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PCR技术的原理举例说明其应用1. PCR技术的简介PCR（聚合酶链反应）是一种重要的分子生物学技术，可在短时间内扩增特定DNA片段。
PCR技术的原理基于DNA的复制过程，通过不断的循环反应，在短时间内制备大量DNA的复制产物。
2. PCR技术的基本原理PCR技术主要包括三个步骤：变性、退火和延伸。
2.1 变性变性步骤是将待扩增的DNA样本进行高温处理，使DNA双链解离成单链。
这一步骤通常需要在96℃左右进行，使DNA的氢键断裂，使DNA变为单链状态。
2.2 退火退火步骤是将温度调低至50-65℃，引入引物（即扩增反应的两端），使其与待扩增的DNA序列互相结合。
引物是一段能够特异性结合到待扩增片段的单链DNA序列。
2.3 延伸延伸步骤是将温度升至72℃，在此温度下添加DNA聚合酶，开始合成新的DNA链。
DNA聚合酶能识别引物和DNA模板，并在引物的基础上合成互补的DNA链。
PCR反应通常会重复进行数十次，每一轮循环都会使DNA模板的数量翻倍，从而扩增目标DNA片段。
3. PCR技术的应用举例PCR技术在许多领域都有广泛的应用，包括基因组学研究、疾病诊断和法医学等。
以下是PCR技术应用的一些示例。
3.1 基因组学研究PCR技术在基因组学研究中起着重要的作用。
科学家可以利用PCR技术扩增和纯化目标基因或基因组区域。
这使得研究者能够更好地了解基因的结构和功能，并探索基因与疾病之间的关系。
3.2 疾病诊断PCR技术在疾病诊断中被广泛应用。
例如，PCR可以用于检测病原体的存在，如细菌、病毒和寄生虫等。
通过扩增和检测特定的DNA序列，可以确定是否存在特定的病原体，并且判断感染的程度。
3.3 法医学PCR技术在法医学中也被广泛应用。
通过使用PCR技术，可以从犯罪现场的DNA样本中扩增和分析特定的DNA序列。
这些序列可以用于确定嫌疑人的身份，提供法律依据。
3.4 环境监测PCR技术还可以用于环境监测。
例如，科学家可以利用PCR技术检测水源、土壤和空气中的微生物。
动物疾病常用诊断方法动物疾病的常用诊断方法主要包括临床诊断、实验室诊断和影像诊断三种。
一、临床诊断临床诊断是通过观察病畜的临床症状和体征，结合病史与疫情资料，进行初步判断和诊断的方法。
一般包括以下几个方面的内容：1.病史调查：了解动物的饲养管理情况、养殖历史、疫情情况等，以帮助判断疾病的起因、发展和传播途径。
2.病畜观察：观察动物的自然行为、饮食情况、精神状态、体温、心率、呼吸、排泄等，可以初步判断是否患有其中一种疾病。
3.临床症状与体征：观察动物出现的疾病症状和临床体征，如发热、消瘦、腹泻、咳嗽、呕吐、舌质颜色等，有助于指导进一步的诊断和治疗。
4.实验室检查：临床医生可以通过简单的实验检查，如血液检查、尿液检查、粪便检查等，获得一些直接的或间接的信息，配合临床表现得出初步的诊断。
二、实验室诊断实验室诊断是通过实验室检测和分析，从病畜体内获取的样品中，一般包括动物的血液、尿液、粪便、病灶组织、分泌物及排泄物等，以检测病原体或其相关成分，为疾病的诊断和鉴定提供实验室依据的方法。
实验室诊断主要包括以下内容：1.细菌学检查：主要通过细菌培养和鉴定，观察细菌的形态、生理特性、产生的代谢产物等，以确定细菌的类型和数量，并进行药敏试验，以指导药物的选择。
2.病毒学检查：通过病毒分离、培养、鉴定、免疫组织化学检测、核酸检测等方法，来鉴定感染动物体内是否存在病毒，同时可以确定病毒的类型和数量。
3.寄生虫学检查：通过寄生虫的诱导拒白试验、盐水浸吻试验、粪便检查、血液检查等方法，来确定感染寄生虫的种类、数量和感染程度。
4.分子生物学检查：主要通过核酸检测，如PCR、RT-PCR、ELISA等方法，来检测病原体的核酸序列，以确定是否感染病原体和其类型。
