细菌脱氢酶活性的测定

乳酸脱氢酶（LDH ）活性检测试剂盒说明书可见分光光度法货号：BC0680规格：50T/24S产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

试剂名称规格保存条件提取液液体30 mL×1瓶4℃保存试剂一液体25 mL×1瓶4℃保存试剂二粉剂×1支-20℃保存试剂三液体25 mL×1瓶4℃保存试剂四液体60 mL×1瓶4℃保存标准品液体1 mL×1支4℃保存溶液的配制：1、试剂二：临用时加入1.3 mL 双蒸水充分溶解备用，配好后可分装成小管-20℃保存，可保存两周，禁止反复冻融；2、标准品：2 μmol/mL 丙酮酸钠溶液。

产品说明：LDH （EC 1.1.1.27）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是糖酵解途径的末端酶，催化丙酮酸与乳酸之间的可逆反应，伴随着NAD +/NADH 之间互变。

LDH 催化NAD +氧化乳酸生成丙酮酸，丙酮酸进一步与2,4-二硝基苯肼作用生成丙酮酸二硝基苯腙，在碱性溶液中显棕红色，颜色深浅与丙酮酸浓度成正比。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。

如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：可见分光光度计、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清，按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL ）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20%或200W ，超声3s ，间隔10s ，重复30次）；8000g 4℃离心10min ，取上清，置冰上待测。

2、组织：按照组织质量（g ）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g 组织，加入1mL 提取液），进行冰浴匀浆。

脱氢酶活性的测定一.实验目的了解活性污泥脱氢酶活性的测定原理及方法二.实验原理活性污泥法对于有机物的降解，实质上是微生物经过一系列的酶的催化作用下的生物氧化还原反应。

参加生物氧化的重要酶为氧化酶和脱氢酶二大类，其中脱氢酶类尤为重要。

其中脱氢酶能使氧化有机物的氢原子活化并传递给特定的受氢体实现石油烃的氧化和转化。

如果脱氢酶活化的氢原子被人为受氢体接受，就可以通过直接测定人为受氢体浓度的变化间接测定脱氢酶的活性，表征生物降解过程中微生物的活性。

因此，脱氢酶的活性可以反应处理体系内活性微生物量以及其对有机物的降解活性，以评价降解性能。

脱氢酶活性测定方法有MB.2H定性分析法和TTC比色法，目前用得较多的为氯化三苯基四氮唑（TTC）比色法。

利用TTC作为人为受氢体，其还原反应方程式如下：无无色的TTC受氢后变成红色的TF（三苯基甲月替），根据红色的深浅，测出相应的光密度（OD值），从而计算TF的生成量，求出脱氢酶的活性。

三.实验设备及药品1．紫外-可见光分光光度计、分析天平、50mL棕色容量瓶、50mL三角瓶、比色皿2．4mg/mL的TTC溶液：取400mg TTC（2，3，5-氯化三苯基四氮唑，分析纯）和2g 葡萄糖(0.1mol/L)分析纯溶于少量蒸馏水中，再稀释到100mL的容量瓶中，贮存于棕色瓶中，一周更换一次。

3. Tris-HCl缓冲液（pH=8.4）：称取 6.037g Tris（三羟甲基氨基甲烷，分析纯），再加入20ml 1mol/L的盐酸，再定容至1L。

4. 10%硫化钠：称取10gNa2S（分析纯），定容到100mL的容量瓶中。

5. 无氧水：0.36g亚硫酸钠定容到100ml容量瓶中。

四.实验步骤1．标准曲线的绘制⑴不同浓度的TTC系列溶液的配置：从TTC溶液中移取1，2，3，4，5，6，7mL放入七个50mL的容量瓶中，定容到50mL。

⑵取7支试管，分别加入2mL Tris-HCl缓冲溶液、2mL无氧水、2mL不同浓度的TTC溶液,第八支为对照组。

脱氢酶活性检测在环境监测中的应用脱氢酶活性检测方法是一种常用于环境监测的生物学方法，其通过测量脱氢酶对底物的催化能力，来间接反映环境中某些特定污染物的浓度和毒性程度。

