分子标记发展简史

分子标记的发展及分子标记辅助育种分子标记辅助选择育种(Marker Assisted Selection (MAS)或Marker Assisted Breeding)是利用与目标基因紧密连锁的分子标记或功能标记），在杂交后代中准确地对不同个体的基因型进行鉴别，并据此进行辅助选择的育种技术。

通过分子标记检测，将基因型与表现型相结合，应用于育种各个过程的选择和鉴定，可以显著提高育种选择工作的准确性，提高育种研究的效率。

分子标记辅助育种示意图DNA分子标记相对同类技术来说具有很强的优越性：因为大部分标记为共显性，对隐性性状的选择十分有利；数量极多，应对极其丰富的基因组变异；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用标记分析；不影响目标性状的表达，与不良性状无必然的连锁等等。

随着分子生物学技术的发展，现在DNA分子标记技术也有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴定、基因库构建、基因克隆等方面。

分子标记的类型分子标记按技术特性可分为三大类。

第一类是以分子杂交为基础的DNA标记技术，主要有限制性片段长度多态性标记(Restriction fragment length polymorphisms，RFLP标记)；第二类是以聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR反应)为基础的各种DNA指纹技术；第三类是一些新型的分子标记，如单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，SNP)，由基因组核苷酸水平上的变异引起的DNA序列多态性，包括单碱基的转换、颠换以及单碱基的插入／缺失等。

分子标记是以DNA多态性为基础，因而具有以下优点：①表现稳定，多态性直接以DNA 形式表现，无组织器官、发育时期特异性，不受环境条件、基因互作影响；②数量多，理论上遍及整个基因组；③多态性高，自然界存在许多等位变异，无需专门人为创造特殊遗传材料，这为大量重要性状基因紧密连锁的标记筛选创造了条件；④对目标性状表达无不良影响，与不良性状无必然连锁；⑤部分标记遗传方式为共显性，可鉴别纯合体与杂合体；⑥成本不高，一般实验室均可进行。

分子标记的应用及其发展班级：生物工程摘要：扩增片段长度多态性是Zabeau等(1992)发展的一种新DNA指纹技术.该技术原理简单,引物设计巧妙,既具有RFLP技术的可靠性又具有RAPD技术的高效性,被称为“最有力的分子标记”.系统介绍了AFLP分子标记基本原理、技术流程和优化措施,对AFLP标记在植物居群生物学、保护生物学、分子系统学等领域中的应用作了简要介绍,并对其应用及发展前景进行了展望.关键词:分子标记技术;AFLP;应用；研究进展；PCR；DNA近十年来，现代分子生物学技术迅猛发展，尤其是PCR方法的建立，引起了分子生物学发展史上的一场革命，以PCR为基础的DNA指纹技术大大加快了人类研究遗传多样性的步伐，为不同来源和不同复杂程度基因组的分析提供了有力的工具。

AFLP结合了RFLP和RAPD的特点，既具有RFI尸可靠性好、重复性高的特点，同时又具有PCR的高效性、安全性和方便性的优点，不需要了解基因组信息，且只需少量纯化的基因组DNA即可对整个基因组DNA酶切片段进行选择性扩增，扩增结果产生大量的序列经电泳形成复杂的DNA指纹，得以反映基因组细微的变化，适合所有生物基因组的检测，因此被认为是迄今为止最有效最理想的一种DNA分子标记技术，已广泛应用于动植物及微生物的遗传多样性研究品系分析[s]、高密度遗传图谱的构建、抗性育种、动物近交系选育、疾病诊断、生态分析等各个方面。

1AFLP标记的基本原理及特点1.1AFLP标记的基本原理AFLP (Amplified fragment length polymor-phism)是RFLP与RAPD相结合的一种分子标记技术,既具有RFLP标记的专一性、可靠性,又具有RAPD标记的随机性、方便性,因此被称为“最有力的分子标记”或“下一代分子标记”[10～12].由于该标记是通过选用不同的内切酶达到选择性扩增的目的,因此又被称作选择性限制片段扩增标记(Selec-tive restriction fragment amplification, SRFA).AFLP技术的基本原理是对基因组酶切片段进行选择性扩增[13].1.2AFLP标记的特点(1)理论上可产生无限多的AFLP标记.(2)多态性高. AFLP标记具有比RFLP[18]、RAPD[19]、SSR[20]标记可靠、经济、有效的揭示物种多态性水平的能力.(3)DNA用量少,检测效率高.一个0.5mg的DNA样品可做4 000个反应, FayerC.(1996)报道他们以一人仅用三个月时间的速度构建了玉米的AFLP图谱,共产生了1 032个标记.(4)可靠性好,重复性高. AFLP分析采用特定引物扩增,退火温度高,使假阳性降低,可靠性增高.(5)对DNA模板质量要求高,对其浓度变化不敏感.AFLP反应对模板浓度要求不高,在浓度相差1 000倍的范围内仍可得到基本一致的结果.(6)选择上为中性.可用于亲本对后代群体种质贡献及基因追踪的研究.引物在不同物种间是通用的,可用于没有任何分子生物学研究基础的物种.2.AFLP技术的发展2.1内切酶的应用内切酶的选择决定了接头和引物的设计、扩增条件的设定及扩增形成DNA 片段的数目。