5.免疫学检查：通过免疫血清学方法，如血清学反应、酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫电泳、免疫组化等方法，来鉴定抗原和抗体的存在，以辅助诊断疾病。
三、影像诊断影像诊断是通过应用断层成像（CT、MRI）、X线摄影、超声声像图（B超）、核磁共振成像（MRI）、放射性同位素扫描等技术，对动物组织和器官进行断层或连续成像，并进行图像分析和解释，以辅助动物疾病的诊断和治疗。
动物检疫中实验室检验的主要方法动物检疫是通过对动物体内的样本进行实验室检验，以便检测出一些疾病、寄生虫及其他有害生物。
以下是动物检疫中常用的实验室检验方法：1. 细菌培养：用于检测动物体内的细菌感染，主要通过从样本中取得细菌并将其培养在适当的培养基上。
培养后，通过观察细菌的形态特征、生长速率和产生的代谢产物来确定细菌的种类和数量。
2. 病毒分离和鉴定：针对动物患病的病毒感染，可以采用细胞培养、鸡胚培养或小鼠接种等方法，将动物体内的病毒分离出来。
分离后，可以使用免疫荧光、酶联免疫吸附试验（ELISA）或PCR等技术对病毒进行鉴定和定量。
3. 血清学检验：检测动物体内的免疫反应，主要通过血液样本中的血清进行。
血清中的抗体水平可以通过酶联免疫吸附试验、补体结合试验或中和试验等方法进行测定，以确定动物是否感染某种病原体，并评估其免疫状态。
4. 寄生虫检测：用于检测动物体内的寄生虫感染，包括内寄生虫和外寄生虫。
内寄生虫的检测常通过粪便检查，利用显微镜观察寄生虫卵或幼虫的存在和数量。
对于外寄生虫，可以通过沾取动物毛发或皮肤组织样本，用显微镜观察或进行分离培养来检测寄生虫的存在。
5. 分子生物学方法：包括PCR、实时定量PCR和基因测序等技术，可以用于检测动物体内的病原体DNA或RNA。
这些方法在诊断疾病、监测感染水平以及进行病原体基因型鉴定等方面具有高灵敏度和高特异性。
6. 组织学检查：对于一些疑难病例，可以通过组织学检查来确定疾病的诊断。
常用的方法包括组织切片染色和显微镜观察，可以帮助确定动物体内的病理变化和病因。
总之，动物检疫中的实验室检验方法丰富多样，根据需要选择合适的方法进行检测，以确保动物的健康和防控有害生物的传播。
这些检验方法的应用可以帮助监测和预防动物病原体的传播，保护人畜健康和农业生产安全。
《兽医寄生虫学》-寄生虫学基础知识一.寄生虫与宿主类型（一）.寄生虫与寄生虫类型1.寄生虫：暂时或永久地在宿主体内或体表、并从宿主身上取得它们所需要的营养物质的动物。
2.寄生虫类型（1）.内寄生虫与外寄生虫内寄生虫：寄生于消化道的线虫、绦虫、吸虫等；外寄生虫：寄生于皮肤表面的蜱、螨，虱等。
（2）.单宿主寄生虫与多宿主寄生虫单宿主寄生虫（土源性寄生虫)：蛔虫，钩虫等；多宿主寄生虫(生物源性寄生虫)：多种绦虫和吸虫等。
（3）.长久性寄生虫与暂时性寄生虫长久性寄生虫：蛔虫，绦虫；暂时性寄生虫(间歇性寄生虫)：蚊子等。
（4）.专一宿主寄生虫与非专一宿主寄生虫专一宿主寄生虫：人的体虱只寄生于人，鸡球虫只感染鸡等；非专一宿主寄生虫：肝片形吸虫可以寄生于牛、羊等多种动物和人。
一般来说对宿主最缺乏选择性的寄生虫，是最具有流动性的，危害性也最为广泛，其防治难度也大为增加。
（二）.宿主与宿主类型1.宿主：凡是体内或体表有寄生虫暂时或长期寄生的动物都称为宿主。
2.宿主的类型（1）.终末宿主：猪带绦虫(成虫）寄生于人的小肠内，人是猪带练虫的终末宿主；弓形虫的有性生殖阶段(配子生殖）寄生于猫的小肠内，猫是弓形虫的终末宿主。
（2）.中间宿主：猪带绦虫的中绦期猪囊尾蚴寄生于猪体内中，所以猪是猪带绦虫的中间宿主；弓形虫的无性生殖阶段(速殖子、慢殖子和包囊）寄生于猪、羊等动物体内，所以猪、羊等动物是弓形虫的中间宿主。
（3）.补充宿主(第二中间宿主)：双腔吸虫在发育过程中依次需要在蜗牛和蚂蚁体内发育，其补充宿主是蚂蚁。
