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大鼠肺微血管内皮细胞编号名称规格北京派瑞金GK1001大鼠肺微血管内皮细胞5×105cells/瓶为能尽快开展实验，派瑞金发货的原代细胞均处于对数生长期，且每次发货为汇合率达到70%的细胞，收到细胞后即可开展实验。
派瑞金提供的大鼠肺微血管内皮细胞取自新鲜的组织，按照标准操作流程分离培养。
研发的大鼠肺微血管内皮细胞完全培养基能提供细胞最佳的生长条件，降低杂细胞污染，保证不同批次间细胞质量的稳定。
同时，派瑞金还建立了严格的细胞鉴定流程，所提供的原代细胞均需经过细胞类型特异性标记物、细胞形态学等检测，保证细胞纯度在90%以上；同时也需经过微生物检测，保证不含有HIV、HBV、HCV、支原体、真菌及其他类型的细菌。
大鼠肺微血管内皮细胞简介：1、名称：大鼠肺微血管内皮细胞2、组织来源：大鼠肺血管组织3、规格：5×105cells/25cm2培养瓶4、细胞简介：大鼠肺微血管内皮细胞分离自正常大鼠肺血管组织，血管内皮细胞密切参与包括再生、发育、伤口愈合等一系列生理及炎症反应。
细胞呈梭形或多角形,形成单层后呈典型的鹅卵石样或铺路石样排列。
肺微血管内皮细胞构成半选择性屏障，该屏障对于肺气体交换，调节液体和可溶物在血液与肺间质之间的流动具有重要意义。
本公司生产的大鼠肺微血管内皮细胞总量约为5×105cells/瓶，细胞纯度75%~85%，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。
5、培养基信息：1）培养基类型：1640培养基(GIBCO，添加NaHCO31.5g/L，Sodium Pyruvate0.11g/L) 2）添加因子：优质胎牛血清10%，细胞生长因子等大鼠肺微血管内皮细胞使用方法：收到细胞后，请按照以下方法进行操作。
1.取出25cm2培养瓶，75%酒精消毒，拆下封口膜，放入37℃，5%CO2细胞培养箱中静置6-8小时或者过夜，以稳定细胞状态。
2.待细胞达到80%汇合时准备进行传代培养。
急性肺损伤大鼠呼吸膜 AQP1和 AQP5的表达岳胜;朱平;岳磊;乔国华【摘要】目的：确定水通道蛋白 AQP1及 AQP5是否在大鼠肺泡毛细血管膜（呼吸膜）表达，进而研究急性肺损伤（ALI）大鼠 AQP1和 AQP5的表达调节及激素干预的作用。
方法采用亲和的抗人 AQP1和 AQP5抗体，应用免疫组化及免疫电镜的方法研究AQP1及AQP5在呼吸膜的分布。
选用肺泡内灌注脂多糖（LPS）制作大鼠 ALI 动物模型，研究 ALI 时呼吸膜 AQP1及 AQP5的变化。
结果免疫染色显示 AQP1主要表达于正常肺组织的微血管内皮，而 AQP5主要表达于肺泡 I型上皮细胞。
免疫组化分析进一步表明 LPS 灌注后4h ～48hAQP1及 AQP5在呼吸膜的表达均下降；AQP1蛋白于 LPS 灌注后24h 及激素干预后有部分恢复（P ＜0．05），而 AQP5无这种恢复现象。
结论 ALI 时 AQP1及 AQP5在呼吸膜的表达减少，提示 ALI 时 AQP1和 AQP5的下降表达可能与其液体转运的异常有关。
%Objective To determine if aquaporin1 ( AQP1) and aquaporin5( AQP5) are expressed in the alveolar-capillary membrane in rats, and to investigate the changes of AQP1 and AQP5 expression in the rat with acute lung injury.Methods The distribution of AQP1 and AQP5 in alveolar capillary membrane was investigated by immunohistochemistry and immunoelectron microscopy with affinity-purified antibodies to human AQP1 and AQP5.The possibility that alveolar capillary membrane AQP1and AQP5 undergo altered regulation was studied by a rat model established using intra-tracheal instillation of lipopolysaccharide (LPS).Results Immunolabelling showed that