分子标记的发展及分子标记辅助育种分子标记辅助选择育种(Marker Assisted Selection (MAS)或Marker Assisted Breeding)是利用与目标基因紧密连锁的分子标记或功能标记），在杂交后代中准确地对不同个体的基因型进行鉴别，并据此进行辅助选择的育种技术。

通过分子标记检测，将基因型与表现型相结合，应用于育种各个过程的选择和鉴定，可以显著提高育种选择工作的准确性，提高育种研究的效率。

分子标记辅助育种示意图DNA分子标记相对同类技术来说具有很强的优越性：因为大部分标记为共显性，对隐性性状的选择十分有利；数量极多，应对极其丰富的基因组变异；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用标记分析；不影响目标性状的表达，与不良性状无必然的连锁等等。

随着分子生物学技术的发展，现在DNA分子标记技术也有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴定、基因库构建、基因克隆等方面。

分子标记的类型分子标记按技术特性可分为三大类。

第一类是以分子杂交为基础的DNA标记技术，主要有限制性片段长度多态性标记(Restriction fragment length polymorphisms，RFLP标记)；第二类是以聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR反应)为基础的各种DNA指纹技术；第三类是一些新型的分子标记，如单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，SNP)，由基因组核苷酸水平上的变异引起的DNA序列多态性，包括单碱基的转换、颠换以及单碱基的插入／缺失等。

分子标记是以DNA多态性为基础，因而具有以下优点：①表现稳定，多态性直接以DNA 形式表现，无组织器官、发育时期特异性，不受环境条件、基因互作影响；②数量多，理论上遍及整个基因组；③多态性高，自然界存在许多等位变异，无需专门人为创造特殊遗传材料，这为大量重要性状基因紧密连锁的标记筛选创造了条件；④对目标性状表达无不良影响，与不良性状无必然连锁；⑤部分标记遗传方式为共显性，可鉴别纯合体与杂合体；⑥成本不高，一般实验室均可进行。

观赏植物分子标记研究进展1 遗传标记的发展19世纪后半叶，孟德尔（G.Ｊ. Mendel）以豌豆为材料，发现了生物遗传的分离规律和独立分配规律，即著名的孟德尔定律。

1910年以后，摩尔根证实了“遗传因子”是染色体上占有一定位置的实体，由此导致了细胞遗传学的诞生。

1941年，美国遗传学家G. W. Beadle和生化学家E. L. Tatum提出了“一个基因一个酶”的假说，创立了生化遗传学。

1953年，J. D. Watson和F. H. C. Crick提出了DNA 分子结构的双螺旋模型,宣布了分子遗传学时代的到来。

1990年，J.G.K. Williams等和J. Welsh等两个研究小组应用PCR技术同时发展了一种新的RAPD 分子标记。

随后，基于PCR技术的新型分子标记不断涌现，使得DNA标记走向商业化、实用化。

2 遗传标记的种类2.1形态标记形态标记是指那些能够明确显示遗传多态性的外观性状，如株高、穗形、粒色或芒毛等的相对差异。

形态标记基因的染色体定位最初是通过经典的二点、三点测验进行的。

通过判断不同性状间的遗传是否符合独立分配规律，来确定控制这些性状的基因是否连锁。

采用这种方法把相互连锁在一起的基因定为一个连锁群，并与染色体相对应，以性状间重组率作为这些基因在染色体上的相对距离，并确定其毗邻关系。

2.2细胞学标记细胞学标记是指能明确显示遗传多态性的细胞学特征。

染色体的结构特征和数量特征是常见的细胞学标记，它们分别反映了染色体结构上和数量上的遗传多态性。

用具有染色体数目和结构变异的材料与染色体正常的材料进行杂交，其后代常导致特定染色体上的基因在减数分裂过程中的分离和重组发生偏离，由此可以测定基因所在的染色体及其相对位置。

因此，染色体结构和数目的特征可以作为一种遗传标记。

2.3蛋白质标记许多蛋白质分子分析简单快捷，是有用且可靠的遗传标记。

用作遗传标记的蛋白质通常可分为酶蛋白质和非酶蛋白质二种。

分子诊断发展简史：一场由“螺旋双杰”引发的发明分子诊断发展四阶段第一阶段：利用分子杂交技术进行遗传病基因诊断：通过婴儿胚胎期进行产前诊断，超早期预知某些疾病发生、发展和预后。

1978年著名没计划以科学家简悦威等应用液相DNA 分子杂交成功进行了镰形细胞贫血症的基因诊断。

第二阶段：以PCR为基础的分子诊断：PMullis发明PCR技术后迅速发展，标志着传统基因诊断发展到更全面的分子诊断技术。

第三阶段：以生物芯片技术为代表的高通量检测技术：1992年美国Affymetrix制作出第一章基因芯片，标志着分子诊断进入生物芯片技术阶段。

生物芯片技术解决了传统核酸印迹杂交技术复杂、自动化程度低、检测目的分子数量少、低通量的问题。

第四阶段：以NIPT为代表的第二代测序技术：Ronaghi分别于1996年与1998年提出了在固相与液相载体中通过边合成边测序的方法-焦磷酸测序。

目前常见的高通量第二代测序平台主要有Roche454、IlluminaSolexa、ABISOLiD和LifeIon Torrent等，其均为通过DNA 片段化构建DNA文库、文库与载体交联进行扩增、在载体面上进行边合成边测序反应，使得第1代测序中最高基于96孔板的平行通量扩大至载体上百万级的平行反应，完成对海量数据的高通量检测。

