备用。
2. BCA法测定蛋白质浓度（1）配制工作液根据标准品及待测样品的个数，按BCA试剂A和试剂B体积比为50:1配制足量BCA工作液，充分混匀，置于常温备用。
（2）配制标准品取原标准品BSA（2mg/mL）约100μL，取出50μL，用ddH2O按对数法稀释成如下浓度：1mg/mL、0.5mg/mL、0.25 mg/mL、0.125 mg/mL、0.0625 mg/mL；设置96孔板第一横排第一孔为空白孔，第二横排第一、二孔加入20μL 1×PBS，从第三横排起，精彩文档．实用标准文案按浓度梯度由低到高依次取20μL标准品至96孔板中，每一浓度做2个平行孔。
（3）稀释待测样品取5μl待测蛋白样品，用ddH2O稀释到50μL，分别取20μL至96孔板中，每一浓度做2个平行孔；（4）分别加入200μL BCA工作液到蛋白标准品及待测样品中，轻轻混匀，并去掉每孔中的气泡，置于温箱37℃孵育30min。
WesternBlot最全攻略：从protocol到问题解决蛋白免疫印迹（western blotting）一般由凝胶电泳、样品的印迹和免疫学检测3个部分组成，是根据抗原抗体特异性结合检测样本中某种蛋白的方法，与ELISA不同的地方在于WB是一种半定量的检测方法。
操作流程如下：下面详细介绍一下每个操作步骤：一、样本的制备（1）样本一般是组织和细胞，根据样本类型的不同，选择合适的裂解液：样本类型裂解液全细胞NP-40、RIPA细胞质（可溶性）Tris-HCl细胞质（细胞骨架）Tris-Triton膜结合部分NP-40、RIPA细胞核RIPA、核裂解液线粒体RIPA（2）抑制剂，根据研究的目的蛋白进行选择，假如要检测磷酸化的蛋白含量，就要对磷酸酶进行抑制，现在很多公司都有多种抑制剂的混合物抑制剂靶点浓度2μg/ml抑肽酶胰蛋白酶、血纤维蛋白溶酶亮抑酶肽溶酶体1-10μg/ml胃蛋白酶抑制剂A Asp蛋白酶1μg/mlPMSF Asp蛋白酶1mMEDTA 镁和锰金属蛋白酶1-5mMEGTA 钙金属蛋白酶1mM氟化钠丝氨酸和苏氨酸磷酸酶5-10mM原钒酸盐酪氨酸磷酸酶1mM焦磷酸盐丝氨酸和苏氨酸磷酸酶1-2mMβ-甘油磷酸盐丝氨酸和苏氨酸磷酸酶1-2mM（3）要加入loading buffer（BME、DTT，目的是减少蛋白高级结构的形成）主要成分主要功能SDS 使蛋白变性并带上负电荷BME或DTT 减少二硫键的形成溴酚蓝离子型染料，可观察蛋白迁移甘油增加样品密度，起沉降作用（4）煮沸变性：一般是99°C，10min，水浴锅煮沸时，防止EP 管盖弹开，使水浴锅内的水进入。
二、凝胶电泳（1）配胶。
这里说的都是SDS变性胶，先配分离胶，再配浓缩胶。
根据目标蛋白分子量的大小，选择合适的分离胶浓度，分子量越高，分离胶的浓度越低。
浓缩胶一般用的都是5%。
配胶时需注意以下几点：①玻璃板清洗后，为了使表面的水快速晾干，可以在烘箱中放置几分钟，拿出来的时候一定要晾到室温再灌胶，不然很容易产生气泡；②配胶用的试剂一般都是在4度冰箱保存，当我们按比例配好混合液的时候，要等混合液恢复室温时，再灌胶，不然也很容易产生气泡；③加水液封时，速度要慢，可用1ml枪沿着胶板上沿反复移动，不然很容易将分离胶冲变型。
Western blot（蛋白印迹法）详细步骤一、组织的研磨准备：研钵、研磨棒、EP管、药匙、液氮、液氮匙、自封袋、一次性手套、棉手套步骤：①用研磨棒将装有冻存组织的EP管敲碎，取出组织，在研钵中盛满液氮，用力敲碎组织，研磨。
②研磨过程中一旦液氮干了，立即加入液氮，保持研磨在液氮中进行，直至组织呈干粉状。
③用在液氮中浸泡过的药匙将研磨好的粉末盛入新的EP管中。
④装有组织粉末的EP管现在液氮中保存，待所有组织都研磨结束后装入自封袋，于-80℃保存。
注意：1.研钵使用前要用锡纸包口、研磨棒用锡纸包头，在烘箱中烘烤180℃至少3h 以上。
2.组织研磨成粉末后待液氮全部挥发后再将组织粉末装管。
3.每种样品都最好留有副管，备用。