AQP1 was stained primarily in the microvascular endothelium of normal lungs, while AQP5 was expressedin type I pneumocytes. Immunohistochemical analysis showed a significant decrease in the expression of AQP1 and AQP5 in injured lungs at 4 -48 h after LPS instillation.AQP1 protein was resumed partly at 24 h after LPS instillation and steroid administration, whereas AQP5 was unchanged.Conclusions The decreased expressions of AQP1 and AQP5 in injured lungs suggest that both of them may play a role in abnormal fluid transportation.【期刊名称】《中国比较医学杂志》【年(卷),期】2016(026)008【总页数】6页(P70-74,90)【关键词】水通道蛋白 1;水通道蛋白 5;急性肺损伤;激素【作者】岳胜;朱平;岳磊;乔国华【作者单位】郑州大学附属洛阳中心医院急诊科，河南洛阳 471000;郑州大学附属洛阳中心医院急诊科，河南洛阳 471000;郑州大学附属洛阳中心医院急诊科，河南洛阳 471000;郑州大学附属洛阳中心医院急诊科，河南洛阳 471000【正文语种】中文【中图分类】R-33临床中，肺水肿的形成涉及肺间质和毛细血管的液体转运，近年来关于肺组织中液体转运的分子机制的研究显示，水通道蛋白(aquaporins，AQPs)是一组在哺乳动物体内表达的水选择通道的分子家族,它们可以增强浆膜面水通透力的功能，因而可以提供快速液体转运的通路[1，2]。
![肺纤维化大鼠肺微血管内皮细胞[Ca 2+]i变化及其机制探讨](https://img.taocdn.com/s1/m/cd5466731711cc7931b71649.png)
初级纤毛在肺微血管内皮细胞抗缺氧损伤中的作用研究秦荣;李雪雁;李凯;田永辉;刘天珍;崔冰冰;邵佳乐;陈克明;马慧萍【摘要】目的研究初级纤毛在肺内皮细胞抗缺氧损伤中的作用及机制.方法将肺微血管内皮细胞(PM-VEC)培养至接近融合时,置于密闭缺氧盒中处理0、6、12、18和24h,观察处理不同时间后的细胞形态和初级纤毛长度的变化.用RNA干扰法(siRNA)抑制IFT-88的表达以观察PMVEC初级纤毛的发生情况,同时以无意义干扰序列作为阴性对照组(对照组).将对照组和siRNA组同时置于缺氧环境0、6、12、18和24 h,检测各时间点的活性氧(ROS)和丙二醛(MDA)含量,谷胱甘肽氧化物酶(GSP-PX)和超氧化物歧化酶(SOD)活性.结果缺氧导致PMVEC细胞受损,且初级纤毛长度较常氧环境下显著增加(P<0.01).IFT88表达被干扰后PMVEC的初级纤毛发生受抑制.对照组PMVEC的ROS、MDA水平在缺氧后逐渐升高,12 h时达到峰值,之后开始下降,24 h后又略有回升;GSH-PX和SOD活性逐渐升高,至12 h时达到峰值,之后持续下降(P<0.01).siRNA组的ROS和MDA水平随着缺氧时间的延长持续升高,GSH-PX和SOD活性无明显变化.结论纤毛参与了胞外缺氧及氧化胁迫信息向胞内的传递并在抗缺氧损伤中发挥了不可或缺的作用.【期刊名称】《解放军医药杂志》【年(卷),期】2019(031)005【总页数】6页(P9-14)【关键词】缺氧;肺微血管内皮细胞;初级纤毛;RNA干扰;抗氧化酶;活性氧【作者】秦荣;李雪雁;李凯;田永辉;刘天珍;崔冰冰;邵佳乐;陈克明;马慧萍【作者单位】730050 兰州,兰州理工大学生命科学与工程学院;730050 兰州,兰州理工大学生命科学与工程学院;730050 兰州,中国人民解放军联勤保障部队第九四〇医院(原解放军兰州总医院)骨科研究所;730050 兰州,中国人民解放军联勤保障部队第九四〇医院(原解放军兰州总医院)骨科研究所;730050 兰州,中国人民解放军联勤保障部队第九四〇医院(原解放军兰州总医院)骨科研究所;730050 兰州,中国人民解放军联勤保障部队第九四〇医院(原解放军兰州总医院)骨科研究所;730050 兰州,中国人民解放军联勤保障部队第九四〇医院(原解放军兰州总医院)骨科研究所;730050 兰州,中国人民解放军联勤保障部队第九四〇医院(原解放军兰州总医院)骨科研究所;730050 兰州,中国人民解放军联勤保障部队第九四〇医院(原解放军兰州总医院)药剂科【正文语种】中文【中图分类】R594.3;Q26缺氧是导致多种急、慢性疾病的重要原因。
