脱氢酶测定方法

1. 了解脱氢酶的特性和作用机制。

2. 掌握脱氢酶测定实验的方法和原理。

3. 学会使用分光光度计进行脱氢酶活性的测定。

二、实验原理脱氢酶是一类催化氧化还原反应的酶，可以将底物中的氢原子转移给辅酶，从而实现底物的氧化。

本实验以乳酸脱氢酶（LDH）为例，通过测定其在特定条件下催化乳酸氧化为丙酮酸的反应速率，来间接反映LDH的活性。

三、实验材料1. 乳酸脱氢酶（LDH）提取液2. 乳酸（底物）3. 丙酮酸（产物）4. 磷酸缓冲液5. 分光光度计6. 移液器7. 试管8. 秒表四、实验方法1. 准备工作：将LDH提取液、乳酸、丙酮酸、磷酸缓冲液等实验材料分别置于相应的试管中，调节pH至7.4。

2. 设置对照组：取一定量的磷酸缓冲液，加入LDH提取液，作为对照组。

3. 设置实验组：取一定量的乳酸，加入LDH提取液，作为实验组。

4. 测定吸光度：将对照组和实验组的试管放入分光光度计中，在特定波长下测定吸光度。

5. 计算反应速率：根据吸光度变化，计算LDH的活性。

1. 准备工作：将LDH提取液、乳酸、丙酮酸、磷酸缓冲液等实验材料分别置于相应的试管中，调节pH至7.4。

2. 设置对照组：取1ml磷酸缓冲液，加入1ml LDH提取液，混匀后放入分光光度计中，在波长340nm处测定吸光度，记录为A0。

3. 设置实验组：取1ml乳酸，加入1ml LDH提取液，混匀后放入分光光度计中，在波长340nm处测定吸光度，记录为A1。

4. 加入丙酮酸：向实验组中加入1ml丙酮酸，混匀后立即放入分光光度计中，在波长340nm处测定吸光度，记录为A2。

5. 计算反应速率：计算A1与A0的差值（ΔA），ΔA表示在反应过程中吸光度的变化。

根据反应速率公式：反应速率= ΔA / Δt其中，Δt为反应时间，本实验中Δt为1分钟。

六、实验结果与分析1. 通过实验，成功测定了LDH的活性，得到实验数据如下：A0 = 0.3A1 = 0.6A2 = 0.92. 计算反应速率：ΔA = A1 - A0 = 0.6 - 0.3 = 0.3Δt = 1分钟反应速率= ΔA / Δt = 0.3 / 1 = 0.33. 结果分析：根据实验结果，LDH在1分钟内催化乳酸氧化为丙酮酸的反应速率为0.3。

脱氢酶活性的测定一.实验目的了解活性污泥脱氢酶活性的测定原理及方法二.实验原理活性污泥法对于有机物的降解，实质上是微生物经过一系列的酶的催化作用下的生物氧化还原反应。

参加生物氧化的重要酶为氧化酶和脱氢酶二大类，其中脱氢酶类尤为重要。

其中脱氢酶能使氧化有机物的氢原子活化并传递给特定的受氢体实现石油烃的氧化和转化。

如果脱氢酶活化的氢原子被人为受氢体接受，就可以通过直接测定人为受氢体浓度的变化间接测定脱氢酶的活性，表征生物降解过程中微生物的活性。

因此，脱氢酶的活性可以反应处理体系内活性微生物量以及其对有机物的降解活性，以评价降解性能。

脱氢酶活性测定方法有MB.2H定性分析法和TTC比色法，目前用得较多的为氯化三苯基四氮唑（TTC）比色法。

利用TTC作为人为受氢体，其还原反应方程式如下：无无色的TTC受氢后变成红色的TF（三苯基甲月替），根据红色的深浅，测出相应的光密度（OD值），从而计算TF的生成量，求出脱氢酶的活性。

