脱氢酶活性的测定

1. 了解脱氢酶的特性和作用机制。

2. 掌握脱氢酶测定实验的方法和原理。

3. 学会使用分光光度计进行脱氢酶活性的测定。

二、实验原理脱氢酶是一类催化氧化还原反应的酶，可以将底物中的氢原子转移给辅酶，从而实现底物的氧化。

本实验以乳酸脱氢酶（LDH）为例，通过测定其在特定条件下催化乳酸氧化为丙酮酸的反应速率，来间接反映LDH的活性。

三、实验材料1. 乳酸脱氢酶（LDH）提取液2. 乳酸（底物）3. 丙酮酸（产物）4. 磷酸缓冲液5. 分光光度计6. 移液器7. 试管8. 秒表四、实验方法1. 准备工作：将LDH提取液、乳酸、丙酮酸、磷酸缓冲液等实验材料分别置于相应的试管中，调节pH至7.4。

2. 设置对照组：取一定量的磷酸缓冲液，加入LDH提取液，作为对照组。

3. 设置实验组：取一定量的乳酸，加入LDH提取液，作为实验组。

4. 测定吸光度：将对照组和实验组的试管放入分光光度计中，在特定波长下测定吸光度。

5. 计算反应速率：根据吸光度变化，计算LDH的活性。

1. 准备工作：将LDH提取液、乳酸、丙酮酸、磷酸缓冲液等实验材料分别置于相应的试管中，调节pH至7.4。

2. 设置对照组：取1ml磷酸缓冲液，加入1ml LDH提取液，混匀后放入分光光度计中，在波长340nm处测定吸光度，记录为A0。

3. 设置实验组：取1ml乳酸，加入1ml LDH提取液，混匀后放入分光光度计中，在波长340nm处测定吸光度，记录为A1。

4. 加入丙酮酸：向实验组中加入1ml丙酮酸，混匀后立即放入分光光度计中，在波长340nm处测定吸光度，记录为A2。

5. 计算反应速率：计算A1与A0的差值（ΔA），ΔA表示在反应过程中吸光度的变化。

根据反应速率公式：反应速率= ΔA / Δt其中，Δt为反应时间，本实验中Δt为1分钟。

六、实验结果与分析1. 通过实验，成功测定了LDH的活性，得到实验数据如下：A0 = 0.3A1 = 0.6A2 = 0.92. 计算反应速率：ΔA = A1 - A0 = 0.6 - 0.3 = 0.3Δt = 1分钟反应速率= ΔA / Δt = 0.3 / 1 = 0.33. 结果分析：根据实验结果，LDH在1分钟内催化乳酸氧化为丙酮酸的反应速率为0.3。

脱氢酶活性的测定一.实验目的了解活性污泥脱氢酶活性的测定原理及方法二.实验原理活性污泥法对于有机物的降解，实质上是微生物经过一系列的酶的催化作用下的生物氧化还原反应。

参加生物氧化的重要酶为氧化酶和脱氢酶二大类，其中脱氢酶类尤为重要。

其中脱氢酶能使氧化有机物的氢原子活化并传递给特定的受氢体实现石油烃的氧化和转化。

如果脱氢酶活化的氢原子被人为受氢体接受，就可以通过直接测定人为受氢体浓度的变化间接测定脱氢酶的活性，表征生物降解过程中微生物的活性。

因此，脱氢酶的活性可以反应处理体系内活性微生物量以及其对有机物的降解活性，以评价降解性能。

脱氢酶活性测定方法有MB.2H定性分析法和TTC比色法，目前用得较多的为氯化三苯基四氮唑（TTC）比色法。

利用TTC作为人为受氢体，其还原反应方程式如下：无无色的TTC受氢后变成红色的TF（三苯基甲月替），根据红色的深浅，测出相应的光密度（OD值），从而计算TF的生成量，求出脱氢酶的活性。

三.实验设备及药品1．紫外-可见光分光光度计、分析天平、50mL棕色容量瓶、50mL三角瓶、比色皿2．4mg/mL的TTC溶液：取400mg TTC（2，3，5-氯化三苯基四氮唑，分析纯）和2g 葡萄糖(0.1mol/L)分析纯溶于少量蒸馏水中，再稀释到100mL的容量瓶中，贮存于棕色瓶中，一周更换一次。