1代、2代测序区别分子诊断三座丰碑1953年，沃森和克里克发现了DNA双螺旋的结构，开启了分子生物学时代，使遗传的研究深入到分子层次，“生命之谜”被打开，人们清楚地了解遗传信息的构成和传递的途径。

在以后的近50年里，分子遗传学、分子免疫学、细胞生物学等新学科如雨后春笋般出现，一个又一个生命的奥秘从分子角度得到了更清晰的阐明。

DNA双螺旋结构的出现时分子生物学行程的重要标志，对人们认识蛋白质合成、DNA复制和突变具有重要意义，为分子诊断的蓬勃发展奠定基础。

“DNA之父”Wa tson、Crick50年前，科学界的“八大恶棍”之一凯利•穆利斯还只是美国某制药公司的小职员，整天做着把先天致病基因给剔除掉的白日梦，然而先要复制DNA，才有足够的时间慢慢修复。

食安0801 02 邓凯近年来，现代生物技术，特别是分子标记技术发及其产品的检验检疫工作中，分子标记技术也得到展迅速，已被广泛应用于生物进化、系统分类、物种了越来越广泛的应用。

本文综述了分子标记技术在多样性、遗传育种、品种鉴定、基因组作图或基因定植物检疫实践中的应用和发展前景。

位、基因定位克隆（map-based cloning）等领域的研1分子标记技术发展概况究。

广义的分子标记（molecular markers）是指可遗传遗传标记（geneticmarkers）的发展经历了4个阶的并可检测的DNA序列或蛋白质标记；狭义的分子段：①形态标记（morphological markers），主要指植标记概念只是指DNA标记。

蛋白质标记包括种子储物学形态特征；②细胞标记（cytological markers），主藏蛋白、同工酶（指由一个以上基因位点编码的酶的要是染色体核型和带型等；③生化标记（biochemical 不同分子形式）及等位酶（指由同一基因位点的不同markers），主要是同工酶和储藏蛋白等生化物质；等位基因编码的酶的不同分子形式）。

在出入境植物④分子标记（molecular markers），即核苷酸。

分子标记是以生物大分子（主要是遗传物质DNA）的多态性为基础的一种遗传标记。

理想的分子基于“3S”技术的数字化烟草农业标记所具有的优点：①多态性高；②遍布整个基因③检测手段简单、迅速；④无基因多效性；⑤能够明确辨别等位基因；⑥实验重复性好；⑦直接以试论林木病虫害防治信息的数DNA的形式表现，不受植物的生长条件和发育阶段的影响，在植物的任何生长阶段都可检测。

第一代分子标记（以Southern杂交技术为核心）对数字农业的认识及其基本构想现代农为限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，缩写20世纪80年代中期发展起来的一种最早的分子标记。

分子标记的种类一、生化标记60年代初出现了同工酶标记。

可从蛋白质水平来反映生物的遗传变异。

同工酶是指具有同一底物专一性的不同分子形式的酶。

具有组织、发育及物种的特异性。

其基本原理是根据电荷性质差异，通过蛋白质电泳或色谱技术和专门的染色反应显示出同工酶的不同形式，从而鉴别不同基因型。

由于其经济方便，易于操作，受到广泛的应用。

二、常用DNA分子标记的基本原理及其应用依据多态性的检测手段，分子标记可分为二大类：1)基于southefn杂交技术的分子标记如RFLP、染色体原位杂交；2)基于PCR反应的分子标记如AFLP、RAPD、DAF、SSR、STS、SSLP等。

依据在基因组中出现的频率，又可将分子标记分为低拷贝序列和重复序列，重复序列包括串联重复和散布重复。

基于Southern杂交拉术的分子标记限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism,RFLP)RFLP是最早发展的分于标记，至今仍被广泛应用。

RFLP分为两种类型：一类是由于限制性内切酶位点上发生了单个碱基突变而使这一限制性位点发生丢失或获得而产生的多态性，故称之为点多态性(point polymorphism)，这类多态性实际上是双态的。

即有(十)或无(一)。

另一类是由于DNA分子内部发生较大的顺序变化所致，这类多态性又可分为两类：第一类是由于DNA顺序上发生突变如缺失、重复、插入所致；第二类是近年发现的“高变区”，高变区(highly variable region)是由多个串联重复序列组成的不同的个体高变区内所串联重复的拷贝数相差悬殊，因而高变区的长度变化很大，从而使高变区两侧限制性内切酵识别位点的固定位置随高变区的大小而发生相对位移，所以这一类型的RFLP是由于高变区内串联重复顺序的拷贝数不同所产生的，其突出特征是限制性内切酶识别位点本身的碱基没有发生改变，改变的只是它在基因中的相对位置。

