反相液相色谱法分离芳香烃(精选)

反相液相色谱法分离芳香烃
一、实验目的
1、熟悉HPLC仪的基本结构,初步掌握其使用方法； 2、通过实验，加深对色谱分离分析原理的理解，了 解最佳实验条件的选择；
3、掌握依据保留时间定性和归一化法定量的分析方
法。
高效液相色谱法是一种重要的分离技术，根据所用固定相和分离机理 的不同，一般将高效液相色谱法分为分配色谱、吸附色谱、离子交换 色谱和空间排阻色谱等。 在分配色谱中，组分在色谱柱上的保留程度取决于他们在固定相和 流动相之间的分配系数K： K= 显然，K值越大，组分在固定相上的保留时间越长，固定相与流动相之间 的极性差值越大。故，出现了流动相为非极性而固定相为极性物质的 正相色谱和流动相为极性而固定相为非极性的反相色谱法。目前应用 最广的固定相是通过化学反应的方法是将固定液键合到硅胶表面上， 即所谓的键合固定相。若将正构烷烃等非极性物质（如n-C18)键合到 硅胶基质上，以极性溶剂（如甲醇和水）为流动相，则可分离非极性 或弱极性的化合物。据此，可用反相色谱法分离芳香烃类化合物。
七 、讨论学习
1、什么叫做程序升温？什么叫梯度洗脱？ 2、如何选择最佳的实验条件？ 3、紫外光度检测器是否适用于所有的有机化合物， 为什么？ 4、何谓反相键合相色谱？何谓正相键合相色谱？
八、拓展学习
1、探讨液相色谱分离分析的特点和应用？试比较气 相色谱法与高效液相色谱法的相同点和区别。 2、何谓化学键合相色谱？请查阅资料了解C18键合 固定相的制备与性能特点。
二、色谱分离原理
高效液相色谱是在经典液相色谱的基础上发
展起来的一种色谱仪器分析方法。它是在以液体
作为流动相的一种色谱分析方法，由于采用了高
压输液泵和小粒度填料，高效液相色谱可获得很
高的分离效果。它的基本概念及理论基础，如保 留值、塔板理论、速率理论、容量因子、分离度 等与气相色谱法基本一致，但又有不同。二者的 主要区别为以下几点：

分类
分配色谱（partition chromatography） 吸附色谱(adsorption …) 离子交换色谱(ion exchange …) 尺寸排阻色谱(size exclusion …)又称凝胶色谱
实验目的
1. 学习高效液相色谱仪的操作
2. 了解反相液相色谱法分离非极性化合物的基本原理 3. 掌握用反相液相色谱法分离芳香烃类化合物
2、按下述色谱条件设定色谱仪： 柱温：室温； 流动相流速：A泵：甲醇，0.9 mL/min B泵：蒸馏水，0.1 mL/min 泵最大压力：15 MPa 检测波长：254 nm 时间：6 min
3、根据仪器操作条件，待基线稳定后，分别进标准样品和 未知样品各10uL，获得标准样品和未知样品的谱图。
4、以标准样品谱图为基准，作单点标准曲线，然后求出未 知溶液中苯和萘的浓度。
2.高压定量进样阀（常用）
泵
泵
柱
柱
排放 进样
排放 进样
图 六通进样阀
色谱柱
标准柱型： 4.6mm或 3.9mm L: 15-30cm 填料粒度：5-10m
发展趋势： 填料粒度小 柱径小
装柱技术：干法：填料粒度大于20m时可用。
湿法（匀浆法）：配成悬浮液。高压泵压入 色谱柱，洗净备用
检测系统

K

组分在固定相中物质的浓度 组分在流动相中物质的浓度

Cs Cm
流动相为非极性而固定相为极性物质的色谱称正相液相 色谱法，以流动相为极性而固定相为非极性的色谱称反相液 相色谱法。将固定液键合到硅胶表面上，即所谓的键合固定 相。若将正构烷烃等非极性物质（如n-C18烷）键合到硅胶基 质上，以极性溶剂（如甲醇和水）为流动相，则可分离非极 性或弱极性的化合物。据此，采用反相液相色谱法可分离烷 基苯类化合物。