（4）.贮藏宿主(转续宿主)或叫转运宿主：鸡异刺线虫的虫卵被蚯蚓吞食后在蚯蚓体内不发育但保持感染性，鸡吞食含有异刺线虫的蚯蚓可感染异刺线虫，所以蚯蚓是鸡异刺线虫的贮藏宿主。
（5）.保虫宿主：耕牛是日本血吸虫的保虫宿主。
（7）.带虫宿主(带虫者)：牛的巴贝斯虫。
（8）.传播媒介：蚊子在人之间传播疟原虫，蜱在牛之间传播巴贝斯虫等。
简介PCR仪就是利用pcr技术原理进行DNA复制扩增的仪器。
使用PCR 仪按一定步骤进行实验操作，就可以将一段基因复制为原来的成百上千亿倍，因此我国也一直推进pcr仪的产业发展和技术进步，国内也出现了一批技术先进的pcr仪品牌和公司。
PCR技术是通过DNA聚合酶对特定基因做体外或试管内的大量合成，基本上它是利用DNA聚合酶进行专一性的连锁复制。
原理利用升温使DNA变性，在聚合酶的作用下使单链复制成双链，进而达到基因复制的目的。
产品基本应用PCR技术具有敏感度高、特异性强、快速简便等优点，在医学、遗传学、法医学、微生物学、食品检验、卫生检验等众多领域中具有巨大的应用价值和广阔的发展前景。
（1）生命科学a、人类基因组计划随着的PCR日臻完善，科学家于2003年在完成的人类基因组“工作框架图”的基础上，经过整理、分类和排列后得到的更加准确、清晰、完整的基因组图谱。
这是对人类基因组基本面貌的首次揭示，表明科学家们开始部分“读”出人类生命“天书”所蕴涵的内容。
b、后基因组计划人类基因组DNA序列图谱完成后，鉴定基因组多态性及其单倍型以及寻找其在生物和医学应用中重要成为人们关心的热点。
以研究基因功能为核心的“后基因组时代”已经来临，大规模的结构基因组、蛋白质组以及药物基因组的研究计划已经成为新的热点。
c、物种的分类、进化及亲缘关系可以进行物种进化的保守性分析及物种多态性分析、物种鉴定。
（2）医药a、遗传病的产前诊断：用胎儿羊膜细胞，羊水或甚至母血可以检查胎儿的性别，这在与性染色体关联遗传病诊断中是必要的。
对于高发的遗传病，如地中海贫血、镰刀状细胞贫血、凝血因子缺乏、DMD 等已在临床应用多年，为优生优育作了贡献，对于有遗传倾向的疾病尤其是老年性疾病，如糖尿病、高血脂症、甚至肿瘤中的一部分，均是当前研究的重点，近期内可望有突破。
b、致病病原体的检测：检测范围包括细菌、病毒（SARS及禽流感病毒H5N1等）、原虫及寄生虫、霉菌、立克次体、衣原体和支原体等一切微生物。
肉牛双芽巴贝斯虫病的临床症状、诊断及其防治措施-养牛技术肉牛双芽巴贝斯虫病是一种血液寄生虫病，病牛临床上主要特征是体温明显升高，能够达到42℃左右，黄疸、贫血，血红蛋白尿，机体迅速消瘦。
临床上常出现血红蛋白尿，故也称为红尿或血尿病，严重影响牛的健康。
每年的7-9月份为发病高峰，主要是小于2岁的牛最容易发病，但症状较轻，基本不会发生死亡，而成年牛尽管较少发病，但症状严重，容易死亡。
下面就具体来了解一下：肉牛双芽巴贝斯虫病的临床症状、诊断及其防治措施。
1、临床症状病牛临床上先是表现出明显发热，体温能够升高达到40-42℃，通常达到大约41.5 ℃，呈现稽留热，往往能够超过7天。
脉搏增数，呼吸急促、困难，出现张口呼吸，少数会将舌头伸到口外，且无法收回，伴有大量流涎，类似牛巴氏杆菌病的症状，精神萎靡，往往呈卧地状。
食欲不振甚至完全废绝，反刍缓慢，有时甚至完全停止，还发生腹泻、便秘，有时会排出混杂黏液的黑褐色粪便，并散发恶臭味。
病牛发生血红蛋白尿，排出的尿液颜色从淡红色逐渐变成棕红色，最后变成黑红色。
机体贫血、消瘦，黏膜黄染或者苍白，对心脏听诊，发现心律不齐。
2、病理变化病死牛尸体明显消瘦，尸僵明显，血液稀薄，且不容易凝固；体表淋巴结发生肿大；皮下组织发生充血、水肿以及黄染；胆囊有所胀大，胆汁变得稀薄；脾脏质地柔软，发生肿大，存在出血点；肺脏呈肉样病变，存在淤血，发生水肿；肾脏发黄，有所肿大，存在出血点；真胃和小肠黏膜发生水肿，并存在点状出血；膀胱黏膜存在出血点，积聚较多的淡红色尿液。