3. Tris-HCl缓冲液（pH=8.4）：称取 6.037g Tris（三羟甲基氨基甲烷，分析纯），再加入20ml 1mol/L的盐酸，再定容至1L。

4. 10%硫化钠：称取10gNa2S（分析纯），定容到100mL的容量瓶中。

5. 无氧水：0.36g亚硫酸钠定容到100ml容量瓶中。

四.实验步骤1．标准曲线的绘制⑴不同浓度的TTC系列溶液的配置：从TTC溶液中移取1，2，3，4，5，6，7mL放入七个50mL的容量瓶中，定容到50mL。

⑵取7支试管，分别加入2mL Tris-HCl缓冲溶液、2mL无氧水、2mL不同浓度的TTC溶液,第八支为对照组。

生物膜微生物活性的测定(TTC-DHA)法在本课题研究中，生物膜微生物的活性通过氯化三苯基四氮唑(TTC)-脱氢酶活性测定法进行。

利用氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride ，TTC；Shanghai Reagent Co., Ltd, Shanghai, China)的还原性产物TTC-甲瓒(TF)的量，来表示微生物的活性。

一、生物膜样品的制备取10g载体生物膜，用蒸馏水润洗2次，置于锥形瓶中，用玻璃珠剧烈摇动将生物膜打碎，用生理盐水20mL稀释，用玻棒搅动，使成悬液，备用。

二、主要仪器和试剂氯化三苯基四氮唑( TTC)-葡萄糖标准溶液:TTC分析纯0.1 g与葡萄糖l g共溶于100 mL蒸馏水中，棕色试剂瓶保存；甲苯(分析纯)；三氯甲烷(分析纯)；三羟甲基氨基甲烷(Tris)-HCI缓冲溶液，pH值为8．6；其它：硫化钠。

三、标准曲线的制作在分液漏斗中依次注入l，2，3，4，5，6 mL浓度为l g ·L-1 TTC-葡萄糖标准溶液，2 mL Tris-HCI缓冲溶液及lmL 10％Na2S新配溶液,摇匀；待溶液充分显色后，准确加入甲苯溶液5mL，振摇，完全提取TF。

放置片刻；待溶液分层后，取有机溶液层, 移至lcm比色皿中,稳定2 min用752紫外分光光度计在波长485nm处，测对应的吸光度(A)值，对脱氢酶活性作图，以试剂空白作对照，绘制标准曲线。

四、生物膜脱氢酶活性测定取生物膜制备液2mL于带塞试管中，依次加入Tris-HCl缓冲液、0.1 mol ·L-1葡萄糖液、0.5％TTC各2 mL，置入37±1℃恒温箱中培养6 h后取出，加2滴浓硫酸终止反应，准确加入5 mL甲苯，振摇，在4000 rpm下离心5 min，取有机溶剂层比色。

在上述条件下，将1h产生1µgTF的量为1个酶活力单位。

细菌休止细胞的制备及其脱氢酶活性的测定摘要休止细胞又叫静息细胞，在研究微生物生理生化及新陈代谢中应用广泛，这种细胞虽然处于休眠状态，不进行生长繁殖，但仍含有各种酶系，具有氧化和发酵能力，是测定细菌脱氢酶活性的良好材料。

本实验用E.coli cVcc249菌株作为实验材料，制备其休止细胞，再加入四种同样浓度的TCA循环中的底物：乙酸钠、琥珀酸钠、α-酮戊二酸及柠檬酸钠，比较和分析在相同浓度、不同底物的情况下，细菌脱氢酶活性的大小；并对其中的α-酮戊二酸和柠檬酸钠两种底物配以浓度梯度，研究其分别与细菌脱氢酶活性之间的相互影响。

在本次实验中，所采用的测定细菌脱氢酶活性的方法是噻唑盐还原法，噻唑盐宜与反应生成的还原氢反应生成水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒，可溶解于二甲亚砜中，再根据其颜色变化的深浅，用分光光度计测其OD510nm值，即可表示细菌脱氢酶的活性。

AbstractThe resting cells, which are widely used in the study of microbial biochemistry and metabolism, are a kind of cells that are dormant ,not growth or reproduction. Those cells still contains a variety of enzymes as well as the capacity of oxidation and fermentation, thus make them good material of determining dehydrogenases activity. The experimental strain is E.coli cVcc249.Firstly,preparing the resting cells of the stain, then adding the four substates of TCA cycle with the same concentration, the four substates are: sodium acetate, sodium succinate, α-ketoglutaric acid and sodium citrate. These allow us to compare and analysis the bacterial dehydrogenase activity in those four same concentration substates. Secondly, making concentration gradient of α-ketoglutaric acid and sodium citrate perspectively, study their functions with bacterial dehydrogenase activity. In this experiment, we us the method of MTT reduction to determine the activity of dehydrogenase. The MTT can be reduced by the bacterial dehydrogenase, and the product is Formazan, which is a water-insoluble and blue-purple crystalline. We can solute Formazan in DMSO, then the samples were checked by measuring spectrophotometrically at 510 nm, which can represent the activity of bacterial dehydrogenase.关键词休止细胞脱氢酶活性α-酮戊二酸柠檬酸钠噻唑盐1.引言1.1 休止细胞1.1.1 休止细胞的定义及特性休止细胞又称静息细胞，是把培养液中各种营养物质和生长因子洗去后悬浮在生理盐水中培养一段时间，以消耗内源营养物质，呈饥饿状态的细胞，在研究微生物的生理生化及新陈代谢中有广泛的应用。

