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大肠埃希氏杆菌噬菌体的分离与纯化【实验目的】1.培养自主查阅资料，自行设计、整理实验方案，自己安排实验的能力。
2.通过综合性大实验进一步掌握微生物实验的基本原理和技术、培养无菌意识。
3.培养互助协作的团队精神和分析解决问题的能力。
4.掌握从污水中分离和纯化大肠埃希氏菌噬菌体的原理。
5.掌握噬菌体的分离与纯化以及用双层琼脂平板法培养噬菌体的方法。
【实验原理】1.凡有寄主细胞存在的地方，一般都能找到其相应的噬菌体。
粪便和阴沟污水等往往是各种肠道细菌尤其是大肠杆菌的栖居地，故常能从其中分离到各肠杆菌噬菌菌株的相应噬菌体。
2.从自然界分离某一噬菌体的一般方法是：（1）培养寄主细胞（大肠杆菌）；（2）采集含有相应寄主细胞的噬菌体（阴沟污水）；（3）将样品内的细胞进行富集培养；（4）制备噬菌体裂解液；（5）检测噬菌体是否存在；（6）噬菌体的纯化及效价测定。
3.培养基的配制（配方）与灭菌（1）3×牛肉膏蛋白胨培养液：牛肉膏9克，蛋白胨30克，NaCl 15克，自来水1000ml,Ph 7.2-7.4.（2）牛肉膏蛋白胨培养液：牛肉膏3克，蛋白胨10克，NaCl 5克，自来水1000ml,Ph 7.2-7.4.（3）牛肉膏蛋白胨固体培养基：牛肉膏3克，蛋白胨10克，NaCl 5克，琼脂条20克，自来水1000 ml，Ph 7.2-7.4。
（4）牛肉膏蛋白胨琼脂半固体培养基：牛肉膏3克，蛋白胨10克，NaCl 5克，琼脂条7克，自来水1000ml,Ph 7.2-7.4。
封好做好标记于121℃灭菌20min备用【实验材料及器皿】1.菌种：大肠埃希氏菌。
2.噬菌体样品：矛坡的阴沟污水3.培养基：3×牛肉膏蛋白胨培养液，牛肉膏蛋白胨培养液，牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，牛肉膏蛋白胨琼脂半固体培养基。
4.仪器：离心机，恒温水浴锅，冰箱，恒温培养箱，高压灭菌锅，酒精灯，量筒，微量移液器及枪头，火柴，接种针，标记笔，无菌涂布棒，培养皿，试管，三角瓶，电热炉，玻璃棒，牛皮纸，纱布，PH试纸，橡皮筋。
细菌的噬菌体分型实验二细菌的噬菌体分型第一部分肠杆菌科噬菌体的分离、纯化与增殖噬菌体广泛存在于自然界。
凡是有细菌存在的地方，一般都能找到相应的噬菌体。
例如，土壤、肥料、腐烂有机物、粪便和阴沟污水等常是各种细菌的栖息地，从中能分离到相应的噬菌体。
从自然界分离某一噬菌体需要经过以下步骤:培养宿主菌(或叫做敏感菌);采集含噬菌体的样品;噬菌体富集培养;制备噬菌体裂解液;验证噬菌体的存在;噬菌体的纯化;噬菌体的增殖;噬菌体的效价测定和保存。
下面以大肠杆菌噬菌体为例详细介绍噬菌体的分离和纯化方法。
1( 噬菌体的分离(1)制备菌悬液:取大肠杆菌斜面一支，加4ml无菌水洗下菌苔，制成菌悬液。
(2)增殖培养:于10ml三倍浓缩的肉膏蛋白胨液体培养基的三角烧瓶(1支5ml吸管)中，加入污水样品20ml(1支5ml吸管)与大肠杆菌悬液0.2ml(1支1ml吸管)，37?培养12h,24h以增殖噬菌体。
(3)制备裂解液:将以上增殖的混合培养液2500r/min离心15 min(1支5ml吸管)。
将上清液倒入无菌平皿，针管抽取液体，在针栓式滤器上过滤除菌。