三.实验设备及药品1．紫外-可见光分光光度计、分析天平、50mL棕色容量瓶、50mL三角瓶、比色皿2．4mg/mL的TTC溶液：取400mg TTC（2，3，5-氯化三苯基四氮唑，分析纯）和2g 葡萄糖(0.1mol/L)分析纯溶于少量蒸馏水中，再稀释到100mL的容量瓶中，贮存于棕色瓶中，一周更换一次。

3. Tris-HCl缓冲液（pH=8.4）：称取 6.037g Tris（三羟甲基氨基甲烷，分析纯），再加入20ml 1mol/L的盐酸，再定容至1L。

4. 10%硫化钠：称取10gNa2S（分析纯），定容到100mL的容量瓶中。

5. 无氧水：0.36g亚硫酸钠定容到100ml容量瓶中。

四.实验步骤1．标准曲线的绘制⑴不同浓度的TTC系列溶液的配置：从TTC溶液中移取1，2，3，4，5，6，7mL放入七个50mL的容量瓶中，定容到50mL。

⑵取7支试管，分别加入2mL Tris-HCl缓冲溶液、2mL无氧水、2mL不同浓度的TTC溶液,第八支为对照组。

细菌休止细胞的制备及其脱氢酶活性的测定摘要休止细胞又叫静息细胞，在研究微生物生理生化及新陈代谢中应用广泛，这种细胞虽然处于休眠状态，不进行生长繁殖，但仍含有各种酶系，具有氧化和发酵能力，是测定细菌脱氢酶活性的良好材料。

本实验用E.coli cVcc249菌株作为实验材料，制备其休止细胞，再加入四种同样浓度的TCA循环中的底物：乙酸钠、琥珀酸钠、α-酮戊二酸及柠檬酸钠，比较和分析在相同浓度、不同底物的情况下，细菌脱氢酶活性的大小；并对其中的α-酮戊二酸和柠檬酸钠两种底物配以浓度梯度，研究其分别与细菌脱氢酶活性之间的相互影响。

在本次实验中，所采用的测定细菌脱氢酶活性的方法是噻唑盐还原法，噻唑盐宜与反应生成的还原氢反应生成水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒，可溶解于二甲亚砜中，再根据其颜色变化的深浅，用分光光度计测其OD510nm值，即可表示细菌脱氢酶的活性。

AbstractThe resting cells, which are widely used in the study of microbial biochemistry and metabolism, are a kind of cells that are dormant ,not growth or reproduction. Those cells still contains a variety of enzymes as well as the capacity of oxidation and fermentation, thus make them good material of determining dehydrogenases activity. The experimental strain is E.coli cVcc249.Firstly,preparing the resting cells of the stain, then adding the four substates of TCA cycle with the same concentration, the four substates are: sodium acetate, sodium succinate, α-ketoglutaric acid and sodium citrate. These allow us to compare and analysis the bacterial dehydrogenase activity in those four same concentration substates. Secondly, making concentration gradient of α-ketoglutaric acid and sodium citrate perspectively, study their functions with bacterial dehydrogenase activity. In this experiment, we us the method of MTT reduction to determine the activity of dehydrogenase. The MTT can be reduced by the bacterial dehydrogenase, and the product is Formazan, which is a water-insoluble and blue-purple crystalline. We can solute Formazan in DMSO, then the samples were checked by measuring spectrophotometrically at 510 nm, which can represent the activity of bacterial dehydrogenase.关键词休止细胞脱氢酶活性α-酮戊二酸柠檬酸钠噻唑盐1.引言1.1 休止细胞1.1.1 休止细胞的定义及特性休止细胞又称静息细胞，是把培养液中各种营养物质和生长因子洗去后悬浮在生理盐水中培养一段时间，以消耗内源营养物质，呈饥饿状态的细胞，在研究微生物的生理生化及新陈代谢中有广泛的应用。