乳酸脱氢酶活力测定注意事项乳酸脱氢酶（LDH）活力测定是一种用于评估细胞损伤或组织损伤的常见实验方法。

以下是进行乳酸脱氢酶活力测定时的一些建议和注意事项：1.样品处理：样品的获取和处理对于测定结果至关重要。

确保样品的采集和处理过程中避免引入细菌、污染物或其他可能影响测定结果的因素。

2.温度控制：乳酸脱氢酶活性受温度影响较大，因此在整个实验过程中要保持恒定的温度。

通常，室温或37摄氏度是常用的温度条件。

3.反应时间：控制反应时间以确保测定的准确性。

一般来说，设定一个适当的反应时间，过短或过长的反应时间都可能影响测定结果。

4.底物浓度：底物（如乳酸）的浓度也会影响乳酸脱氢酶活力的测定。

确保底物的浓度在合适的范围内，并在测定前进行标定。

5.pH值：乳酸脱氢酶活性对pH值敏感，因此保持反应体系的适当pH值是必要的。

使用适当的缓冲液来调整和维持pH。

6.试剂质量：使用高质量的试剂，特别是酶的提取液和底物。

使用过期或质量不佳的试剂可能导致结果不准确。

7.标准曲线：在进行实验之前，制备标准曲线以用于计算未知样品的乳酸脱氢酶活性。

确保标准曲线的准确性和可重复性。

8.控制组：始终包括一个阴性对照组和一个阳性对照组，以确保测定的准确性和可靠性。

9.避免光照：避免样品或试剂受到直接阳光或强光的照射，因为光照可能影响测定结果。

10.记录实验条件：记录实验的所有条件，包括温度、时间、底物浓度、pH 值等。

这有助于排除实验中的潜在变量，并提高结果的可重复性。

在进行乳酸脱氢酶活力测定时，严格遵循实验方法、仪器使用说明和相关安全操作规程，以确保实验的准确性和可靠性。

在有需要的情况下，最好由经验丰富的研究人员进行实验，或在需要时咨询相关专业人士的建议。

连续监测法测定乳酸脱氢酶（LD）总活性的原理和意义一、原理连续监测法是一种基于光学原理的LD活性测定方法。

通常，LD的活性可以通过测定在340 nm波长下NADH（还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸）消耗的速率来反映。

当LD催化乳酸转化为丙酮酸时，同时将NADH氧化为NAD+，这个氧化过程会伴随着光吸收的变化。

通过连续监测样品在340nm波长下的吸光度变化，可以计算出LD的活性。

1.将样品中的LD与乳酸和NADH反应。

2.通过测量样品在340 nm波长下的吸光度的变化，可以获得LD的活性。

3.将样品在反应过程中的吸光度变化绘制成曲线，通过计算曲线的斜率，可以得到LD的活性。

二、意义LD是一种存在于细胞质中的酶，广泛存在于人体组织和器官中，特别是心肌、肝脏和肌肉组织。

LD在糖酵解途径中发挥重要作用，催化乳酸转化为丙酮酸，同时将NADH氧化为NAD+。

因此，测定LD的活性可以用来判断糖酵解途径的功能和疾病的发生与发展。

1.诊断心肌梗死：心肌梗死是导致心肌坏死的一种病变，病变区域心肌组织LD活性升高。

通过测定血清中LD的活性可以辅助诊断心肌梗死。

2.评估肝功能：肝脏是LD的重要合成部位，肝功能异常会导致LD活性的改变。

因此，测定血清中LD的活性可以评估肝功能是否正常。

3.监测肌肉损伤：肌肉损伤会导致LD释放到血液中，因此测定血清中LD的活性可以监测肌肉损伤的程度。

4.鉴别疾病类型：不同类型的疾病会导致乳酸代谢的改变，如肝病、心血管疾病等。

通过测定血清中LD的活性可以鉴别不同类型的疾病。

总结连续监测法测定LD总活性是一种常用的临床实验室检测方法，通过测定LD的活性可以判断糖酵解途径的功能和一些病理情况。

该方法的原理基于光学原理，通过测量样品在340 nm波长下的吸光度的变化来计算LD的活性。

连续监测法测定LD总活性在临床上具有重要意义，可以辅助诊断心肌梗死、评估肝功能、监测肌肉损伤以及鉴别不同类型的疾病。

脱氢酶活性测定（一）基本原理利用2，3，5-三苯基四氮唑氯化物（TTC）为基质（氢受体），由于土壤中脱氢酶的作用使之形成红色的TPF，两者在一定范围内呈线性关系，因此，用比色法测定其形成量作为土壤脱氢酶的活性指标。