所得滤液倒入灭菌瓶内，取少量滤液作无菌试验，即将它接入牛肉膏蛋白胨培养液中(1支5ml吸管、1支1ml吸管、1支无菌带帽华氏管)，置于37?培养过夜，以作无菌检查。
(4)噬菌体确证试验:滤液经37?培养过夜，若无细菌生长则表明已经彻底除菌。
需进一步证明噬菌体的存在。
于已烘干的肉膏蛋白胨琼脂平板(平皿1个)表面加一滴大肠杆菌悬液(1支1ml吸管)，再用灭菌玻璃涂布器将菌液涂布成均匀的一薄层。
放置数分钟，待琼脂表面干燥，在菌层的表面布点5个,7个，每点滴加上述滤液1小滴(1ml枪1把和枪头10个)，同时选择其中一点不加滤液只滴加一小滴生理盐水为对照，再放置数分钟，使液滴被琼脂吸干。
倒置平板，37?培养过夜。
次日观察结果，若平板上滴加滤液的部位出现噬菌斑，而在对照滴中处无噬菌斑，则表明该滤液中肯定含有大肠杆菌相应噬菌体。
噬菌体的分离纯化及效价的测定1 目的1.1 了解噬菌体效价的含义及其测定原理。
1.2 学会检查噬菌体的方法。
1.3 掌握用双层琼脂平板法测定噬菌体效价的操作技能。
2 原理噬菌体是一类专性寄生于细菌和放线菌等微生物的病毒，其个体形态极其微小，用常规微生物计数法无法测得其数量。
当烈性噬菌体侵染细菌后会迅速引起敏感细菌裂解，释放出大量子代噬菌体，然后它们再扩散和侵染周围细胞，最终使含有敏感菌的悬液由混浊逐渐变清，或在含有敏感细菌的平板上出现肉眼可见的空斑──噬菌斑。
了解噬菌体的特性，快速检查、分离，并进行效价测定，对在生产和科研工作中防止噬菌体的污染具有重要作用。
检样可以是发酵液、空气、污水、土壤等（至于无法采样而需检查的对象，可以用无菌水浸湿的棉花涂拭表面作为检查样品）。
为了易于分离可先经增殖培养，使样品中的噬菌体数量增加。
采用生物测定法进行噬菌体检查，约需12h左右，因而不能及时判断是否有噬菌体污染。
通过快速检查可大致确定是否有噬菌体污染，以采取必要的防治措施。
根据正常发酵（培养）液离心后菌体沉淀，上清液蛋白含量很少，加热后仍然清亮；而侵染有噬菌体的发酵（培养）液经离心后其上清液中因含有自裂解菌中逸出的活性蛋白，加热后发生蛋白质变性，因而在光线照射下出现丁达尔效应而不清亮。
此法简单、快速，对发酵液污染噬菌体的判断亦较准确。
但不适于溶源性细菌及温合噬菌体的诊断，对侵染噬菌体较少的一级种子培养液也往往不适用。
噬菌体的效价即１mL样品中所含侵染性噬菌体的粒子数。
效价的测定一般采用双层琼脂平板法。
由于在含有特异宿主细菌的琼脂平板上，一般一个噬菌体产生一个噬菌斑，故可根据一定体积的噬菌体培养液所出现的噬菌斑数，计算出噬菌体的效价。
此法所形成的噬菌斑的形态、大小较一致，且清晰度高，故计数比较准确，因而被广泛应用。
3 材料3.1菌种敏感指示菌（大肠杆菌）、大肠杆菌噬菌体(从阴沟或粪池污水中分离)。
3.2培养基二倍肉膏蛋白胨培养液，上层肉膏蛋白胨半固体琼脂培养基（含琼脂0.7%，试管分装，每管５mL），下层肉膏蛋白胨固体琼脂培养基（含琼脂2%），1%蛋白胨水培养基。
大肠埃希氏杆菌噬菌体的分离与纯化【实验目的】1.培养自主查阅资料，自行设计、整理实验方案，自己安排实验的能力。
2.通过综合性大实验进一步掌握微生物实验的基本原理和技术、培养无菌意识。
3.培养互助协作的团队精神和分析解决问题的能力。
4.掌握从污水中分离和纯化大肠埃希氏菌噬菌体的原理。
5.掌握噬菌体的分离与纯化以及用双层琼脂平板法培养噬菌体的方法。