MAPKs家族在中暑小鼠肺微血管内皮细胞凋亡中的作用及机制研究刘亚楠;徐秋林;郭晓华;周耿标;王郑莲;童华生;陆杰富;邱俊铭;苏磊【摘要】Objective To investigate the effect of mitogen-activated protein kinases (MAPKs) activation on the heat stressinduced apoptosis of pulmonary microvascular endothelial cells (PMVECs).Methods A mouse model of severe heat stroke was made and TUNEL and immunohistochemistry were employed to detect lung tissuedamage.MACS separation was used for isolation of neonatal PMVECs,and TUNEL was utilized to detect the apoptosis of PMVECs.Western blotting was used for determining the MAPKs activation during heat stress recovery (0,2,6h).The monolayer permeability of endothelial cells was detected in terms of transmembrane resistance (TEER) and horseradish peroxidase (HRP).Cells were pretreated with MAPKs activation inhibitors to examine the effect of heat stress on the monolayer cell permeability and apoptosis.Results In mice with severe heat stroke,extensive apoptosis of PMVECs was found in their pulmonary tissues.TUNEL revealed that the number of apoptotic cells increased over time during heat stress recovery period and heat stress could activate MAPKs in pared with heat stress group,in the cells pretreated with p38 or ERK activation inhibitor PD98059 and SB203580,the monolayer permeability and apoptosis increased while in cells pretreated withJNK inhibitorSP600125,the cellular permeability and apoptosis decreased.Conclusion Inmice with severe heat stoke,PMVECs might experience apoptosis and p38 and ERK could inhibit apoptosis while JNK could promote apoptosis.%目的研究丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)活化对热打击致小鼠肺微血管内皮细胞(PMVECs)凋亡的影响.方法建立重症中暑小鼠模型,采用TUNEL染色及免疫组化检测肺组织损伤情况.二次磁珠分选法分离乳鼠PMVECs,TUNEL染色检测PMVECs凋亡情况,Western blotting检测热打击恢复期(0、2、6h)MAPKs家族活化情况.通过检测单层内皮细胞跨膜电阻(TEER)及辣根过氧化物酶(HRP)值观察不同热打击温度对单层细胞通透性的影响,同时使用MAPKs家族抑制剂检测热打击对单层细胞通透性及凋亡的影响.