(接封3)[15]T ischer E ,M itchell R ,Hartman T ,et al .The human gene for vascular en 2dothelia growth factor ,multiple protein forms are encoded through alternative zx on splicing[J ].J.Biol.Chem ,1991,266:26031-260371[16]K lagsbrun M ,Dam ore PA.Regulators of angiogenesis [J ].A nnu.R ev.Physiol ,1991,53(2):217-2391[17]毛春明,杨晓1TG F -β在创伤愈合中的作用[J ].军事医学科学院刊,2001,25(3):232-2351[18]Bicknell R ,and Vallee BL.Angiogenesis stimulates endothelial cell prostacydin secretion by activation of phospholipase A2[J ].Proc.N atl.A 2cad.Sci .US A ,1989,86:1573-15771[19]Brogi E ,Wu T ,et al .Indirect angiogenic cytokines upregulate VEG F and bFG F gene expression in vascular sm ooth muscle cells ,whereas hypoxia upregu 2lates VEG F expression only[J ].Circulation ,1994,90:649-6521[20]M as on JC ,Lidington E A ,Ahmad SR ,et al .bFG F and VEG F synergisti 2cally enhance endothelial cytoprotection via decay -accelerating factor induction [J ].Am J Physion ,2002,282:C578-5871[21]Papetti M ,Herman IM.M echanisms of normal and tum or -derived angio 2genesis [J ].Am J Physiol ,2002,282:947-9701[22]Sem orre PV ,G uerrin M ,Cholle P ,et al .Vasculotropin -Veg f stimulates retinal capillary endothelial cell through an autocrine pathway [J ].I nveset oph 2th almol V is Sci ,1994,35:3303-34001[23]龚晓敏,江时森1血管新生和动脉粥样硬化[J ].中国循环,2001,5(2):91-931收稿日期:2001-10-21;修回日期:2002-01-15作者简介:王志林(1976-),男,硕士生。

分子标记技术（图）2008-07-21 00:00 来源：互联网点击次数：1479 关键词：分子标记分享到：收藏夹腾讯微博新浪微博开心网标记育种是利用与目标性状基因紧密连锁的遗传标记，对目标性状进行跟踪选择的一项育种技术。

与育种有关的遗传标记主要有四种类型: 形态标记（morphological marker）、细胞标记（cytological markers）、生化标记（Biochemical marker）和分子标记（molecular marker）。

早在1923年，Sax等就提出利用微效基因与主基因的紧密连锁，对微效基因进行选择的设想。

但由于形态标记数目有限，而且许多标记对育种家来说是不利性状，因而难以广泛应用。

细胞标记主要依靠染色体核型和带型，数目有限。

同工酶标记在过去的二、三十年中得到了广泛的发展与应用。

作为基因表达的产物，其结构上的多样性在一定的程度上能反映生物DNA 组成上的差异和生物遗传多样性。

但由于其为基因表达加工后的产物，仅是DNA 全部多态性的一部分，而且其特异性易受环境条件和发育时期的影响；此外同工酶标记的数量有限，不能满足育种需要。

近年来，分子生物学的发展为植物遗传标记提供了一种基于DNA 变异的新技术手段，即分子标记技术。

与其它标记方法相比，分子标记具有无比的优越性。

它直接以DNA 形式出现，在植物体的各个组织、各发育时期均可检测到，不受季节、环境的限制，不存在表达与否的问题；数量极多，遍及整个基因组；多态性高，利用大量引物、探针可完成覆盖的分析；表现为中性，即不影响目标性状的表达，与不良性状无必然的连锁；许多标记为共显性，能够鉴别出纯合的基因型与杂合的基因型，提供完整的遗传信息一、常用的分子标记技术利用分子标记技术分析生物个体之间DNA 序列差别并用于作图的研究始于1980年。

经过十几年的发展，现在的DNA 标记技术已有十多种，主要有两大类。

（一）、基于Southern杂交的分子标记这类标记利用限制性内切酶酶切不同生物体的DNA 分子，然后用特异探针进行Southern杂交，通过放射性自显影或非同位素显色技术揭示DNA 的多态性。

分子标记的种类及其发展1 引言1.1 分子标记概念的界定广义的分子标记(molecular marker)是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。

蛋白质标记包括种子贮藏蛋白和同工酶（指由一个以上基因位点编码的酶的不同分子形式）及等位酶（指由同一基因位点的不同等位基因编码的酶的不同分子形式）。

狭义的分子标记概念只是指DNA标记，而这个界定现在被广泛采纳。

本文中也将分子标记概念限定在DNA标记范畴。

1.2 理想的分子标记的界定理想的分子标记必须达到以下几个要求：(1)具有高的多态性；(2)共显性遗传，即利用分子标记可鉴别二倍体中杂合和纯合基因型；(3)能明确辨别等位基因；(4)遍布整个基因组；(5)除特殊位点的标记外，要求分子标记均匀分布于整个基因组；(6)选择中性（即无基因多效性）；(7)检测手段简单、快速（如实验程序易自动化）；(8)开发成本和使用成本尽量低廉；(9)在实验室内和实验室间重复性好（便于数据交换）。

但是，目前发现的任何一种分子标记均不能满足以上所有要求。

2 分子标记的种类2.1 限制性片段长度多态性2.1.1 限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，缩写RFLP)是发展最早的分子标记技术。

RFLP技术的原理是检测DNA在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小。

因此凡是可以引起酶切位点变异的突变如点突变（新产生和去除酶切位点）和一段DNA的重新组织（如插入和缺失造成酶切位点间的长度发生变化）等均可导致RFLP的产生。

此技术及其从中发展出来的一些变型均包括以下基本步骤：DNA的提取、用限制性内切酶酶切DNA、用凝胶电泳分开DNA片段、把DNA片段转移到滤膜上、利用放射性标记的探针显示特定的DNA片段（通过Southern杂交）、分析结果。

由于线粒体和叶绿体DNA较小，前三个步骤就完全可能检测出DNA片段的差异，所以往往不必要后面的几个步骤；对线粒体和叶绿体DNA进行的这种多态性差异检测在1980年之前就已出现，从理论上说，这种多态性也可称为RFLP。