【实验原理】1.凡有寄主细胞存在的地方，一般都能找到其相应的噬菌体。
粪便和阴沟污水等往往是各种肠道细菌尤其是大肠杆菌的栖居地，故常能从其中分离到各肠杆菌噬菌菌株的相应噬菌体。
2.从自然界分离某一噬菌体的一般方法是：（1）培养寄主细胞（大肠杆菌）；（2）采集含有相应寄主细胞的噬菌体（阴沟污水）；（3）将样品内的细胞进行富集培养；（4）制备噬菌体裂解液；（5）检测噬菌体是否存在；（6）噬菌体的纯化及效价测定。
3.培养基的配制（配方）与灭菌（1）3×牛肉膏蛋白胨培养液：牛肉膏9克，蛋白胨30克，NaCl 15克，自来水1000ml,Ph 7.2-7.4.（2）牛肉膏蛋白胨培养液：牛肉膏3克，蛋白胨10克，NaCl 5克，自来水1000ml,Ph 7.2-7.4.（3）牛肉膏蛋白胨固体培养基：牛肉膏3克，蛋白胨10克，NaCl 5克，琼脂条20克，自来水1000 ml，Ph 7.2-7.4。
（4）牛肉膏蛋白胨琼脂半固体培养基：牛肉膏3克，蛋白胨10克，NaCl 5克，琼脂条7克，自来水1000ml,Ph 7.2-7.4。
封好做好标记于121℃灭菌20min备用【实验材料及器皿】1.菌种：大肠埃希氏菌。
2.噬菌体样品：矛坡的阴沟污水3.培养基：3×牛肉膏蛋白胨培养液，牛肉膏蛋白胨培养液，牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，牛肉膏蛋白胨琼脂半固体培养基。
4.仪器：离心机，恒温水浴锅，冰箱，恒温培养箱，高压灭菌锅，酒精灯，量筒，微量移液器及枪头，火柴，接种针，标记笔，无菌涂布棒，培养皿，试管，三角瓶，电热炉，玻璃棒，牛皮纸，纱布，PH试纸，橡皮筋。
噬菌体的分离纯化及效价的测定1 目的1.1 了解噬菌体效价的含义及其测定原理。
1.2 学会检查噬菌体的方法。
1.3 掌握用双层琼脂平板法测定噬菌体效价的操作技能。
2 原理噬菌体是一类专性寄生于细菌和放线菌等微生物的病毒，其个体形态极其微小，用常规微生物计数法无法测得其数量。
当烈性噬菌体侵染细菌后会迅速引起敏感细菌裂解，释放出大量子代噬菌体，然后它们再扩散和侵染周围细胞，最终使含有敏感菌的悬液由混浊逐渐变清，或在含有敏感细菌的平板上出现肉眼可见的空斑──噬菌斑。
了解噬菌体的特性，快速检查、分离，并进行效价测定，对在生产和科研工作中防止噬菌体的污染具有重要作用。
检样可以是发酵液、空气、污水、土壤等（至于无法采样而需检查的对象，可以用无菌水浸湿的棉花涂拭表面作为检查样品）。
为了易于分离可先经增殖培养，使样品中的噬菌体数量增加。
采用生物测定法进行噬菌体检查，约需12h左右，因而不能及时判断是否有噬菌体污染。
通过快速检查可大致确定是否有噬菌体污染，以采取必要的防治措施。
根据正常发酵（培养）液离心后菌体沉淀，上清液蛋白含量很少，加热后仍然清亮；而侵染有噬菌体的发酵（培养）液经离心后其上清液中因含有自裂解菌中逸出的活性蛋白，加热后发生蛋白质变性，因而在光线照射下出现丁达尔效应而不清亮。
此法简单、快速，对发酵液污染噬菌体的判断亦较准确。
但不适于溶源性细菌及温合噬菌体的诊断，对侵染噬菌体较少的一级种子培养液也往往不适用。
噬菌体的效价即１mL样品中所含侵染性噬菌体的粒子数。
效价的测定一般采用双层琼脂平板法。
由于在含有特异宿主细菌的琼脂平板上，一般一个噬菌体产生一个噬菌斑，故可根据一定体积的噬菌体培养液所出现的噬菌斑数，计算出噬菌体的效价。