结果在重症中暑小鼠恢复期肺组织中可观察到PMVECs发生凋亡.TUNEL染色发现随着恢复期时间的延长,PMVECs凋亡数目增多,热打击可使PMVECs MAPKs家族活化且微血管通透性增加,给予p38活化抑制剂SB203580及ERK活化抑制剂PD98059预处理后细胞通透性增加,凋亡数目增多,而给予JNK抑制剂SP600125预处理后细胞则出现相反的变化.结论重症中暑小鼠PMVECs可发生凋亡,p38及ERK起着抗凋亡的作用,JNK起着促凋亡的作用.【期刊名称】《解放军医学杂志》【年(卷),期】2017(042)004【总页数】6页(P279-284)【关键词】中暑;肺微血管内皮细胞;丝裂原活性蛋白激酶类;细胞凋亡;细胞通透性【作者】刘亚楠;徐秋林;郭晓华;周耿标;王郑莲;童华生;陆杰富;邱俊铭;苏磊【作者单位】510010广州广州军区广州总医院重症医学科;510515广州南方医科大学南方医院重症医学科;510010广州广州军区广州总医院重症医学科;510515广州南方医科大学南方医院重症医学科;510405广州广州中医药大学研究生院;510405广州广州中医药大学研究生院;510010广州广州军区广州总医院重症医学科;510515广州南方医科大学南方医院重症医学科;510010广州广州军区广州总医院重症医学科;510010广州广州军区广州总医院重症医学科【正文语种】中文【中图分类】R594.1+2[Key words]heat stroke; pulmonary microvascular endothelial cells; mitogen-activated protein kinases; apoptosis; cell permeability重症中暑可导致多脏器功能衰竭，其发病机制目前尚不完全清楚[1-4]。
血小板活化与肿瘤血行转移关系的研究进展李晨旭【期刊名称】《肿瘤基础与临床》【年(卷),期】2012(025)004【总页数】2页(P367-368)【关键词】血小板活化;肿瘤;血行转移【作者】李晨旭【作者单位】延安大学附属医院血液免疫科,陕西,延安,716000【正文语种】中文【中图分类】R563;R73-37肿瘤血行转移是指肿瘤从原发病灶脱落并随血液循环转移到远处靶器官，并逐渐形成转移灶的过程。
血小板活化包括血小板形态的改变、血小板聚集功能及血小板成分的释放。
研究［1－2]发现随着肿瘤的转移，血小板活化的数目或血小板活化的可能性就会随之增加，两者呈正相关关系。
反之减少血小板活化的数目或抑制血小板活化可不同程度抑制肿瘤转移。
血小板活化是形成血栓的重要前提之一，从尸检中发现肿瘤血行转移的患者常常在肿瘤细胞部位有血栓形成。
1958年Wood首次用实验手段发现了肿瘤细胞周围形成血栓的全过程，并因此得出相关结论，血栓形成是肿瘤细胞血行转移的先决条件。
1962年Gasic等培养肿瘤细胞诱导出血小板聚集，进而证明了肿瘤与血小板活化的密切关系，为血小板活化与肿瘤的研究奠定了基础。
肿瘤细胞具有激活血小板并诱导血小板聚集的能力，这种现象称之为“细胞诱导的血小板聚集”。
当肿瘤细胞从原发灶脱落进入血液后，开始启动血行转移，其可迅速激活血小板发生一系列的改变，释放出血小板活化因子，在其作用下血小板与肿瘤细胞发生黏附从而结合形成血小板瘤栓。
血小板瘤栓不仅能帮助肿瘤细胞遮挡血流剪切力引起的机械损伤，还可以保护肿瘤细胞逃脱免疫系统的攻击，特别是NK 细胞的免疫杀伤力。
Palumbo等［3]在实验研究过程中发现，绝大部分的肿瘤细胞在血行转移的过程中，被宿主免疫细胞、淋巴细胞等消灭，只有小部分肿瘤细胞通过与活化的血小板形成瘤栓，逃脱正常人免疫系统的杀伤。
研究［4]表明肿瘤细胞释放出炎性介质、血小板数目减少等均可造成血管内皮细胞的损伤。
基金项目:国家863基金项目(编号:2002AA205041)作者单位:西安第四军医大学口腔医学院口腔组织病理学教研室 710032通讯作者:金岩,Tel :029*********,E 2mail :yanjin @大鼠肺微血管内皮细胞培养方法的研究姜明 金岩 刘源 赵宇 刘鹏 董蕊【摘要】 目的:探讨以简单有效的方法获取大鼠微血管内皮细胞,为构建含有血管的组织工程产品提供种子细胞。
方法:用出生1d 的SD 仔鼠的肺组织进行肺微血管内皮细胞的组织块培养。
用第四军医大学口腔医院组织工程中心设计的方法对其进行纯化,用经优化处理的内皮细胞培养液扩大培养。
通过形态学、免疫组织化学、透射电镜鉴定其来源。
结果:用此法进行的原代培养,血细胞在换液和传代过程中被去除,成纤维细胞污染可经第四军医大学口腔医院组织工程中心设计的方案纯化去除。
经鉴定获得的血管内皮细胞纯度较高,生长状态良好。
结论:由此获得的血管内皮细胞纯度高,生长状态良好,该方法可用于构建含有血管的组织工程实验研究。