该方法具有高灵敏度、高选择性、快速、经济和可重复等优点，因此在环境监测中得到广泛应用。

第一，脱氢酶活性检测可用于监测水体中的污染物浓度。

水体中的有机物污染物，如苯、甲苯、二甲苯等可通过脱氢酶催化反应被氧化，从而反映水体中有机物污染物的存在及浓度。

环境中孕育潜在有毒性的有机物污染物，通过脱氢酶活性检测可以实时监测其浓度，从而及时采取措施，避免对水体生态及人类健康产生潜在危害。

第二，脱氢酶活性检测可用于监测土壤中的有毒物质浓度。

某些化学物质经分解产生的有毒物质，如重金属离子，可引起土壤中微生物群落的损伤，从而影响土壤肥力和生态系统的稳定性。

脱氢酶活性检测可通过测量土壤中微生物的脱氢酶活性，来评估土壤中有毒物质的毒性程度。

据此结果，可以采取相应的措施，如修复污染土地，保护生态环境。

脱氢酶活性检测可用于监测空气中的有机污染物浓度。

空气中存在大量的VOCs（挥发性有机化合物），例如苯类、醛类等，这些物质对人体和环境都有潜在危害。

脱氢酶活性检测可检测大气中VOCs的浓度，比传统的气相色谱-质谱联用（GC/MS）方法更快速、灵敏和经济。

脱氢酶活性检测在空气质量监测、工业废气排放等方面具有广阔的应用前景。

脱氢酶活性检测是一种可靠、灵敏的环境监测方法，具有广泛的应用前景。

在水体、土壤和空气等环境中，脱氢酶活性检测能够准确及时地反映污染物的浓度和毒性程度，为环境保护和生态修复提供重要参考依据。

这种方法的广泛应用将有助于建立更加全面和有效的环境监测体系，以保护环境质量和人类健康。

环境微生物实验问题与答案一、光学显微镜的操作及细菌单染色1、为什么油镜的放大倍数比普通物镜大？答：油镜能减少光的折射，进而提高视野的亮度；通过提高显微镜的数值口径增加显微镜的分辨力。

2、数值口径的表达公式？答案：N.A=n ×sin α，n为介质折射率；α为光线最大入射角的半数。

3、显微镜数值口径与分辨力的关系？答案：分辨力是指显微镜能辨别两点之间最小距离的能力，它与光的波长成反比，与数值口径成正比。

4、油镜的使用与普通物镜有何不同？答案：油镜必须借助于光折射率等于或接近于玻璃的试剂，如香柏油等才能使用，而普通物镜则不需要；油镜是由100×物镜与香柏油构成，而普通物镜则限于10×物镜、40×物镜等。

5、使用油镜时应特别注意什么？答案：上下调节镜头时应使用微螺旋，否则容易损坏镜头；应使油镜始终浸泡在香柏油中，否则就不是油镜；使用完毕后，必须用搽镜纸沾取二甲苯等有机溶剂搽去残留的油迹，否则会玷污油镜。