3、实验室诊断虫体检查。
在病牛的耳尖静脉处取血进行涂片，待其自然干燥后使用甲醇进行5 min 固定，再使用2%姬姆萨进行40-50 min染色，然后进行冲洗，待其干燥后放在40×10倍和100×10倍显微镜下进行镜检。
在400倍镜下能够发现红细胞内存在双芽巴贝斯焦虫，虫体长度要比红细胞半径大，呈香蕉状，往往成对排列，且尖端相连形成锐角，还存在多种形态的虫体。
1 动物寄生虫病PCR诊断技术 聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）技术是一种既敏感又特异的DNA体外扩增方法，它可将一小段目的DNA扩增上百万倍，其扩增效率使得该方法可检测到单个虫体或仅部分虫体的微量DNA。通过设计种、株特异的引物，此法只扩增出种、株特异的PCR产物，具有很高的特异性。而且PCR技术的操作过程也相对简便快捷，无需对病原进行分离纯化；同时可以克服抗原和抗体持续存在的干扰，直接检测到病原体的DNA，既可用于虫种、株的鉴别，动物寄生虫病的临床诊断，又可用于动物寄生虫病的分子流行病学调查。随着PCR技术的不断完善与发展，它已广泛应用于分子生物学、生物技术、临床医学等各个领域，具有广泛的应用前景。 一、实验目的要求 掌握PCR诊断技术所涉及实验的基本原理，全面熟悉PCR诊断技术的操作过程，其中包括寄生虫DNA的提取、PCR引物的设计、PCR条件的优化、对目的片断的扩增、琼脂糖凝胶电泳及结果分析、PCR产物的纯化等等。 二、实验仪器和材料 （一）寄生虫基因组DNA的提取及纯化 1.虫体材料。 单个虫体。 2.器具。 超净工作台、恒温培养箱、TGL-16G高速台式离心机、旋涡振荡器、微量取液器及配套吸头、微量离心管、一次性注射器、微型眼科镊、微型眼科剪刀、玻璃平皿、滴管、有机架等。 3.试剂。 (1) 乙二胺四乙酸（ Ethylene diaminetetra acetic acid，EDTA）、十二烷基磺酸钠（Sodium dodecyl sulfate，SDS）、三（羟甲基）氨基甲烷-盐酸（Tri (Hydroxymethyl) Aminomethane-HCl，Tris-HCl）、氯化钠、蛋白酶K（25µg/µl）、异丙醇（80%）、双蒸水、灭菌超纯水等。 (2) DNA裂解液：500 mM NaCl 70 µl 、100 mM Tris-HCl（pH 8.0）30 µl、50 mM EDTA（pH 8.0）150 µl、10%SDS 30 µl。 (3) WizardTM DNA Clean-Up 试剂盒或类似的DNA提取试剂盒。 （二）PCR扩增及琼脂糖电泳 1．材料。 提纯的虫体DNA。 2．器具。 超净工作台、微型高速台式离心机、微量取液器（2/20/200/1000 µl）、PCR扩增仪、琼脂糖电泳系统、凝胶成像系统、微波炉、4℃/-20℃冰箱、紫外透射仪、微型离心管（200/500/1500 µl）、有机架、一次性手套、透明胶带、量筒（100 ml）、三角瓶（500 ml）等。 3．试剂。 (1) 10×PCR Buffer（无Mg2+）、dNTP（2.5 mM each）、ddH2O 、MgCl2（25 mM）、Primers、Ex Taq酶（5 U/l）、琼脂糖、EB（10mg/ml）、Tris碱、硼酸（Boric acid）、去离子水、EDTA（0.5 mol/L，pH 8.0）、10×载样缓冲液。 (2) 0.5×TBE缓冲液：准确秤取Tris碱5.4g，硼酸2.75g，充分溶解于800 ml去离子水中，加10ml 0.5 mol/L EDTA（pH8.0），用去离子水定容至1000ml。 （三）PCR扩增产物的纯化 1．材料。 PCR扩增产物。 2．器具。 TGL-16G高速台式离心机；三用电热恒温水箱；微量取液器（2/20/200/1000 µl）、琼脂糖电泳系统、微波炉、电子天平、4℃/-20℃冰箱、紫外透射仪、微型离心管（500/1500 µl）、有机架、透明 2