第23卷第2期周口师范学院学报2006年3月V o.l23No.2Journa l o f Zhoukou No r m alUn iversity M ar.2006分子标记的发展及应用马克世,胡炳义(周口师范学院生命科学系,河南周口466000)摘要:随着分子生物学的迅速发展,DNA分子标记越来越受到重视.本文介绍了分子标记的发展,论述了DNA分子标记在基因组作图、基因克隆、物种亲缘关系分析及疾病诊断等方面的应用.关键词:DNA;多态性;分子标记中图分类号:Q523文献标识码: A 文章编号:16719476(2006)020081-04DNA分子标记是以生物大分子的多态性为基础的遗传标记,是DNA水平遗传变异的直接反映,克服了传统的形态标记、细胞学标记和生化标记易受外界因素、生物个体发育阶段及器官组织差异的影响,因而具有广泛的应用前景.随着分子生物学技术的发展,DNA分子标记的研究愈加活跃,相继有数10种不同的分子标记技术问世.1 分子标记的发展1.1 第一代分子标记限制性片段长度多态性(restr i ction fragm ent leng t h po ly m orphis m s,RFLP)是最早应用的第一代分子标记技术[1],是检测DNA在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小的方法,反映了DNA分子上不同酶切位点的分布情况.因此, DNA序列上的微小变化,甚至1个核苷酸的变化,也能引起限制性内切酶切点的丢失或产生,导致酶切片段长度的变化. R FLP标记的等位基因具有共显性的特点,结果稳定可靠,重复性好,特别适用于构建遗传连锁图.但是,在进行RFLP分析时,需要对该位点的DNA片段做探针,通常用放射性同位素及核酸杂交技术,这样既不安全又不易自动化.另外,RFLP对DNA多态性检出的灵敏度也不高,RFLP连锁图上还有很多大的空间区(G aps).为了克服RFLP技术上的缺点,W illia m s等人于1990年建立了随机扩增多态性DNA(R andom Amp lified Po ly m orphic DNA s,RAPD)技术[2],由于其独特的检测DNA多态性的方式使得RA PD技术很快渗透于基因研究的各个领域.RA PD是建立在PCR基础之上的,用一个随机引物(8~10个碱基)非定点地扩增DNA片段,然后用凝胶电泳分离扩增片段来进行DNA多态性研究.对任一特定引物而言,它在基因组DNA序列上有其特定结合位点,一旦基因组在这些区域发生DNA片段插入、缺失或碱基突变,就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化,从而导致扩增产物的数量和大小发生改变,表现出多态性.与RFLP相比,RA PD方便易行,DNA用量少,设备要求简单,不需DNA探针,设计引物也不需要预先克隆标记或进行序列分析,不依赖于种属特异性和基因组的结构;合成一套引物可以用于不同生物基因组分析,用一个引物就可扩增出许多片段,并且不需要同位素,安全性好.但RA PD技术中影响因素很多,实验的稳定性和重复性差[3].扩增片段长度多态性(Amp lifi ed F ragment L ength Po ly m orphis m s,A FLP)是1992年由荷兰K eygene公司科学家Zabeau和V os发明的一种DNA分子标记新技术[4].其基本原理是基因组DNA经限制性内切酶双酶切后,形成分子量大小不等的随机限制性片段,将特定的接头(adap ter)连接在这些DNA片段的两端,形成一个带接头的特异片段,通过接头序列和PCR引物3 末端的识别,特异性片段经变性、退火和延伸周期性循环而扩增,最终通过聚丙烯酰胺电泳分子筛作用,将这些特异的限制性片段分离开来.AFLP融合了RFLP和RAPD两种技术的优点,既具有RFLP的可靠性,又具有RA PD的灵敏性.它的出现是分子标记技术又一重大突破,被认为是目前一种较为理想、有效的分子标记.此外,在RA PD和RFLP技术基础上建立了SCAR(Sequence character i zed a m plifi ed reg i ons,序列特异性扩增区域), CPA S(C l eaved amp lifiedpo l ymo rph ic sequence,酶切扩增多态序列)和DAF(DNA a mp lified fi ngerpr i nts,DNA扩增指纹)等标记技术[3,5].这些技术的出现,进一步丰富和完善了第一代分子标记,增加了DNA多态性的研究手段.收稿日期:20051228;修回日期:20060216作者简介:马克世(1974),男,河南项城人,硕士,讲师,研究方向:动物生物化学.E m a i:l m adg2000@.82 周口师范学院学报2006年3月1.2 第二代分子标记第二代分子标记利用存在于真核生物基因组中的大量重复序列,如重复单位长度在15~65个核苷酸左右的小卫星DNA(m i nisa tellite DNA),重复单位长度在2~6个核苷酸左右的微卫星DNA(m icrosa tellite DNA),后者又称为简短重复序列(sho rt tande m repeat po l ymo rph is m缩写为STR,STR P,或者si m ple sequence l eng th po ly m orphis m缩写为SSLP)[1].小卫星和微卫星DNA分布于整个基因组的不同位点.由于重复单位的大小和序列不同以及拷贝数不同,从而构成了长度多态性.微卫星多态性有助于遗传图谱的建立,为比较基因组分析奠定了基础[6].微卫星特点[7]:(1)保守性.微卫星标记在哺乳动物种间,特别是关系亲缘较近的物种间具有一定程度的保守性.(2)共显性遗传.微卫星标记的等位基因呈孟德尔共显性遗传,可以区别纯合显性和杂合显性个体.(3)多态信息量大.