6、单染色的原理是什么？答案：主要基于微生物细胞能与各种染料进行不同程度地结合。

7、单染色过程中，为什么干燥固定？答案：因为通过干燥可以使菌体蛋白变性，细胞质凝固，进而可以使菌体紧密地附着于载玻片表面。

8、单染色过程中，为什么水洗时水流要缓慢地从载玻片上端流下？答案：因为如果水流直接冲洗有菌部位，容易使菌体被冲洗掉。

9、为什么载玻片要完全干燥后，才能使用油镜？答案：因为香柏油与水不相溶，容易造成光线发生折射或散射，一方面无法构成油镜，另一方面也会降低视野的亮度。

二、放线菌形态观察与细菌革兰氏染色1、革兰氏染色的原理是什么？答案：对于G+细菌来说，当用乙醇脱色时，由于肽聚糖含量高，网孔小，再加上脂量低，所以乙醇脱色后，进一步地缩小了网孔，结晶紫-碘复合物无法脱出，第二次用番红染色时无法着色，进而呈紫色；对于G-细菌来说，当用乙醇脱色时，由于肽聚糖含量低，网孔大，再加上脂量高，所以乙醇脱色后，进一步地扩大了网孔，结晶紫-碘复合物被脱出，第二次用番红染色时着色，进而呈红色。

一株铁还原菌的分离及其碳源利用特性研究童磊;李湘凌;吴纪南;袁峰;周涛发【摘要】文章探究从污水处理厂污泥中筛选的一株铁还原菌的生长特性,研究不同碳源对Fe(Ⅲ)还原的影响.结果表明:此株铁还原菌株适宜的生长条件为p H=7、温度为35℃ 、黑暗条件;碳源类型和浓度显著影响菌株的铁还原能力,其最适碳源浓度为1.5 mol/L,以蔗糖、葡萄糖、丙酮酸钠、乙酸钠、乳酸钠为碳源时,其Fe(Ⅲ)还原率依次降低,以蔗糖和葡萄糖为碳源时Fe(Ⅲ)还原率分别为81.0%和57.2%;Fe(Ⅲ)还原过程中脱氢酶活性与Fe(Ⅲ)还原率显著正相关,脱氢酶活性能在一定程度上反映Fe(Ⅲ)还原程度.%An iron-reducing bacteria strain was isolated from municipal sewage sludge .The characteristics of the bacteria strain and the influence of carbon sources on the Fe(Ⅲ) reduction were studied .The results showed that the strain grew best when pH value was 7 and the temperature was 35 ℃ under the darkness condition .The iron reduction ability of the bacteria strain was significantly influenced by the type and the con-centration of carbon source .The optimum concentration of the carbon source was 1.5 mol/L .When sucrose , glucose ,sodium pyruvate ,sodium acetate ,sodium lactate were serviced as carbon sources respectively ,Fe (Ⅲ) reduction rate of the strain reduced in turn .When sucrose and glucose were used as carbon sources ,Fe (Ⅲ) reduction rate of the strain was 81.0% and 57.2% respectively .There was a significant positive correla-tion between the dehydrogenase activity of the strain and Fe(Ⅲ) reduction rate .Dehydrogenase activity could reflect the Fe(Ⅲ) reduction degree .【期刊名称】《合肥工业大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2016(039)004【总页数】7页(P536-542)【关键词】铁还原菌;碳源;脱氢酶活性【作者】童磊;李湘凌;吴纪南;袁峰;周涛发【作者单位】合肥工业大学资源与环境工程学院,安徽合肥 230009;合肥工业大学资源与环境工程学院,安徽合肥 230009;合肥工业大学资源与环境工程学院,安徽合肥 230009;合肥工业大学资源与环境工程学院,安徽合肥 230009;合肥工业大学资源与环境工程学院,安徽合肥 230009【正文语种】中文【中图分类】X172异化铁还原是铁还原菌介导进行的Fe(Ⅲ)还原,该过程广泛地存在于自然界的厌氧环境[1]。