胶带、一次性注射器、量筒（100ml）、三角瓶（500ml）、手术刀、保鲜纸等。 3．试剂。 琼脂糖；0.5×TBE缓冲液；UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒；UNIQ-10柱式PCR产物纯化试剂盒；异丙醇（80%）等。 三、实验方法、步骤和操作要领 (一) 寄生虫基因组DNA的提取及纯化 1.实验原理。 应根据研究目的来决定是从单个虫体还是多个虫体提取基因组DNA。寄生虫虫体的各个部位都可以作为基因组DNA的抽提材料，如果虫体较大的话可取其中部而保存其头部及尾部，以备形态学鉴定以验证其种类。如果虫体较小（小于1 cm），则应使用整条虫体抽取DNA。若虫体特别细小（例如幼虫），可用多条虫体来提取DNA。为了获得高含量、高纯度的DNA，最好使用新鲜材料。从冻干或50%-70%乙醇保存的寄生虫材料中也可较容易地提取DNA。 寄生虫DNA的抽提方法有多种，不同种类的寄生虫虫体都有其最适合的抽提方法，但各种方法的基本原理都一样，即先用机械的方法将虫体组织破碎，然后加入DNA裂解液和蛋白酶K，充分作用后，虫体组织中的细胞膜破裂，蛋白质变性，将虫体基因组DNA释放到溶液中。在裂解过程中，虫体细胞碎片及大部分蛋白质会相互缠绕成大型复合物，后者被DNA裂解液中的SDS包盖，通过离心沉淀，这些复合物会从溶液中沉淀下来，变性剂也同时被除去，从而就可从上清中回收虫体基因组DNA溶液。回收后的虫体基因组DNA液用WizardTM DNA纯化试剂盒进行纯化。纯化时，DNA溶液与纯化试剂盒中的清洗树脂混合后，其混合液在通过微型柱时DNA会结合在柱上，而其它杂质会通过微型柱排出；再用80%异丙醇进行冲洗，去除残余杂质。最后，在微型柱中加入预热的TE缓冲液或超纯水，使结合在微型柱上的DNA充分溶解，通过离心，其洗脱液即为纯化的虫体基因组DNA溶液。 2．实验方法、步骤和操作要领。 (1) 虫体材料的处理(若为新鲜或冻干保存的虫体，则不需要此步骤)。 若虫体较大，用镊子将保存在70%的酒精溶液中的虫体材料取出，剪取其中部，保存其头端或尾端部分。用双蒸水反复吹打冲洗2次后，再用超纯水反复冲洗2～3次，置于一新的1.5ml的离心管中。若虫体较小，取一整条虫体经如上洗涤处理。 对于鸡球虫，将保存在2.5%重铬酸钾溶液的卵囊悬液以2000×g离心10min，弃重铬酸钾溶液。以双蒸水重悬，同法离心洗涤三次后，用20%次氯酸钠处理卵囊20min，2000×g离心沉淀卵囊，用适量饱和盐水重悬卵囊沉淀，1500×g离心10min，上清液加入4倍体积的灭菌双蒸水，3000×g离心10min。卵囊沉淀再用上述方法重新漂浮、洗涤一次。用少量灭菌双蒸水重悬卵囊沉淀，然后将其轻轻地加在0.6M无菌蔗糖溶液之上，2000×g离心5min，取上层卵囊加5倍体积的水，3000×g离心10min，沉淀再用无菌蔗糖溶液漂浮一次，即可得纯净的卵囊，可立即用于裂解以提取DNA。 (2) 虫体材料的裂解。 用灭菌且经紫外灯照射过的微型眼科剪刀将虫体组织剪碎，加入280µl的SDS裂解缓冲液，轻轻混匀，再加入20µl（25µg/µl）的蛋白酶K溶液。对于原虫如鸡球虫、隐孢子虫，将纯化好的卵囊3000rpm/min 离心10min，去掉大部分上清后加入与卵囊体积相同的玻璃珠，漩涡震荡直到有95％卵囊破壁后，即可加入SDS裂解缓冲液及蛋白酶K溶液。混匀后，放于恒温培养箱中，37℃作用12～48 h，其间不时摇动离心管，使虫体组织裂解充分。 (3) 虫体DNA的抽提和纯化。 首先进行虫体DNA提取，然后按Promega公司试剂盒WizardTM DNA Clean-Up System使用说明对DNA进行纯化。方法如下： ① 取出于恒温培养箱中作用了约20小时的离心管，旋涡震荡器震荡混匀，10000rpm离心2min，上 3