微卫星DNA在基因组中分布随机,几乎遍布整个基因组,可获得比RFLP更多的多态性.(4)检测容易,省时,重复性较好.在基因组多态性分析中,可采用VNTR(V ar i ble number o f tan de m repea ts,数目可变的串联重复多态性)标记技术区别这些小卫星或微卫星DNA.VNTR基本原理与RFLP大致相同,只是所用的探针核苷酸序列必须是小卫星或微卫星序列,经分子杂交和放射自显影后,即可获得反映个体特异性的DNA指纹图谱.VNTR同RFLP标记一样,实验操作程序繁杂,检测时间长,成本较高.M oo re等于1991年结合PCR技术创立了SSR(S i m p le Sequence R epeat,简单重复序列).SSR即微卫星DNA,是一类由几个(多为1~5个)碱基组成的基序(mo tif)串联重复而成的DNA序列,其长度一般较短,广泛分布于基因组的不同位置,如(CA)n,(A T)n,(GGC)n等重复.不同遗传材料重复次数的可变性,导致了SSR长度的高度变异性,这一变异性正是SSR 标记产生的基础.SSR标记的基本原理:根据微卫星重复序列两端的特定短序列设计引物,通过PCR反应扩增微卫星片段.由于重复的长度及数目变化极大,所以这是检测多态性的一种有效方法.在SSR技术中,采用PCR反应必须知道扩增DNA片段两侧序列,在大多数情况下,某些序列本身或其旁侧序列并不清楚,这就限制了SSR技术的应用.1994年,Z i e t k ie w i cz等对SS R技术进行了发展,建立了加锚微卫星寡核苷酸(A ncho red m i crosatellite o ligonucleoti des)技术[5,8].他们用加锚定的微卫星寡核苷酸作引物,即在SS R的5 端或3 端加上2~4个随机选择的核苷酸,这可引起特定位点退火.这样就能导致与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间的基因组片段进行PCR扩增.这类标记又被称为简单重复序列间扩增ISSR(i nter s i m p l e sequence repeat),锚定简单重复序列扩增A SSR(anchored si m p l e sequence repeats).在所用的两端引物中,一个可以是锚定引物,另一个是随机引物.1.3 第三代分子标记单核苷酸多态性(si ng l e nuc leo ti de po l ymo rph is m,SNP)标记被称为第三代DNA分子标记.这种分子标记是分散于基因组中的单个碱基的差异.这种差异包括单个碱基的缺失和插入,但更常见的是单个核苷酸的替换[9,10].SNP的分布密集,在人类基因组中被认为有300万个以上的SNP遗传标记,这可能达到了人类基因组多态位点数目的极限,因此被认为是应用前景较好的遗传标记物.其优点是:(1)SNP在种群中是二等位基因性的,在任何种群中其等位基因频率都可估计出来;(2)位点丰富,S N P几乎遍布于整个基因组;(3)部分位于基因内部的S N P可能会直接影响蛋白质的结构或基因表达水平,因此它们本身可能就是疾病遗传机制的候选改变位点;(4)遗传稳定性高;(5)易于进行自动化分析[11].目前,已有2000多个标记定位于人类染色体上.S N P与第一代的RFLP及第二代的STR标记的不同之处有两个方面:一是它不再以DNA片段的长度变化作为检测手段,而直接以序列变异作为标记;二是S N P标记分析完全摒弃了经典的凝胶电泳,代之以最新的DNA芯片[12]技术.2 分子标记的应用领域2.1 基因组作图和基因定位研究长期以来,各种生物的遗传图谱几乎都是根据诸如形态、生理和生化等常规标记来构建的,所建成的遗传图谱仅限少数种类的生物,而且图谱分辨率大多很低,图距大,饱和度低,因而应用价值有限.DNA分子标记用于遗传图谱构建是遗传学领域的重大进展之一.1987年,D onis K e ller等发表了第一张人类的RFLP s连锁图,其饱和度远远超过了经典的图谱.近来,L i L i等[13]运用A FLP技术构建太平洋牡蛎(Crasso strea gigas)的一个雄性和一个雌性遗传图谱,雄性图包括96个标记,定位在10个连锁群中,覆盖1258c m;而雌性图谱包括119个标记,分布在11个连锁图中,覆盖993c m.在遗传图谱中大部分的标记很少是对于纯合体的,且彼此间有着紧密的联系,表明在太平洋牡蛎中存在着隐性有害的基因.目前,几乎所有重要农作物,如拟南芥、番茄、玉米、水稻、甜菜、小麦、大豆、马铃薯、棉花、油菜等的RFL P图谱均已构成[14,15].随着新的DNA标记技术的发展,生物遗传图谱名单上的新成员将不断增加,图谱上标记的密度也将越来越高.建立起完整的高密度的分子图谱,就可以定位感兴趣的基因.迄今在玉米、水稻、大豆、小麦和棉花等各种经济作物上已定位了许多农艺性状和经济性状的基因,包括农作物的抗病性、抗虫性、抗逆性、早熟性等,为开展这些基因的分子育种奠定了基础[16].2.2 基于图谱克隆基因图位克隆(M ap based c l on ing)是近几年随着分子标记遗传图谱的相继建立和基因分子定位而发展起来的一种新的基因克隆技术[1,14].利用分子标记辅助的图位克隆无需事先知道基因的DNA 序列,也不必了解基因的表达产物,就可以直接克隆基因.图位克隆技术首先在拟南芥中取得成功,后来在番茄、大麦、小麦、甜菜、水稻的研究中也利用了这一方法.图位克隆是最为通用的基因识别途径,至少在理论上适用于一切基因.基因组研究提供的高密度遗传图谱、大尺寸物理图谱、大片段基因组文库和基因组全序列,已为图位克隆的广泛应用铺平了道路.2.3 物种亲缘关系和系统分类中的应用分子标记广泛存在于基因组DNA 的各个区域,通过对随机分布于整个基因组的分子标记的多态性进行比较,就能够全面评估研究对象的多样性,并揭示其遗传本质.