乳酸脱氢酶活力测定注意事项乳酸脱氢酶（LDH）活力测定是一种用于评估细胞损伤或组织损伤的常见实验方法。

以下是进行乳酸脱氢酶活力测定时的一些建议和注意事项：1.样品处理：样品的获取和处理对于测定结果至关重要。

确保样品的采集和处理过程中避免引入细菌、污染物或其他可能影响测定结果的因素。

2.温度控制：乳酸脱氢酶活性受温度影响较大，因此在整个实验过程中要保持恒定的温度。

通常，室温或37摄氏度是常用的温度条件。

3.反应时间：控制反应时间以确保测定的准确性。

一般来说，设定一个适当的反应时间，过短或过长的反应时间都可能影响测定结果。

4.底物浓度：底物（如乳酸）的浓度也会影响乳酸脱氢酶活力的测定。

确保底物的浓度在合适的范围内，并在测定前进行标定。

5.pH值：乳酸脱氢酶活性对pH值敏感，因此保持反应体系的适当pH值是必要的。

使用适当的缓冲液来调整和维持pH。

6.试剂质量：使用高质量的试剂，特别是酶的提取液和底物。

使用过期或质量不佳的试剂可能导致结果不准确。

7.标准曲线：在进行实验之前，制备标准曲线以用于计算未知样品的乳酸脱氢酶活性。

确保标准曲线的准确性和可重复性。

8.控制组：始终包括一个阴性对照组和一个阳性对照组，以确保测定的准确性和可靠性。

9.避免光照：避免样品或试剂受到直接阳光或强光的照射，因为光照可能影响测定结果。

10.记录实验条件：记录实验的所有条件，包括温度、时间、底物浓度、pH 值等。

这有助于排除实验中的潜在变量，并提高结果的可重复性。

在进行乳酸脱氢酶活力测定时，严格遵循实验方法、仪器使用说明和相关安全操作规程，以确保实验的准确性和可靠性。

在有需要的情况下，最好由经验丰富的研究人员进行实验，或在需要时咨询相关专业人士的建议。

脱氢酶活性测定实验报告TTC标准曲线的绘制：TTC浓度(ug/mL) 8 16 24 32 40 吸光值A 0.041 0.186 0.298 0.312 0.456土壤脱氢酶的吸光值记录：编号 1 2 3 平均吸光值A 0.145 0.167 0.186 0.166由标准曲线可得相应TTC浓度为：2.0314 ug/mL则土壤脱氢酶活性= ABC= 2.0314*18*1= 36.5652式中：A为查出的TTC浓度(ug/mL)；B为培养时间校正值(18h);C为比色时稀释倍数(1)。

思考题：1.影响脱氢酶活性的因素有哪些？答：pH：每种酶都有最适pH，在此pH下，酶活性最大；温度：酶活性随着温度的升高而增加，在最适温度时达到最高值，然后开始下降；激活剂：可以促进酶活性；抑制剂：会使酶活性降低；还有内因如底物浓度和酶浓度。

2.已知乳酸脱氢酶（LDH）在NAD+的递氢作用下，使乳酸脱氢生成丙酮酸。

丙酮酸在碱性溶液中与2,4-二硝基苯肼生成2,4-二硝基苯腙使溶液呈蓝色。

颜色的深浅与丙酮酸浓度成正比。

请设计一个测定动物肝脏乳酸脱氢酶活性的实验。

答：1，校正曲线的制作：（1）按下表操作：加入物(ml) B 1 2 3 4 5丙酮酸标准液0 0.025 0.05 0.1 0.15 0.2底物缓冲液0.5 0.475 0.45 0.4 0.35 0.3去离子水0.11 0.11 0.11 0.11 0.11 0.11二硝基苯肼0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5NaOH 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0相当于金氏单位0 125 250 500 750 1000（2）37度水浴15分钟，室温放置5min后，于440nm波长处比色，比色杯光径为1.0cm，用B管调零，读取各管吸光度。

以吸光度值为纵坐标，相应的酶活性单位为横坐标绘制校正曲线。

2，酶活性的测定：（1）加入物(ml) 测定管对照管血清0.01 0.01NAD＋底物缓冲液0.5 0.5（37度水浴5min）NAD＋溶液0.1 －（37度水浴15min）2,4二硝基苯肼0.5 0.5NAD＋溶液－0.1（37度水浴15分钟）0.4mol/L溶液 5.0 5.0（2）混匀，室温放置5min后，于440nm波长处比色，比色杯光径为1.0cm，用蒸馏水调零，读取各管吸光度。