清即为虫体DNA溶液。将上清转移至一新的离心管中，加入1ml清洗树脂（按50～500µl悬液/1 ml清洗树脂的比例），旋涡震荡混匀。 ② 取一支5ml的一次性注射器，去针头，拔出注射器内芯推液筒，接上WizardTM微型柱。 ③ 将DNA-树脂混合液全部转移到注射器中，用注射器内芯推液筒，慢慢地将DNA-树脂混合液推过微型柱，排出废液。 ④ 将注射器从微型柱上拔出后，拿去注射器内芯推液筒，再将注射器套在微型柱上，向注射器内加入2 ml 柱洗溶液（80%的异丙醇），用注射器内芯推液筒慢慢将洗柱液通过微型柱，以洗涤DNA-树脂样品。 ⑤ 拔去注射器，将微型柱套在洁净的1.5ml离心管上，10000rpm离心20sec，以除去残留的异丙醇。 ⑥ 将微型柱从注射器上转移到一新的离心管上，在柱中央加入30～50µl预热（60～70℃）的超纯水或1×TE缓冲液，静置1 min，10000rpm离心20sec。离心管内的液体即为DNA溶液。可将DNA溶液转移至0.5 ml离心管中于-20℃冰箱保存备用。 （二）寄生虫DNA的PCR扩增及琼脂糖电泳 1.实验原理。 (1) PCR引物设计。 PCR反应成功扩增的一个关键条件在于寡核甘酸引物的正确设计。PCR引物设计的目的是找到一对合适的寡核甘酸片段，使其能有效地与目的片段两端的序列互补。设计引物时要遵循以下原则： ① 长度不能太长，也不能太短，一般在18～25个碱基左右； ② G+C含量及Tm值：引物的G+C含量以40%～60%为宜。引物的Tm值是指寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下50%寡核苷酸双链的解链温度。PCR引物应保持合理的G+C含量。含有50%G+C的20个碱基的引物其Tm值约界于56～62℃，这可为有效退火提供足够的温度。由于G+C间的氢键数较A+T间多，因此，G+C含量高的DNA片段其Tm值也高。对于短于20个碱基的引物，Tm值可按Tm=4(G+C)+2(A+T) 计算。而对于较长的引物，Tm值的计算较为复杂。由于PCR扩增的特异性取决于两条引物与相应模板的结合，因此，反应中退火温度应根据两个Tm值折衷选择。 ③ 碱基的组成尽量随机，尽量不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在；尤其是3’ 末端不应超过3个连续的G或C； ④ 引物内部不应有互补序列，否则引物自身会折叠形成发夹结构或引物本身复性。这样二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若引物自身连续互补碱基达3个以上，就容易形成发夹结构。 ⑤ 两个引物之间不能互补，尤其应避免3’ 末端的互补重叠以防止形成引物二聚体。两个引物不应有4个以上的碱基连续相同或互补； ⑥ 引物的3’ 末端应与目的片段完全相配。这对于获得好的扩增结果非常重要。如果能确定一个保守氨基酸，可将其密码子的前2个碱基作为3’ 末端。 ⑦ 引物的5’末端可不与目的片段互补，可被修饰而不影响扩增的特异性。引物的5’末端修饰包括：加酶切位点，标记生物素、荧光、同位素、地高辛等。还可引入蛋白质结合DNA序列、引入突变位点、引入翻译起始密码子、启动子序列等。所附加的限制性酶切位点应是不会在引物以外的DNA上切割的。为了有效地切割限制性酶切位点，在限制性酶识别序列的5’端常需添加2-3个非特异的额外碱基。 ⑧ 若是设计种或株特异性引物，引物与非特异序列的相似性不能超过70%或有连续8个以上的互补碱基相同。可用DNAstar、MegAlign软件比较相似性，用Oligo50来设计引物。 (2) PCR的基本原理。 在存在DNA模板、引物、dNTP、适当缓冲液（Mg2+）的反应混合物中，在热稳定DNA聚合酶的催化下，对一对寡核苷酸引物所界定的DNA片段进行扩增。这种扩增是通过模板DNA、引