【关键词】 肺微血管;内皮细胞;细胞培养Culture of microvascular endothelial cellsJiang M i ng ,Ji n Y an ,L i u Y uan ,et al.Depart ment of O ral Histopathology ,Medical College of S tom atology ,The Fourth M ililary Medical U niversity ,Xi ’an 710032,Chi na【Abstract 】Objective :To develop a simple and reproductable method for the isolation and culture of pulmonary mi 2crovascular endothelial cells (MV ECs )of rats.Methods :Lung tissue obtained from neo 2born SD rats was cut into 1mm 3pieces.Primary culture was conducted with explant/outgrowth method in medium A (M199containning 200ml/L of fetal boven serum and 0.09g/L of heparin )for 60h ,then in medium B (DMEM with 100ml/L of fetal boven serum )for 3days and then in medium A continuously.Subculture was conducted by trypsinization and main 2tained in medium A.The pulmonary MV ECs were identified by cell morphology ,immunostaining and transmission electron microscopy.R esults :Primary culture in medium A contained blood cells ,fibroblast like and epidermoid cells ,in medium B for 3days most of the cells were epidermoid.The cells of passage 4were positive for factor Vlll and countained weible 2Palade bodies.Conclusion :The pure pulmonary MV ECs of rats can be attained rapidly and easily by the discribed method.【K ey w ords 】Pul monary m icrovessle;Endothelial cell ;Cell cultivation 中图分类号:Q813.11 文献标识码:A 文章编号:100123733(2004)20120024203 血管内皮细胞密切参与包括再生、发育、伤口愈合等一系列生理及炎症反应过程。
近年来,人们对人和动物的内皮细胞的培养进行了探索,已由大血管(主动脉、脐静脉)内皮细胞发展到微血管内皮细胞(MV ECs )。
另有研究发现对体积大于1mm 3的组织仅靠扩散作用是不能存活的,需要有新生的毛细血管来供给所需的营养和氧气[1]。
而目前的组织工程产品多因其产生血管的能力差而影响其成活与修复效果。
基于此目的,本实验拟寻求一种简单、有效的方法获取微血管内皮细胞,为构建含血管组织工程产品提供种子细胞。
1 材料与方法1.1 材料新生1d SD 仔鼠;M199培养基(G ibco ),DM EM (低糖型,G ibco ),肝素(Sigma ),胎牛血清(G ibco ),胰酶(G ibco )。
1.2 方法1.2.1 培养液的配制 A 液:按本实验室设计的方案配制,以M199为基础培养基,主要添加成份有:200ml/L 的胎牛血清、0.09g/L 肝素;B 液:DM EM ,加入100ml/L 胎牛血清。
1.2.2 取材 将新生1d 的SD 仔鼠处死,酒精浸泡消毒5min ,剪开胸腔,取出心肺组织浸泡于PBS 中备用。
1.2.3 原代培养 将取出的肺组织用PBS 冲洗以洗去血液。
用组织剪去除其表面的胸膜,修剪其周边并用PBS 反复冲洗后剪成1mm ×1mm ×1mm 大小的组织块,放于事先用A 液预湿的6孔板中进行培养,培养液的量以不超过1ml 为宜,培养过程中要不断补充培养液以防组织块干燥。