此法所形成的噬菌斑的形态、大小较一致，且清晰度高，故计数比较准确，因而被广泛应用。
3 材料3.1菌种敏感指示菌（大肠杆菌）、大肠杆菌噬菌体(从阴沟或粪池污水中分离)。
3.2培养基二倍肉膏蛋白胨培养液，上层肉膏蛋白胨半固体琼脂培养基（含琼脂0.7%，试管分装，每管５mL），下层肉膏蛋白胨固体琼脂培养基（含琼脂2%），1%蛋白胨水培养基。
幽门螺旋杆菌噬菌体裂解系统及其表达纯化方法和应用幽门螺旋杆菌（Helicobacter pylori）是一种常见的胃肠道致病菌，在人类胃黏膜中引起多种疾病，包括慢性胃炎、消化性溃疡和胃癌等。
为了适应宿主环境并有效地定殖于胃黏膜，幽门螺旋杆菌具有复杂且高效的获得铁源和逃避宿主免疫攻击的机制。
在幽门螺旋杆菌的适应性进化过程中，噬菌体（phage）在菌株间的转移起到了重要的作用。
噬菌体是一种具有细胞寄生性的病毒，能通过感染细菌并利用其生物合成机制来复制自身。
幽门螺旋杆菌噬菌体被称为ΦHPP12，通过编码一种特别的裂解系统，能够在宿主细胞中释放并破坏细胞壁，从而释放大量的噬菌体。
幽门螺旋杆菌噬菌体裂解系统主要包括三个基本组分：裂解酶（endolysin）、膜相关蛋白（holin）和锚定蛋白（spanin）。
裂解酶是裂解系统的核心组分，能够切割细胞壁的肽聚糖链，导致胞内外渗透平衡失调，最终导致细胞爆破。
膜相关蛋白在细菌细胞膜上形成通道，使裂解酶能够进入细胞质内。
锚定蛋白通过与裂解酶和膜相关蛋白相互作用，将裂解酶定位到特定的位置，以确保有效的裂解过程。
为了研究幽门螺旋杆菌噬菌体裂解系统的机制以及开发相关的应用，研究人员开展了表达纯化幽门螺旋杆菌噬菌体裂解系统的研究。
首先，需要通过PCR方法从幽门螺旋杆菌中克隆出裂解酶、膜相关蛋白和锚定蛋白的基因序列。
接着，将这些基因序列插入适当的表达载体中，并将其转化到大肠杆菌等表达宿主中。
通过感受态筛选、鉴定阳性克隆以及培养大规模表达，可以获得大量的幽门螺旋杆菌裂解系统蛋白。
纯化幽门螺旋杆菌噬菌体裂解系统蛋白的方法主要包括细胞裂解、亲和层析和分子筛分离等步骤。
首先，利用超声波等方法将表达宿主细胞进行裂解，释放蛋白质。
接着，通过亲和层析柱中特异性的亲和标记，如His标记，将目标蛋白与其他蛋白质分离。
最后，通过分子筛分离技术进一步提纯目标蛋白，得到高纯度的幽门螺旋杆菌噬菌体裂解系统蛋白。
噬菌体的分离及其寄主细胞的鉴定噬菌体是一种寄生于细菌的病毒，其存在的意义在于调节细菌数量，维持生态平衡。
与其他病毒不同的是，噬菌体的寄主是细菌，而细菌则作为噬菌体的繁殖基质。
因此，了解噬菌体的分离及其寄主细胞的鉴定对于维持微生物群落的稳定，维护人类健康具有重要意义。
一、噬菌体的分离方法噬菌体可以通过两种方法分离：（1）寄主膜破碎法；（2）巨细胞法。
寄主膜破碎法是最常用的噬菌体分离方法，其原理为化学溶解寄主菌的细胞壁和膜，使得噬菌体被释放。
该方法的具体步骤为：（1）将寄主菌接种到培养皿中；（2）加入一定浓度的化学物质，如Tween 80、SDS等，使得细胞壁和膜溶解；（3）离心沉淀，去除寄主菌留下噬菌体。
巨细胞法是一种体外培养细胞法，其原理为在营养缺乏的培养液中，将噬菌体感染到寄主细胞并使其增殖，形成巨细胞，最终分离出噬菌体。
