蛋白质印迹法 Western Blot技术

蛋⽩质印迹法（免疫印迹试验，WesternBlot）蛋⽩质印迹法（免疫印迹试验）即 Western Blot。

它是分⼦⽣物学、⽣物化学和免疫遗传学中常⽤的⼀种实验⽅法。

其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或⽣物组织样品进⾏着⾊。

通过分析着⾊的位置和着⾊深度获得特定蛋⽩质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。

蛋⽩免疫印迹（Western Blot）是将电泳分离后的细胞或组织中蛋⽩质从凝胶转移到固相⽀持物NC膜或PVDF膜上，然后⽤特异性抗体检测某特定抗原的⼀种蛋⽩质检测技术，现已⼴泛应⽤于基因在蛋⽩⽔平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个⽅⾯。

⼀提起Western blot，⼤家会不禁联想到Southern blot和Northern blot。

其实它们的名字也是个有趣的故事。

1975年，Edwin Southern教授发明了DNA杂交检测技术，故命名为Southern blot。

之后，James Alwine、David Kemp和George Stark三位教授⼜发明了RNA杂交检测技术，因与Southern blot相似，故命名为Northern。

George Stark这位⽜⼈教授在两年后⼜开发出类似的蛋⽩质检测⽅法。

1981年，Neal Burnette将其命名为Western blot。

为什么当时没叫Eastern blot呢？这⽆从考证，不过科学家们还真是挺有创意的。

30年来， Western blot技术已成为蛋⽩质研究中最常⽤的⼯具。

它的标准流程如下：蛋⽩质⾸先通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，再通过电泳转移到固相⽀持物上，固相⽀持物包括硝酸纤维素膜、PVDF膜和尼龙膜。

⾸先将膜上未反应的位点封闭起来，以抑制抗体的⾮特异性吸附，这样固定的蛋⽩质即可与特异性的多克隆或单克隆抗体相互作⽤。

最后通过放射、⽣⾊或化学发光的⽅法进⾏定位。

Western Blot原理与Northern Blot、Southern blot类似。

蛋白免疫印迹杂交 Western Blot 技术手册蛋白免疫印迹杂交 Western Blot WB 是将蛋白样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大小分离 再转移到杂交膜blot 上 然后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法。

WB是进行蛋白质分析最流行和成熟的技术之一。

本指南讨论Western Blot操作方法及常见问题分析 有助于成功完成WB。

A 蛋白样本提取制备1 细胞或组织裂解2 蛋白酶和磷酸酶抑制剂3 蛋白定量4 电泳上样样品的准备B 电泳 1 PAGE胶的制备2蛋白分子量Marker 3 阳性对照4 内参对照5 上样与电泳 C 转膜与显色Western Blot 1 胶中蛋白的检测2 蛋白转膜3 膜上蛋白的检测 丽春红4膜的封闭 5 一抗的孵育6 二抗的孵育7 显色 D 常见问题分析与解决方案附录1 WB实验试剂配制方法附录2 SDS-PAGE胶的配制2WB概述: 检测原理: 3A 蛋白样本提取制备蛋白样品制备是Western Blotting的第一步 更是决定WB成败的关键步骤 总体原则和注意事项 1 尽可能提取完全或降低样本复杂度只集中于提取目的蛋白 通过采用不同提取方法或选择不同的试剂盒产品 2 保持蛋白的处于溶解状态 通过裂解液的PH 盐浓度表面活性剂、还原剂等的选择 3 提取过程防止蛋白降解、聚集、沉淀、修饰等 低温操作 加入合适的蛋白酶和磷酸酶抑制剂 4 尽量去除核酸 多糖 脂类等干扰分子 通过加入核酸酶或采取不同提取策略 5 样品分装 长期于-80℃中保存 避免反复冻融。