60h 后去除组织块,加入足量的A 液培养2d ,然后换用B 液培养3d 以去除成纤维细胞,再用A 液继续培养。
1.2.4 传代培养 原代细胞培养5～7d 后,细胞汇合成单层。
用P BS 洗2遍后加2.5g/L 胰蛋白酶消化,37℃,2min 。
可见细胞连接松弛,此时加入等体积的含血清培养液终止消化,吸管轻轻吹打使细胞脱落并混匀。
800r/min ,离心6min 。
弃上清,加入2ml 新的培养液,轻轻吹打混匀,显微镜下计数,以(2～3)×107/L 接种到25ml 塑料瓶中,37℃,φ(CO 2)=5%孵箱培养,每2天换液1次。
1.2.5 血管内皮细胞的鉴定 取生长状态良好的第4代细胞常规消化,取细胞悬液制备细胞甩片,用40g/L 多聚甲醛固定。
甩片经3ml/L T ritonX -100/P BS ,10ml/L H 2O 2/P BS 处理后,滴加抗Ⅷ因子多克隆抗体(1∶80),4℃过夜,次日晨37℃温育30min ,滴加生物素化streptavidin (以上各步骤间均以P BS 充分振洗),DAB 显色,室温5min ,P BS 洗中止显色反应,苏木精衬染,逐级酒精脱水后二甲苯透明,中性树胶封片;阴性对照用P BS 代替一抗。
同时结合细胞形态、透射电镜观察鉴定内皮细胞。
2 结 果2.1 生长情况组织块植入后最先游出的是血细胞,其次是血管内皮细胞,72h 之后成纤维细胞及其他细胞才开始爬出,所以组织块植入60h 将其去掉则可以获得只有血细胞和血管内皮细胞的混合物,成纤维细胞等其他细胞污染的可能性大大降低。
再经B 液纯化后即可排除成纤维细胞的污染。
原代细胞生长5～7d 后可见其汇合成片,多角形细胞呈现明显的铺路石样(图1),胞核清晰,胞浆丰富。
原代细胞长到第7天可传代,传代后细胞增殖活跃,大小均匀,约3～4d 传代1次。
2.2 免疫组织化学鉴定Ⅷ因子相关抗原阳性表达,呈现典型的胞浆棕黄色着色(图2)。
图1 倒置显微镜下微血管内皮细胞呈”铺路石”(cobblestone )样结构(×40)Fig.1 MV ECs with characteristic cobblestone morphology (×40)图2 Ⅷ因子免疫组织化学染色(×100)Fig.2 Staining of MV ECs with anti 2body against Factor Ⅷ(×100)图3 透射电镜显示Weibel 2Palade 小体(×5000)Fig3 Weibel 2Palade bodies observed under transmission electronmicroscopy (TEM )(×5000)2.3 透射电镜鉴定内皮细胞表面有胞浆突起,核仁大且明显,胞质内有发达的高尔基复合体、粗面内质网和滑面内质网,含有杆状的Weibel 2Palade 小体(图3,4),其内含有多条平行细管状结构。
图4 透射电镜显示Weibel 2Palade 小体(×30000)Fig4 Weibel 2Palade bodies observed under transmission electronmicroscopy (TEM )(×30000)3 讨 论目前用于血管内皮细胞的培养方法主要有酶消化法、组织块法、机械刮取法等。
其中酶消化法主要用于大血管内皮细胞的培养。
酶消化法较其他方法昂贵且操作较复杂,技术要求较高,同时还存在严重的其他细胞污染的问题。
与此相比组织块法则简单、经济,不需使用昂贵的胶原酶和对细胞有毒性的胰蛋白酶,同时可以避免消化法中组织剪碎等过程对细胞造成的机械的损伤[2,3]。
通常获得的原代血管内皮细胞含有成纤维细胞污染,且成纤维细胞生长较内皮细胞快,可将内皮细胞迅速覆盖。
因此,需采用一些纯化方法使内皮细胞高纯度生长。
目前的纯化方法有过滤-离心法、物理刮除法、更换培养液法、生长特性选择法、单克隆增殖法及磁珠法等,且各有其优缺点。
像物理刮除法及单克隆增殖法均要求在培养的过程中根据观察到的细胞形态对其处理,此法较复杂且不易操作[4]。
本实验采用组织块法进行肺微血管内皮细胞的培养,这也是微血管内皮细胞培养常用的方法[3]。
据文献[2]报道,用该方法进行原代培养的细胞72h 之内只有血细胞和内皮细胞爬出,通常在60h 去除组织块后持续培养即可获得纯度较高的内皮细胞,但经本实验室研究发现用该方法并不能百分之百获得内皮细胞,经常伴有成纤维细胞污染。
因此本实验室在此基础上进一步改进,建立了一个新的培养系统:在去除组织块后用A 液继续培养2d ,细胞贴壁后用B 液养3d ,然后再换用A 液长期培养。