利用遗传多样性的结果可以对物种进行聚类分析,进而了解其系统发育与亲缘关系.1997年,G uiford 等仅用了3个SS R 标记区分出21个苹果品种.2002年,Ivand ic 等用已知图谱位置的33个SSR 对来自以色列、土耳其和伊朗的39份野生型大麦基因型遗传多样分析表明,大多数野生型大麦能按其起源的国家归类[17].Y ang 利用RAPD 技术对23个不同品种的芹菜进行研究,根据其多态性,划分出不同类型,绘出了其进化关系,与以前用蛋白质或用同工酶标记分类的结果一致[18].李太武等[19]用20条能产生清晰可重复扩增产物的随机引物,对皱纹盘鲍、杂色鲍进行RA PD 分析,计算出各群体扩增位点的多态性比例、群体遗传杂合度和群体间的遗传距离,表明皱纹盘鲍与杂色鲍的亲缘关系较远,K linbu ng a 等[20]用R FL P 和RA PD 技术,对泰国的3种鲍H aliatis asinina ,H.ov ina,H.var ia 的18S ,16SrDNA 进行研究,通过小样本图谱分析表明H.as i n ina 和H.ovina 在遗传上比H.varia 近,H.varia 与H.ovina 有明显的遗传上的差异.分子标记的发展为研究物种亲缘关系和系统分类提供了有力的手段.2.4 用于疾病诊断和遗传病连锁分析1980年,Boste i n 等成功的将RFLP 技术用于镰刀型贫血症的诊断分析,开创了基因诊断的先河.RFLP 是以孟德尔方式遗传,因此可以作为染色体上致病基因座位的遗传标志.目前,许多与RFLP 相连锁的致病基因得以定位[21].小卫星和微卫星DNA 因其高度多态性而被广泛用于疾病诊断和遗传病的连锁分析.刘湘帆等采用多个微卫星位点进行血友病B 基因诊断分析,发现6个S TR 位点与血友病B 基因有关[22].近几年研究发现,核苷酸重复长度变异可导致许多疾病.已经证实,Hunti ngon 舞蹈症、脆性X 染色体综合症,肌强直性营养不良等与之有关[23,24].第三代分子标记SNP 被认为是一种稳定遗传的早期突变,因此将S N P 用于单基因与多基因病的连锁分析,显示出广阔的应用前景[9,25].M arti n 等研究表明,A poE 基因附近7个SNP 位点与老年性痴呆症(A lzhei m e r d i sease)有关[26].将S N P 标记技术用于与心血管疾病、神经精神病及肿瘤相关基因的分析均有较多报道[27,28].随着高通量检测SNP 技术方法的出现,作为数量最多且易于批量检测的多态标记,SNP 在连锁分析与基因定位,包括复杂疾病的基因定位、关联分析、个体和群体对环境致病因子与药物的易感性研究中将发挥愈来愈重要的作用.3 分子标记技术的展望目前,分子遗传标记技术已飞速发展,并被广泛应用于动植物的遗传研究中.分子标记中的S N P 已在玉米、大豆、鸡、猪等动植物育种和生产中有许多应用研究,主要集中在基因定位、辅助育种、疾病治疗等方面的应用研究工作,取得了一些应用成果[29~31].DNA 分子标记技术的开发是近年来分子生物学领域研究的热点.随着分子生物学理论与技术的迅猛发展,必将研发出分析速度更快、成本更低、信息量更大的分子标记技术.而分子标记技术与DNA 提取程序化、电泳胶片分析自动化、信息(数据)处理计算机化的结合,必将加速遗传图谱的构建、基因定位、基因克隆、物种亲缘关系鉴别及与人类相关的致病基因的诊断和分析.参考文献:[1]朱玉贤,李毅.现代分子生物学[M ].第二版.北京:高等教育出版社,2002:371-376.[2]W illia m J C K,Kubeli k A R,L i vak K J .DNA po l ymo rph is m a m plifi ed by arb itrary pri m ers are use f u l genetic m arkers[J].N ucle i c A c i ds R es ,1990,18:6531-6537.[3]王志林,赵树进,吴新荣.分子标记技术及其进展[J].生命的化学,2001,21(4):39-42.[4]V e lappam N,Sondgrass J L,H akov irta J R.R apid i den tificati on o f pathogenic bacter i a by si ng l e enzy m e a m plified frag m entleng t h po ly m orphis m ana l ys i s[J].D iagnostic M i c robiology and i nfecti ons D isease ,2001,39:77-83.[5]黎裕,贾继增,王天宇.分子标记的种类及其发展[J].生物技术通报,1999,15(4):19-22.[6]Serap i on J ,K ucudtasH,F eng J ,e t a.l B i o i nfo r ma ti c m i n i ng oft ype I m i ncro sate llite fro m expressed sequence tage o f channe l catfis h(lcta l urns puncta t us)[J].A n i n G enet ,2003,34(6):445.[7]张丽娟,张保军,耿社民.微卫星标记与动物遗传育种[J].黄牛杂志,2003,29(2):49.83第23卷第2期马克世,等:分子标记的发展及应用84 周口师范学院学报2006年3月[8]冯龙仁,牛安欧.微卫星简单重复序列锚定PCR扩增技术(SSR PCR)及其在寄生虫基因研究中的应用[J].实用寄生虫杂志,2000,8(1):33-34.[9]杨昭庆,洪坤学,褚嘉佑.单核苷酸多态性的研究进展[J].国外医学:遗传学分册,2000,23(1):4-8.[10]张效萌,韩金祥.单核苷酸多态性的检测及其在医药领域的应用[J].