A-1 细胞或组织裂解A-1-1 细胞裂解裂解液Lysis buffer或商品化蛋白抽提试剂盒的选择目的蛋白分布定位推荐裂解液Lysis buffe 推荐试剂盒全细胞NP-40 or RIPA 附录1 全蛋白抽提试剂盒细胞质 可溶蛋白 Tris-HCl 附录1 胞浆蛋白和核蛋白抽提试剂盒线粒体蛋白提取试剂盒细胞质 细胞骨架等不溶蛋白Tris-Triton 附录1 蛋白分级抽提试剂盒细胞质 磷酸化蛋白 磷酸化蛋白抽提试剂盒细胞膜NP-40 or RIPA 附录1 膜蛋白抽提试剂盒蛋白分级抽提试剂盒细胞核RIPA 附录1 核蛋白抽提试剂盒线粒体RIPA 附录1 线粒体蛋白抽提试剂盒亚细胞定位蛋白抽提试剂盒细胞裂解操作方法 1 培养的细胞经预冷的PBS漂洗2次 裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂 种类与量见本节2 2 吸净PBS 加入预冷的裂解液 1 ml per 107 cells/100mm dish/150cm2 flask 0.5ml per 5x106 cells/60mm dish/75cm2 flask. 3 用细胞刮子刮取贴壁细胞 将细胞及裂解液温和地转移至预冷的微量离心管中 4 4℃摇动30 min 5 4℃离心12000 rpm 20 min 根椐细胞种类不同调整离心力 6 轻轻吸取上清 转移至新预冷的微量离心管中置于冰上 即为蛋白样本 弃沉淀. A-1-2 组织裂解 1 用灭菌的预冷的工具分离目的组织 尽量置于冰上以防蛋白酶水解 2 将组织块放在圆底的微量离心管或Eppendorf管中 加入液氮冻结组织于冰上均质研磨 长期可保存于-80°C 3 每约5 mg加入约300 μl 预冷的裂解液lysis buffer 冰浴匀浆后置于4℃摇动2小时 裂解液体积与组织样本量有适当比例 最终的蛋白浓度至少达到0.1 mg/ml 理想的蛋白浓度应为1-5 mg/ml. 4 4℃离心12000 rpm 20 min 轻轻吸取上清 转移至新预冷的微量离心管中置于冰上 即为蛋白样本 弃沉淀A-2 蛋白酶和磷酸酶抑制剂 4 推荐购商品化蛋白酶和磷酸酶抑制剂复合试剂盒或COOKTAIL 或按下表配制 备注 其中Sodium orthovanadate 配制活化方法如下 所有步聚均需在通风橱中进行 1. 用双蒸水配制100 mM 正矾酸钠溶液. 2. 用盐酸HCl 调至pH 9.0 3. 煮沸至溶液无色尽量减少水分挥发. 4. 冷却至室温 5. 再调pH 至9.0 6. 再煮沸至无色7. 重复上述过程直至溶液煮沸冷却后达pH 9.0 8. 用水定容至原体积9. 分装保存于- 20°C. 溶液变黄则弃之不用. A-3 蛋白定量Bradford 法Lowry 法或BCA 法 均有商品化试剂盒可选择 操作简单、需分光光度计或酶标仪 小牛血清白蛋白BSA 作为标准曲线。

百泰派克生物科技
western blot技术
蛋白印迹（Western Blot，WB）也称免疫印迹，是一种基于抗体的蛋白质分析技术。

利用抗体-抗原的特异性相互作用可以在复杂的蛋白质混合物中识别感兴趣蛋白
（目标蛋白质），以实现感兴趣蛋白的定性和半定量分析，在蛋白质表达水平、抗
体活性、蛋白质相互作用以及蛋白质翻译后修饰分析中广泛应用。

WB主要包括以下步骤：
（1）样品分离：利用SDS-PAGE分离蛋白混合物；
（2）转膜：将蛋白条带从凝胶转移到固相载体——例如硝酸纤维素薄膜（NC）上。

固相载体可以吸附蛋白质，并保持电泳分离的蛋白质生物学活性不变。

转移后的
NC膜就称为一个印迹（blot）；
（3）标记鉴定：用目标蛋白的抗体（一抗）处理NC膜——只有待研究的蛋白质才能与一抗特异结合形成抗原抗体复合物，这样清洗除去未结合的一抗后，只有在目标蛋白的位置上结合着一抗。