二、裂解提蛋白准备：裂解液配制比例RIPA:PMSF=1000：10=100：1若需要加入蛋白酶抑制剂，则比例一般为1:1000（即1ml裂解液加1μl蛋白酶抑制剂）步骤：①将RIPA和PMSF按比例混匀，加入到装有组织粉末的EP管中，一般加入300~500μl左右（浓度尽量高点）。
②盖好盖子，在冰上裂解30~40min.③到时间后于4℃，12000rpm离心10min，取上清液转移到新的离心管中，于-20℃保存。
注意：1.裂解液加入后用手指弹一下混匀，当加入量很少时，成粘稠状，有必要时应用枪头混匀。
三、BCA法测定蛋白浓度（BCA试剂盒）准备：BCA试剂盒（BCA试剂A、BCA试剂B、蛋白标准液）、酶标板、酶标仪、摇床步骤：①按1:15或1:30稀释待测样品，即取1μl样品+14μl水。
③按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50:1）根据样品数量配制BCA工作液。
④每个标准品孔加入200μl BCA工作液，样品孔加入待测样品10μl和200μlBCA工作液，充分混匀，在摇床上震荡30s，37℃放置30min，于492nm下测定OD值。
⑤标准曲线以蛋白含量（μg）为横坐标，吸光度为纵坐标，根据样品的吸光度可以在标准曲线上查得相应的蛋白含量。
Western Blot 操作原理步骤Western Bl...基本原理【动画】基本原理（点击播放）免疫印迹法（immunoblotting test，IBT）亦称酶联免疫电转移印斑法（enzyme linked immunoelectrotransfer blot，EITB），因与Southen早先建立的检测核酸的印迹方法Southen blot相类似，亦被称为Western blot。
免疫印迹（western blotting）是在蛋白质电泳分离和抗原抗体检测的基础上发展起来一项检测蛋白质的技术。
它将SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的高分辨力与抗原抗体反应的特异性相结合。
典型的印迹实验包括三个步骤：①蛋白质的电泳分离②将电泳后凝胶上的蛋白质转移至固体膜上，用非特异性，非反应活性分子封闭固体膜上未吸附蛋白质区域③免疫学检测。
免疫印迹克服了聚丙烯酰胺凝胶电泳后直接在凝胶上进行免疫学分析的弊端，极大地提高了其利用率、分辨率和灵敏度，使其成为使用最广泛的免疫化学方法之一。
免疫印迹法原理示意图第一阶段为SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。
抗原等蛋白样品经SDS处理后带阴电荷，在聚丙烯酰酰凝胶中从阴极向阳极泳动，分子量越小，泳动速度就越快。
此阶段分离效果肉眼不可见（只有在染色后才显出电泳区带）。
第二阶段为电转移。
将在凝胶中已经分离的条带转移至硝酸纤维素膜上，选用低电压（100V）和大电流（1～2A），通电45min转移即可完成。
此阶段分离的蛋白质条带肉眼仍不可见。
第三阶段为酶免疫定位。
将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜（相当于包被了抗原的固相载体）依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后，加入能形成不溶性显色物的酶反应底物，使区带染色。
常用的HRP底物为3，3，—二氨基联苯胺（呈棕色）和4-氯-1-萘酚（呈蓝紫色）。
阳性反应的条带清晰可辨，并可根据SDS-PAGE时加入的分子量标准，确定各组分的分子量。
本法综合了SDS-PAGE的高分辨力和ELISA法的高特异性和敏感性，是一个有效的分析手段，不仅广泛应用于分析抗原组分及其免疫活性，并可用于疾病的诊断。
蛋白免疫印迹杂交（Western Blot, WB）WB是将蛋白样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大小分离，再转移到杂交膜上，然后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法。