该方法的具体步骤为：（1）通过定量PCR或滴定法测定噬菌体的初始含量；（2）将噬菌体感染到与其适宜的寄主细胞上，培养到合适的时间，直至形成巨细胞；（3）收集巨细胞，离心沉淀，分离出噬菌体。
二、寄主细胞的鉴定方法寄主细胞的鉴定是噬菌体研究中非常关键的一步。
它不仅可以确定噬菌体的寄主范围，还可以研究噬菌体与细菌之间的相互作用和生态响应。
常用的寄主细胞鉴定方法有三种：（1）凝胶探针法；（2）PCR法；（3）无基因片段标记法。
凝胶探针法是一种经典的寄主细胞鉴定方法，其原理为将寄主菌接种到寒暖交替的凝胶中，凝胶中形成的细胞克隆呈现不同的形态，通过寻找与噬菌体作用的细胞克隆，识别寄主细胞。
该方法虽然准确性较高，但需要大量耗时和耗材，难以大量应用。
PCR法是一种简便快速的寄主细胞鉴定方法，其原理为针对细胞壁或内质网上的基因间隔区，设计特异的引物，进行PCR扩增，通过扩增产物的测序或分子量鉴别寻找寄主细胞。
该方法的优势在于对样品的要求低，检测速度快，能够大量应用。
无基因片段标记法是一种新型的寄主细胞鉴定方法，其原理为将受噬菌体感染的细胞进行荧光标记或电化学标记，利用仪器检测关键生化分子的变化，直接寻找寄主细胞。
噬菌体的分离与纯化优
化版
集团标准化办公室：[VV986T-J682P28-JP266L8-68PNN]
噬菌体的分离与纯化
实验用具及材料
1.菌种：大肠杆菌
2.试剂：氯仿
3.培养基：
O至1）液体牛肉膏培养基：胰蛋白胨2g，牛肉膏0.6 g，NaCl 1g，加H
2 200mL，pH7.4，121 ℃20min高压灭菌；
O至2）3×牛肉膏培养液：胰蛋白陈3g，牛肉膏 0.9g，NaCl 1.5g，加H
2 100mL，pH7.4，121 ℃20min高压灭菌；
3）固体牛肉膏培养基：每100mL液体牛肉膏培养基加入1.5g琼脂粉，
121 ℃20min高压灭菌；
4）半固体牛肉膏培养基：每100mL液体牛肉膏培养基加入0.7g琼脂粉，
121℃20min高压灭菌
4.仪器及其他用品：灭菌试管、灭菌吸管、玻璃涂布器、无菌细菌过滤器（孔径
0.22um），培养皿，蓝盖试剂瓶，恒温水浴锅，离心机等
实验步骤
1.噬菌体的分离
（1）制备菌悬液：用接种环在斜面上挑取少许大肠杆菌菌苔接入盛有5mL牛肉膏蛋白胨培养液1）的试管中，混合均匀后置37℃培养过夜。
/取大肠杆菌斜面一支，加4ml 无菌水洗下菌苔，制成菌悬液。
（2）增殖培养：在盛有10mL 3倍牛肉膏蛋白胨液体培养基2）大的试剂瓶中加入噬菌体原液20mL和大肠杆菌悬液0.3mL，混合后置37℃振荡培养12～24h。
（3）制备裂解液：将上述混合培养物分别倒入五支10mL无菌离心管中，经
4000r/min离心15min；将上清液小心的转入另一无菌离心管中。
（4）确证试验所得裂解液经37℃培养过夜，经无菌检查没有细菌生长的滤液作进一步证明噬菌体的存在；还可加入几滴氯仿，稍作混合，备用。
（5）噬菌体检测:在牛肉膏蛋白胨琼脂平板上加入0.1mL（1滴）大肠杆菌菌
液，用灭菌玻璃涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面上。
待平板菌液干后分别滴加数小滴裂解液于其上，置37℃培养过夜。
如果滴有裂解液处形成无菌生长的透明或浑浊噬菌斑，便证明裂解液中有大肠杆菌噬菌体。
2.噬菌体的纯化
（1）取上经证实的噬菌体裂解液0.1mL于一支无菌试管中，再加入0.1mL新鲜的大肠杆菌悬液，混合均匀；