用一抗处理过的NC膜再用二抗处理，二抗是指一抗
的抗体。

通常，第二抗体带有特殊标记，当与合适的底物结合时，会产生可检测的荧光信号，信号强度与膜上的目标蛋白的丰度相关。

通过以上步骤，可以捕获与一抗相互结合的感兴趣蛋白，用于判断感兴趣蛋白的存在与否以及一抗与感兴趣蛋白的相互作用分析；此外，还可根据荧光信号强度对目标蛋白进行半定量鉴定，用于蛋白质白表达水平分析。

百泰派克生物科技基于蛋白印迹WB以及Thermo公司最新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC提供蛋白质分析服务技术包裹，包括蛋白质定性定量
鉴定、蛋白质相互作用分析以及蛋白质翻译后修饰分析等，还可根据需求提供其他定制化检测方案，欢迎免费咨询。

Western blot，也称为蛋白质印迹或免疫印迹，是一种常用的生物化学技术，用于分析样品中特定蛋白质的存在、细胞中特异蛋白质的半定量分析以及蛋白质分子的相互作用研究等。

下面是Western blot的基本步骤和注意事项：一、实验步骤蛋白样品制备：从细胞或组织中提取蛋白质样品，常用的方法有细胞裂解、组织匀浆等。

蛋白定量：使用BCA蛋白浓度测定法等对蛋白质样品进行定量，以便后续的Western blot分析。

凝胶电泳：将蛋白质样品在聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，根据蛋白质的大小和电荷进行分离。

转膜：将电泳分离后的蛋白质样品转移到硝酸纤维素膜上，以便进行后续的免疫检测。

免疫检测：使用特异性抗体对转移后的蛋白质样品进行免疫检测，抗体与目标蛋白质结合后，通过显色反应呈现阳性结果。

数据分析：对免疫检测结果进行定量和定性分析，如条带大小、灰度值等。

二、注意事项实验前要充分了解实验原理和操作流程，确保实验的正确性和可行性。

蛋白样品制备过程中要保证细胞或组织充分裂解和匀浆，以获得更纯的蛋白质样品。

在进行Western blot分析前，要对蛋白质样品进行定量，以保证实验结果的准确性。

在转膜过程中，要选择合适的转移缓冲液和转移时间，以保证蛋白质样品的完整转移。

在免疫检测过程中，要选择合适的抗体和显色试剂，以保证免疫检测结果的特异性。

在数据分析过程中，要选择合适的分析方法和软件，以保证数据分析的准确性和可靠性。

总之，Western blot是一种常用的生物化学技术，在蛋白质分析领域具有广泛的应用价值。

在进行Western blot实验时，要严格遵守实验步骤和注意事项，以保证实验结果的准确性和可靠性。

蛋白质免疫印迹法原理
蛋白质免疫印迹法（Western Blot）是一种常用于检测蛋白质的方法。

其原理基于蛋白质电泳分离和特定抗体与目标蛋白质的特异性结合。

1. 样品制备：首先，待检样品经过蛋白质提取，然后经过电泳分离，通常使用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）将样品中的蛋白质根据其分子量大小分离。