分类
溶质型 总体型
紫外 荧光 电化学
示差折光 介电常数 激光散射
对组分的物理或物理化学特 性有响应
通用型
对试样和洗脱液总的物理 或物理化学特性有响应
本实验采用紫外光度检测器
凝胶渗透色谱(Gel Permeation Chromatography，GPC)
用化学惰性的多孔凝胶或材料为固定相，按 组分分子体积差异，即分子在固定性孔穴中 体积排阻作用差异实现组分分离。
2.高压定量进样阀（常用）
泵
泵
柱
柱
排放 进样
排放 进样
图 六通进样阀
色谱柱
标准柱型： 4.6mm或 3.9mm L: 15-30cm 填料粒度：5-10m
发展趋势： 填料粒度小 柱径小
装柱技术：干法：填料粒度大于20m时可用。
湿法（匀浆法）：配成悬浮液。高压泵压入 色谱柱，洗净备用
检测系统
要求：灵敏度高 噪音低 线性范围宽 响应快 死体积小，对温度和流速变化不敏感
本实验： 固定相：ODS-C18 流动相：甲醇－水（v/v:90%/10%)混合溶液 分离组分：甲苯，联苯，萘，菲(250µg/ml)
液相色谱流程图
PUMPDetector NhomakorabeaW
Data station (Recorder)
or Collection
高压输液系统
储液瓶 高压泵 （核心） 过滤器 压力脉动阻力器
流动相最常用的是四氢呋喃，其次是二 甲基甲酰胺、卤代烃等流动相。
本实验： 固定相：PS-DVB(聚苯乙烯-二乙烯苯) 流动相：四氢呋喃 样品：PS
恒压泵：输出压力恒定，但流速随系统阻力变化 恒流泵：流速恒定，压力随阻力变化

芳香烃（苯、甲苯、萘）的高效液相色谱定性分析一、实验目的1．了解液相色谱法的基本原理及其规律2．了解高效液相色谱仪的基本构造并掌握其基本操作3．掌握保留时间、峰宽、理论塔板数、分离度等的基本概念和实际意义二、实验基本原理在液相色谱中，采用非极性固定相，极性流动相的色谱法被称为反相色谱。

苯、甲苯、萘在ODS柱上的作用力大小不等，不同组分的分配比不同，在柱内的移动速率不同，因而先后流出柱子，得到分离。

根据组分峰面积大小及测得的定量校正因子，由归一化定量法可求出各组分的含量。

三、实验条件PE-200型高效液相色谱仪，785A型检测器；C18 (5μm,4.6 mm×150 mm)型色谱柱；紫外检测器吸收波长254nm；流动相组成为甲醇：水(去离子水)：甲醇=90：10（体积比），流速:1ml/min；进样体积:10μl四、实验步骤1、标准溶液的配制：苯、甲苯分别用甲醇稀释，萘用甲醇溶解。

标准溶液浓度约：苯0.1%（V/V）、甲苯0.1%（V/V）、萘0.1%（W/W）。

2、样品溶液的制备：取含苯、甲苯、萘的混和样品10mL稀释2500倍即得。

3、打开仪器电源，按要求设置好流动相的组成、流速、检测波长。

4、运行电脑中的工作站，用QuickStart法迅速建立一个方法。

通入流动相，使色谱柱充分平衡，直到压力变化幅度很小。

5、等待基线稳定，把装有10μL苯标准溶液的进样器放入六通阀中，对检测器调零，待仪器稳定后，把六通阀转到Inject位置，同时注射进样器中的溶液。

6、重复步骤（5），分别注入10μL甲苯、萘的标准溶液。

7、重复步骤（5），注入10μL样品溶液。

8、打印出实验数据，比较标准溶液和样品中各组分的色谱峰，记录相关结果，处理并提交实验报告。

9、关机。

五、结果分析及实验报告1、根据保留时间定性，确定样品中各个峰所代表的物质。

2、试计算样品中两相邻峰间的分离度R和萘的理论塔板数n。