生命的化学,2001,21(4):325-327.[11]李艳杰,龙火生,李影,等.单核苷酸多态性(S N P)的研究进展和应用[J].A n i m a l Science V eter i ngany M edic i ne,2003,22(4):l6.[12]帕提古丽,罗薇.基因芯片的应用[J].西南民族大学学报,2004,30(3):341.[13]L i L,i G uo X i m i ng.A FLP based gene tic linkage m aps of t he P ac ific O yster Crasso sstrea G i g as T hunbe rg[J].M ar i ne B iotechno,l2004,6:26.[14]张德水,陈受宜.DNA分子标记、基因组作图及其在植物遗传育种上的应用[J].生物技术通报,1998(5):915-912.[15]王建波.ISSR分子标记及其在植物遗传学研究中的应用[J].遗传,2002,24(5):613-616.[16]危文亮,赵应忠.分子标记在作物育种上的应用[J].生物技术通报,2000,22(2):12-16.[17]冯宗云,张义正,凌宏清.大麦基因组中的微卫星标记及应用[J].遗传,2002,24(6):727-733.[18]Y ang X,Q u i ros C F.Identifi cation and classificati on o f ce l ery cultivars w it h RA PD m arkers[J].Theor A pp l G enet,1993,86:205-212.[19]李太武,杨文新,宋林生,等.皱纹盘鲍和杂色鲍遗传多样性的RA PD研究[J].海洋与湖沼,2003,34(7):444.[20]K linbunga S,P ripue P,K ha m nam tong N,et a.l G enetic d i versity and m o l ecular o f the trop i ca l abalone(H a li o ti s asi n i na)i nT hail and[J].M arine B i otech no,l2003(5):505.[21]卢大儒,邱信芳,薛京伦.医学分子遗传学[M].上海:复旦大学出版社,1998:505-506.[22]刘湘帆,王学锋,樊绮诗.联合多个微卫星DNA位点进行血友病B基因诊断[J].中华血液学杂志,2002,23(3):147-150.[23]蔡善荣,刘希永,郑树.人类基因组STR及其应用[J].国外医学:遗传学分册,2000,23(2):60-62.[24]聂胜洁,景强.短串联重复序列的研究及应用[J].国外医学:遗传学分册,2002,25(5):255-259.[25]W eiss K M.H o w m any disease does it take to m ap a gene w it h S N Ps[J].N a t ure genet,2000,26(2):151-155.[26]L aws S M,H one E,G andy S.Expand i ng the associati on bet w een the APOE gene and the risk o fA lzhei m er s'd i sease:possi blero l es fo r APOE prom oter po ly m orphis m s and a lterati ons i n APOE transcr i ption[J].J N eurochem istry,2003,84(6):1215-1236.[27]刘芳,周新.单核苷酸多态性与高脂血症[J].国外医学:临床生物化学与检验医学,2001,22(4):169-170.[28]柯杨.相关基因的单核苷酸多态性与肿瘤的遗传易感[J].中华肿瘤杂志,2002,24(2):105-106.[29]聂庆华,张细权,雷明明.单核苷酸多态性及其在鸡QTL定位上的应用[J].遗传,2003,25(6):729-734.[30]侯娅丽,周倩,刘文忠.单核苷酸多态性及其猪育种中的应用[J].A n i m al Science V eter i nary M ed i c i ne,2004,6:46.[31]郑汗式,刘良国,易祖盛.RA PD分子标记与鱼类种质资源和遗传育种研究[J].广州大学学报,2003,2(6):5l8.D evel op m ent and applicati on of DNA m olecular markersMA Ke shi,HU B i n g y i(D epart m ent o f L ife Sc ience,Zhoukou N orma lU n i ve rsity,Zhoukou466000,Ch i na)Abstrac t:W ith the rap i d deve l op m en t of m o lecular b i o l ogy,DNA mo lecu l a r m arke rs rece i ves m ore and m ore atten tion i n t he w orld.T his paper i ntroduces the deve l op m en t i n DNA m olecu lar m arkers and its appli cation i n genom e m app i ng,gene cloni ng,a nalysis o f relationsh i p of spec i es relationsh i p,as w e ll as d i sease diagnosis.K ey word s:DNA;po l ymo rph i s m;m o l ecular m arke r。