2. 蛋白转膜：随后，将分离得到的蛋白质通过电泳转印到聚合物（如聚偏氟乙烯）膜上，形成蛋白质膜。

3. 阻断：将膜置于含有蛋白质阻断剂（如牛血清白蛋白）的缓冲液中，阻止非特异性结合。

4. 抗体结合：将膜与特异性抗体一起孵育，抗体与目标蛋白质特异性结合。

这些抗体通常是经过免疫动物制备，针对目标蛋白质的特定抗原位点。

5. 靶蛋白检测：使用荧光标记或酶标记的二抗（即与第一抗体结合的抗体）与第一抗体结合。

这些二抗能够使特定结合的蛋白质与检测标记发生反应。

6. 信号检测：使用荧光标记物或底物，通过荧光检测或发色反应检测结合的蛋白质。

常用方法是使用化学发光底物，比如辣根过氧化物酶和酮硫磺胺基碳酸红等底物。

通过这个原理，蛋白质免疫印迹法可以提供关于特定蛋白质的存在、相对丰度以及蛋白质分子量等信息。

它在分子生物学和生物医学研究中被广泛应用于蛋白质分析和诊断。

蛋白免疫印迹杂交〔Western Blot〕技术手册A蛋白样本提取制备蛋白样品制备是Western Blotting 的第一步，更是打算WB 成败的关键步骤，总体原则和留意事项：1：尽可能提取完全或降低样本简洁度只集中于提取目的蛋白〔通过承受不同提取方法或选择不同的试剂盒产品〕2：保持蛋白的处于溶解状态〔通过裂解液的PH 盐浓度外表活性剂、复原剂等的选择〕3：提取过程防止蛋白降解、聚拢、沉淀、修饰等，〔低温操作，参与适宜的蛋白酶和磷酸酶抑制剂〕4：尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子〔通过参与核酸酶或实行不同提取策略〕5：样品分装，长期于-80℃中保存，避开反复冻融。

A-1细胞或组织裂解A-1-1细胞裂解裂解液Lysis buffer 或商品化蛋白抽提试剂盒的选择*目的蛋白分布定位推举裂解液Lysis buffe 推举试剂盒全细胞NP-40 or RIPA〔附录1〕全蛋白抽提试剂盒细胞质〔可溶蛋白〕Tris-HCl〔附录1〕胞浆蛋白和核蛋白抽提试剂盒线粒体蛋白提取试剂盒细胞质〔细胞骨架等不溶蛋白〕Tris-Triton〔附录1〕蛋白分级抽提试剂盒细胞质〔磷酸化蛋白〕磷酸化蛋白抽提试剂盒细胞膜NP-40 or RIPA〔附录1〕膜蛋白抽提试剂盒蛋白分级抽提试剂盒细胞核RIPA〔附录1〕核蛋白抽提试剂盒线粒体RIPA〔附录1〕线粒体蛋白抽提试剂盒亚细胞定位蛋白抽提试剂盒细胞裂解操作方法：1培育的细胞经预冷的PBS 漂洗2 次，裂解液中参与蛋白酶和磷酸酶抑制剂〔种类与量见本节2〕2吸净PBS，参与预冷的裂解液，〔(1 ml per 107cells/100mm dish/150cm2flask; 0.5ml per 5x106cells/60mm dish/75cm2flask).3用细胞刮子刮取贴壁细胞，将细胞及裂解液温存地转移至预冷的微量离心管中，44℃摇动30 min54℃离心12,000 rpm，20 min〔根椐细胞种类不同调整离心力〕6轻轻吸取上清，转移至预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀.A-1-2组织裂解1 用灭菌的预冷的工具分别目的组织，尽量置于冰上以防蛋白酶水解，2 将组织块放在圆底的微量离心管或Eppendorf 管中，参与液氮冻结组织于冰上均质研磨，长期可保存于-80°C，3每约5 mg 参与约300 μl 预冷的裂解液lysis buffer，冰浴匀浆后置于4℃摇动2 小时，裂解液体积与组织样本量有适当比例，〔最终的蛋白浓度至少到达0.1 mg/ml, 抱负的蛋白浓度应为1-5 mg/ml).44℃离心12,000 rpm，20 min，轻轻吸取上清，转移至预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀,A-2蛋白酶和磷酸酶抑制剂推举购商品化蛋白酶和磷酸酶抑制剂复合试剂盒或COOKTAIL。

western blot技术的原理方法注意事项一、原理Westernblot是一种常用的蛋白质检测技术，其基本原理是蛋白质的印迹技术，即把蛋白质从复杂的样品中分离出来，并转移到固相支持物上，再与特异性抗体结合，通过显色或电子显微镜观察鉴定蛋白质的表达和分布情况。