（2）取上层琼脂培养基溶化并冷却至45℃（可预先溶化后置45～55℃水浴锅内保温备用），加入0.2mL上述噬菌体与细菌的混合物，混匀后快速倒入底层培养基上，铺匀，置37℃培养12~24h；
（3）取出培养的平板仔细观察平板上噬菌斑的形态特征（如噬菌斑形状、大小、清亮程度等）。
此过程制备的裂解液中往往有多种噬菌体，需进一步纯化；
（4）纯化时，通常采用接种针在单个噬菌斑中刺一下，蘸取少许噬菌体接入含有大肠杆菌的液体培养基中，置37℃振荡培养，直至试管中菌悬液由浑浊变清；
培养物经离心后取上清液，再重复步骤⑵、⑶直到出现的噬菌斑形态一致为止注意事项
1.使用仪器要保证是灭菌的；
2.注意琼脂的浓度；
3.氯仿是易燃品，应远离火焰
一、生物测定法
1、双层琼脂平板法
1）倒下层琼脂
融化下层培养基，倒平板（约10mL/皿）待用。
2）倒上层琼脂
融化上层培养基，待融化的上层培养基冷却至50℃左右时，每管中加入大肠杆菌菌液0.2mL，上述噬菌体增殖液0.2～0.5mL，混合后立即倒入上层平板铺平。
3）恒温培养
30℃恒温培养6～12h观察结果。
4）观察结果
如有噬菌体，则在双层培养基的上层出现透亮无菌圆形空斑──噬菌斑。
2、单层琼脂平板法
省略下层培养基，将上层培养基的琼脂量增加至2%，融化后冷却至45℃左右，如同上法加入大肠杆菌和噬菌体增殖液，混合后迅速倒平板。
30℃恒温培养6～16h 后观察结果。
噬菌体效价的测定
1、倒平板
将融化后冷却到45℃左右的下层肉膏蛋白胨固体培养基倾倒于11个无菌培养皿中，每皿约倾注10mL培养基，平放，待冷凝后在培养皿底部注明噬菌体稀释度。
2、稀释噬菌体
按10倍稀释法，吸取0.5mL大肠杆菌噬菌体，注入一支装有4.5mL1%蛋白胨水的试管中，即稀释到10-1，依次稀释到10-6稀释度。
噬菌体与菌液混合
将11支灭菌空试管分别标记10-4、10-5、10-6和对照。
分别从10-4、10-5和10-6噬菌体稀释液中吸取0.1mL于上述编号的无菌试管中，每个稀释度平行做三个管，在另外两支对照管中加0.1mL无菌水，并分别于各管中加入0.2mL大肠杆菌菌悬液，振荡试管使菌液与噬菌体液混合均匀，置37℃水浴中保温5min，让噬菌体粒子充分吸附并侵入菌体细胞。
接种上层平板
将11支融化并保温于45℃的上层肉膏蛋白胨半固体琼脂培养基5mL分别加入到含有噬菌体和敏感菌液的混合管中，迅速搓匀，立即倒入相应编号的底层培养基平板表面，边倒入边摇动平板使其迅速地铺展表面。
水平静置，凝固后置37℃培养。
观察并计数
观察平板中的噬菌斑，并将结果记录于实验报告表格内，选取每皿有30～300个噬菌斑的平板计算噬菌体效价。
计算公式：N=Y/V×X
（Ｎ：效价值，Ｙ：平均噬菌斑数／皿，Ｖ：取样量，Ｘ：稀释度）
例如：当稀释度为10-6时，取样量为0.1 mL/皿，同一稀释度中３个平板上的噬菌斑的平均值为186个，则该样品的效价为：Ｎ＝186／0.1×10-6＝1.86×109。
结果
1、噬菌体检查
2）绘出平板上的噬菌斑检测结果，指出噬菌斑和宿主细菌。
2、噬菌体效价测定
1）平板上噬菌斑数目
噬菌体稀释度 10-4 10-5 10-6对照
噬菌斑数（个）/皿
平均每皿噬菌斑数目
2）计算噬菌体效价(即噬菌斑形成单位pfu, plague-forming unit).。