（二）实验试剂1、酶促反应试剂（1）0.5mol/L三（羟甲基）氨基甲烷-盐酸缓冲液，pH7.6：2mol/L三（羟甲基）氨基甲烷溶液50mL与1mol/L盐酸溶液75mL混合，加蒸馏水定容到200mL。

（2）0.5%TTC溶液：TTC0.5g溶于0.5mol/L三（羟甲基）氨基甲烷-盐酸缓冲液中，定容到100mL。

2、测定试剂（1）甲醇（2）TPF标准溶液：称取TPF30mg,置于100mL容量瓶中，用甲醇定容到100mL，此溶液浓度即为1μg/Ml.再用甲醇稀释该溶液，配制成25、50、75、100、150ng/mL的标准溶液。

（三）操作步骤1）称取通过2mm筛的土样5g于带塞试管（0.7*15.0cm）中，加入TTC溶液5mL，充分混合。

2）同时设置对照，即在试管内加入三（羟甲基）氨基甲烷-盐酸缓冲液5mL 以替代土壤与TTC。

3）将以上试管置暗处30℃保温培养12h后，分次少量地加入甲醇100mL，移入带塞三角瓶中，用振荡机震荡1h，过滤。

4）取滤液用分光光度计（波长485nm）测定其光密度。

以甲醇作为空白。

5）用上述同样方法测定不同浓度TPF标准溶液光密度，在半对数纸上绘制标准曲线。

6）根据减去空白的光密度查标准曲线，即可求出产生的TPF的量，该量（μg/g 干土）即表示脱氢酶活性。

脱氢酶的活性可按下式计算：土壤脱氢酶活性（μg TPF/g干土）=C×V/dwtC：滤液中TPF的量（μg/mL）（由标准曲线查知）；V：滤液的体积（mL）；dwt:烘干土壤重量（g）。

土壤生物化学指标测定土壤脱氢酶(dehydrogenase)活性测定（比色法）（一）分析意义脱氢酶能酶促脱氢反应，它起着氢的中间传递体的作用。

在土壤中，碳水化合物和有机酸的脱氢酶作用比较活跃，他们可以作为氢的工体。

脱氢酶能自基质中析出氢而进行氧化作用。

（二）方法选择与原理Lenhard(1956)最先提出用TTC作为氢的受体生成红色的TF，进行闭塞测定，以溶液的光密度值表示酶活性。

后来对上述的方法做了不同的改进和完善。

用土壤有机质作为氢的供体或用葡萄糖做氢的供体，用生成的TF数量或换算成氢的体积来表示脱氢酶的活性。

（三）试剂配制1、0.5%TTC溶液2、甲苯3、Tris-HCl缓冲液Ph7.6：0.1M三羟甲基氨基甲烷（12.114g/L）50ml 与0.1MHCl38.5ml混合后，用水稀释至100ml。

4、硫化钠5、0.1mol/L葡萄糖溶液。

（四）实验步骤1、标准曲线的绘制：称取相当于50mg纯品量的已烘干的TTC于50 ml比色管中，定容，制成1 mg/L的母液。

分别向6支50ml比色管中依次注入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL mg/ml标准TTC溶液，用蒸馏水定容至5mL。

在试管中依次加入2 mL Tris-HCl缓冲液，2mL蒸馏水，2mL TTC系列溶液，对照组不加TTC，再各加入1 g低亚硫酸钠，摇匀，待溶液充分显色后，各管准确加入5ml甲苯，振荡萃取2min，取上层有机溶液在紫外分光光度计492nm处闭塞绘制标准曲线。

2、操作过程：取1g新鲜土壤，置于50ml 比色管中，依次加入4mlTris-HCl盐酸缓冲液、2ml 0.1mol/L葡萄糖溶液、1ml 0.5% TTC溶液,震荡均匀，离心（4000转/分）5分钟后，将甲苯提取液在分光光度计492 nm处闭塞测定。

同时设无土壤和无TTC的对照（以蒸馏水替代）。

3、结果计算：脱氢酶活性=TF含量/0.5g —土壤含水量脱氢酶活性，以24h后1g干土中TF的生成量表示。