二、方法1.样品处理：首先，需要将蛋白质样品进行提取、分离和纯化。

根据样品性质，可以采用不同的提取方法，如细胞裂解液、组织匀浆液等。

2.凝胶电泳：将分离纯化的蛋白质样品转移到分离胶中，通过电泳将不同分子量的蛋白质分离。

3.免疫反应：将膜上的蛋白质与特异性抗体结合，形成抗原-抗体复合物。

4.显色反应：通过化学反应，使抗原-抗体复合物显色，便于观察和拍照。

5.电子显微镜观察：对于较小的样品，可以采用电子显微镜对蛋白质进行观察和定量分析。

三、注意事项1.样品处理：提取的蛋白质样品应尽可能保持完整性和纯度，避免在提取、分离和转移过程中发生变性或降解。

2.凝胶电泳：分离胶的选择应根据待测蛋白质的分子量大小进行，以确保蛋白质能够完全分离。

同时，应注意电泳过程中的电压、电流和时间等参数，避免过度电泳导致蛋白质失活或降解。

3.免疫反应：应注意抗体滴度的选择，确保抗体能够充分识别目标蛋白质。

同时，应避免使用过期或质量不佳的抗体。

4.显色反应：应注意显色试剂盒的质量和操作步骤，确保显色反应充分且颜色易于观察。

同时，应注意显色颜色的稳定性，避免因颜色不稳定影响结果判断。

5.电子显微镜观察：应注意电子显微镜的操作步骤和设备维护，确保电子显微镜能够正确成像。

同时，应注意样品的制备和处理，确保样品能够被电子显微镜准确观察。

6.实验条件：实验过程中应注意调整实验条件，如孵育时间、洗膜次数、抗体稀释度等，以确保实验结果的准确性和可靠性。

7.重复性：在进行Westernblot实验时，应注意重复性实验的开展，以减少实验误差和提高实验结果的可靠性。

总之，Westernblot技术虽然复杂，但只要掌握了其原理和方法，并注意以上注意事项，就能够获得准确可靠的结果。

western blot法的方法Western blot法，也称为蛋白质印迹技术，是一种分离和检测蛋白质的常用方法。

它可以用于检测蛋白质的存在、纯度和相对数量，以及探究蛋白质的结构和功能。

Western blot法的方法包括以下步骤：1. 蛋白质电泳分离：将待检测的蛋白质样品加入聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）中进行电泳分离。

SDS-PAGE可以将蛋白质按照大小分离，同时使用SDS可以使蛋白质带有负电荷，使其移动速度更加均匀。

2. 转移：将蛋白质从凝胶转移到聚乙烯膜（PVDF）或硝酸纤维素膜（NC）上。

转移可以使用湿法或半湿法。

转移完成后，膜可以用Ponceau S染色来确认蛋白质转移的效果。

3. 阻断：用牛血清蛋白（BSA）或非脂类奶粉等阻断剂将膜表面的非特异性结合位点阻断。

4. 一抗：加入第一抗体（primary antibody）来和目标蛋白质结合。

第一抗体通常是针对目标蛋白质特异性的抗体。

5. 二抗：加入二抗（secondary antibody）来特异性地结合第一抗体。

二抗通常是被标记的抗体，例如辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗体。

这种标记的抗体可以用化学发光（ECL）或荧光染料来检测。

6. 洗膜：用缓冲液反复洗膜，以去除未结合的抗体和其他非特异性的蛋白质。

7. 检测：用ECL或荧光染料检测目标蛋白质的存在。

ECL的原理是使标记的抗体和蛋白质结合后，加入亚甲基四胺（AMPPD）和过氧化氢（H2O2）溶液，使其发光，荧光染料则是在荧光检测器中直接检测。

需要注意的是，Western blot法并非完美的技术，其结果可能受到多种因素的影响，如抗体的质量、蛋白质样品的处理方法和电泳条件等。

因此，在进行Western blot实验时，需要细心、认真、标准化地操作，才能得到准确可靠的结果。