多重PCR技术在寄生虫病诊断上的应用及其建立方法
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综述文摘多重PCR 技术在寄生虫病诊断上的应用及其建立方法的浅析 石云良,黄维义,张为宇3,施 维,王树艳 (广西大学动物科学技术学院,南宁530005)中图分类号:S854.42 文献标识码:B 文章编号:1002-5235(2010)01-0059-02 对于未知病原体感染和多病原体的混合感染,应用常规PCR 方法往往需要多次扩增筛选,相对费时、费力。
而多重PCR 能够在同一反应体系内扩增多个靶序列,可进行多病原体的快速鉴定。
目前多重PCR 技术已广泛应用于病毒性、细菌性疾病的临床诊断,在寄生虫病诊断方面,多重PCR 的应用也日渐增多,应用前景广阔。
1 多重PCR 在线虫诊断上的应用Zarlenga 等(2001)[1]根据线虫内外转录间隔区序列(ITS 和ETS ))设计了5对特异性引物,建立了可同时鉴别诊断五种造成重大经济损失的牛胃肠道线虫病的多重PCR 方法,可特异性扩增奥氏奥斯特他(氏)线虫(257bp )、帕莱斯(氏)血矛线虫(176bp )、辐射结节线虫(329bp )、蛇形毛圆线虫(243bp )和点状古柏线虫(151bp )。
每种样品的模板最低检测量仅为20pg ,不仅可以鉴别不同成虫基因组DNA ,也可以区别实验动物感染的虫卵种属。
剪股颖粒线虫、小麦粒线虫和维氏粒线虫是3种重要的植物病原线虫,它们在成熟种子和虫瘿中的虫态通常是幼虫,而这3种线虫的幼虫形态非常相似,难以根据其特征对它们进行快速准确的种类鉴定。
马以桂等[2]根据这3种线虫的rD 2NA -ITS 区域序列,设计3对特异性引物,建立了多重PCR 检测体系,获得3种线虫的特异性片段,大小分别为499bp 、617bp 和377bp 。
2 多重PCR 在原虫诊断上的应用Figueroa 等[3]建立了牛巴贝斯虫、牛双芽巴贝斯虫和牛边缘边虫的多重PCR 诊断技术,扩增的片段大小分别为350bp 、278bp 和200bp 。
同时还具有较好的敏感性。
Alhassan 等[4]根据18S rRNA 基因的特征设计特异性二重PCR 引物,可同时鉴别扩增马巴贝斯虫和驽巴贝斯虫,扩增片段为基金项目:广西科技攻关项目(桂科攻0719004-3E )3 通讯作者。
E -mail :zweiyu @.540bp 和392bp 。
用建立的多重PCR 技术对39份样品进行检测,结果发现该方法的检测结果与原先用来确诊的单重PCR 检测结果相一致,该多重PCR 技术提供了一种简便鉴别马巴贝斯虫和驽巴贝斯虫的手段。
微孢子虫是引起HIV 感染者或艾滋病患者腹泻的重要病原体。
2004年Verweij [5]建立了能够同时检测粪便中拜氏微孢子虫和脑炎微孢子虫属的多重实时PCR 诊断技术,以溶组织内阿米巴、迪司帕阿米巴、蓝氏贾第鞭毛虫、小球隐孢子虫、环孢子虫、产气肠杆菌等22种常见的病原菌和寄生虫作为对照,发现这两对引物未与对照的22种病原发生交叉扩增,用建立的多重PCR 方法对140份确定虫体的粪便样品进行检测,结果与镜检的相一致。
3 多重PCR 在绦虫诊断上的应用G onzalez 等[6]根据牛带状绦虫和猪带状绦虫的HDP2基因的特征,设计多重PCR 鉴别诊断引物,两种绦虫分别产生600bp 和170bp 目的带。
2004年Yamasaki 等[7]根据绦虫的细胞色素c 氧化酶亚基I 基因建立了鉴别诊断牛带绦虫、亚洲带绦虫、美国/非洲和亚洲的猪带绦虫的多重PCR 诊断方法,扩增片段分别为827bp 、269bp 、720bp 和984bp ,该方法只需要30～50mg 的样品量就可以进行检测,不仅适用于绦虫病和囊虫病的检测,也适用于这几种病的分子流行病学调查。
4 多重PCR 在吸虫诊断上的应用Thanh 等[8]根据支睾吸虫和后睾吸虫的线粒体DNA 序列建立支睾吸虫和后睾吸虫的二重PCR 鉴别诊断技术,扩增片段的大小分别为612bp 和1357bp ,敏感性试验表明该技术的最低检出量为0178ng 。
成虫、尾蚴、虫卵的DNA 都可以进行检测,可以用来鉴别检测鱼中支睾吸虫的囊蚴或是人体中感染的成虫和虫卵。
95广西畜牧兽医 2010年Vol.26(1)5 建立多重PCR诊断技术要点的浅析多重PCR诊断技术建立的过程中最关键的步骤就是诊断引物的设计,现在用于引物设计的软件也比较多,最常用的是oligo610和primer510,还可以在线进行引物设计如NCB I上的primer-BLAST等。
多重PCR引物的集合可以分为两种:一种是引物均为自己设计合成;另一种是多重引物中的某一条是已报道引物,需要自己设计合成其他的引物。
对于这两种情况我们都可以使用oligo 610或是primer510设计单条引物,然后进行组合的筛选,筛选条件除了符合一般引物设计的原则外,多重引物的Tm值应比较相近,各引物之间没有明显的连续错配和结合。
另外引物设计软件primer express210也可用于多重PCR引物的筛选,该软件里面有专门用于多重PCR引物的设计(multiplex PCR),当你输入两个或两个以上的序列片段时,它会自动筛选最优的多重引物组合,但其缺点是软件自动在整个序列之内进行筛选,因此要求输入的靶DNA序列具有较高的特异性。
除引物设计外,反应条件的优化是另一个重要影响因素。
退火温度、氯化钾浓度、镁离子浓度、引物浓度、扩增的时间和循环数等均会影响反应的扩增。
Henegariu等[9]指出,多重PCR诊断方法的优化过程中,退火温度以及反应体系中氯化钾的浓度是决定反应特异性的最重要因素,反应中氯化镁的浓度需和dN TP的浓度相适应,引物浓度和扩增的循环数在一定的范围内没有很明显的区别。
因此在建立多重PCR诊断过程中,应摸索出最适合的退火温度和氯化钾浓度,以及相匹配的镁离子和dN TP的浓度。
此外建立的多重PCR诊断方法需应用于一定数量样品的检测,加以验证。
6 展望多重PCR技术不仅应用于寄生虫的诊断,在寄生虫的基因分型以及药物位点筛选等方面也已得到了广泛应用[10,11],尽管普及还有一定的困难,首先多重PCR的各对引物之间存在一定的竞争性结合各种反应组分,在很多情况下多重PCR比单重PCR的敏感性稍低一些。
此外PCR技术自身的要求和操作人员的技术水平等原因也限制其推广和普及。
但是随着分子生物学技术的不断发展,该技术一定会得到进一步完善和推广。
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