WB 是进行微量蛋白质分析比较成熟的技术之一。
以下是总结Western Blot 操作方法及常见问题分析，有助于成功完成WB。
A第一部分：蛋白样本提取制备蛋白样品制备是Western Blotting的第一步，更是决定WB成败的关键步骤，总体原则和注意事项：1.尽可能提取完全或降低样本复杂度只集中于提取目的蛋白（通过采用不同提取方法或选择不同的试剂盒产品）；2.保持蛋白处于溶解状态（通过裂解液的pH 、盐浓度、表面活性剂、还原剂等的选择）；3.提取过程防止蛋白降解、聚集、沉淀、修饰等，（低温操作，加入合适的蛋白酶和磷酸酶抑制剂）；4.尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子（通过加入核酸酶或采取不同提取策略）；5.样品分装，长期于-80℃中保存，避免反复冻融。
方法的选择◆自行配制抽提试剂，根据文献方法或经验提取；◆购买商品化试剂盒，按其说明书的方法提取。
Example 1：实验中提取肾脏总蛋白，具体实验过程如下：1.提前一天4℃解冻RIPA，一定要完全融化；配PBS（用于细胞试验则需高压）；2.配制裂解液：PMSF:RIPA=1:99,PMSF终浓度为100mM（根据样本数配制所需的量，临用临配）；3.裂解组织：每个样品称取100mg，加1ml裂解液，匀浆后4℃静置2h使其充分裂解，14000g，4℃离心10min，取上清。
4.蛋白定量：取少量上清稀释30倍蛋白定量，然后计算出各样本原液蛋白浓度。
注意由于裂解液里含有较高浓度的洗涤剂，蛋白定量不能选用Bradford法，可以选用改良的Lowry’s法或者BCA法。
5.样品蛋白浓度均一化：根据蛋白定量计算的结果将各样品蛋白浓度调整一致。
具体方法为加入PBS稀释至样品浓度一致，本次蛋白浓度为3mg/ml。
Western Blot(免疫印迹法)实验方法步骤发布日期:2008-8-25 热门指数:4360Western Blot(免疫印迹法)主要包括以下4个基本步骤：n 样品制备n 电泳分离n 蛋白的膜转移n 免疫杂交与显色――蛋白检测溶液和试剂n 1X 磷酸盐缓冲液(PBS)n Modified RIPA bufferTris-HCl: 50 mM, pH 7.4 ; NP-40: 1% ;Na-deoxycholate: 0.25% ;NaCl: 150 mM ;EDTA: 1 mM ;PMSF: 1 mM ;Aprotinin, leupeptin, pepstatin: 1 microgram/ml each ;Na3VO4: 1 mM ;NaF: 1 mMn 1X SDS 样品缓冲液62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8 于25°C), 2% w/v SDS, 10%甘油,50 mM DTT, 0.01% w/v溴酚蓝n 转移缓冲液25 mM Tris base, 0.2 M 甘氨酸, 20%甲醇(pH 8.3)n 10X Tris缓冲盐(TBS)准备1L 10X TBS: 24.2 g Tris base, 80 g NaCl;用1N HCl调pH为7.6n 脱脂奶粉或BSAn 甲醇n TBS/T缓冲液1X TBS, 0.1% Tween-20）TBS/T封闭缓冲液（n1X TBS, 0.1% Tween-20加5% w/v脱脂奶粉或BSAn 一抗的稀释1X TBS, 0.1% Tween-20 加5% BSA (多抗)或5%脱脂奶粉(单抗)Note: 一般来说, BSA被推荐用于多克隆抗体，脱脂奶粉用于单克隆抗体，这样可得到较高的信噪比。
抗体的稀释度参考抗体说明书或根据实验确定。
n 预染的蛋白质Marker，可用于监测转膜的效率样品制备原始样品可为细胞、组织、培养上清、免疫沉淀或亲和纯化的蛋白，以下为定性检测目的蛋白时细胞样品的处理方法，其余的样品制备方法参阅相关文献。