乳酸脱氢酶(LDH)测定操作规程（SOP）一、用途本产品用于体外定量测定血清、血浆样品中乳酸脱氢酶（LDH）的活性。

二、临床意义（一）概述乳酸脱氢酶（LDH），又称L－乳酸－NAD+氧化还原酶，酶编号为EC 1.1.1.27，分子量约为34000道尔顿。

LDH是一种细胞质酶，存在于所有组织细胞中。

由于组织中的LDH 浓度比血浆高约500倍，即使组织的轻微损伤也将导致血清中活性的明显增高，在肝、心肌、骨骼肌和肾中发现高度组织特异性活性的酶。

（二）临床意义乳酸脱氢酶增高主要见于心肌梗死、肝炎、肺梗死、某些恶性肿瘤、白血病等。

某些肿瘤转移所致的胸腹水中乳酸脱氢酶活力往往升高。

目前，常用于心肌梗死、肝病和某些恶性肿瘤的辅助诊断。

（三）医学决定水平170U／L:此值在参考范围以内，等于或低于此值可排除许多与LDH升高有关的疾病，而考虑其他的诊断。

此值还可作为病人自身的对照，用来与以前或将来的测定值作比较。

300U／L：高于此水平时，应考虑到可能引起LDH升高的各种疾病，如心肌梗塞、肝病变、传染性单核细胞增多症、进行性肌营养不良等。

因此，应作其他各种试验，以作出明确诊断。

血清溶血可使测定值增高，应予以注意。

500U／L：高于此值，常见于巨幼细胞性溶血，急性白血病、慢性粒细胞性白血病、转移癌和肝昏迷等，此时应作其他多种检测来作出正确诊断。

三、检验原理L-乳酸＋NAD+−−LDH丙酮酸＋NADH＋H+−→NADH的生成速率与样品中LDH活性成正比，在340nm波长处，通过连续监测吸光度的上升速率(△A／min)，即可计算出样品中LDH的活性。

四、样品血液样品原则上采集晨起空腹血（禁食12小时）；患者处于平静、休息状态，减少患者由于运动、饮食带来的影响；静脉采血时患者应取坐位或卧位；止血带使用后1分钟内采血，回血后立即松开；正确使用抗凝剂；防止溶血；防止过失性采样。

样品运送过程中应防止过度振荡、防止样品容器的破损、防止样品被污染、防止样品及唯一性标志的丢失和混淆，防止样品对环境的污染、水分蒸发。

土壤脱氢酶测定方法土壤脱氢酶可是个很有趣的研究对象呢。

那怎么测定它呢？一种常见的方法是采用三苯基四氮唑氯化物（TTC）法。

这就像是一场土壤里的小魔术。

我们先把含有脱氢酶的土壤样品取出来，然后加入TTC溶液。

脱氢酶在土壤里就像一个个小工匠，它会把TTC变成一种红色的东西，叫三苯基甲臜（TF）。

这个过程就像是小工匠把普通的材料加工成了漂亮的工艺品。

接下来呀，就要把这个反应后的土壤溶液进行处理啦。

我们得想办法把TF从土壤里提取出来呢。

这时候就需要用到有机溶剂，比如说丙酮之类的。

把丙酮加进去，像给土壤洗个特别的澡，让TF乖乖地跑到丙酮里。

然后呢，我们就可以用分光光度计这个神奇的小仪器来测量啦。

把含有TF的丙酮溶液放到分光光度计里，它就能告诉我们TF的含量。

因为TF的含量和土壤脱氢酶的活性是有关系的，就像小工匠的作品数量能反映出小工匠的工作能力一样。

还有一种方法是碘硝基四氮唑蓝（INT）法。

这个方法也很有意思哦。

同样先把土壤样品准备好，再加入INT溶液。

土壤里的脱氢酶就会对INT动手脚啦，把它变成一种有色的产物。

然后也是通过提取这个有色产物，再用分光光度计去测量。

不过在做这些测定的时候，要特别小心呢。

土壤样品的采集就很有讲究，要确保采集的样品能代表要研究的那片土壤。

就像挑苹果，要挑到能代表一整筐苹果好坏的那个。

而且在整个测定过程中，温度、pH值这些条件都要控制好。

如果温度不合适，就像小工匠在寒冷或者炎热的环境里工作，会影响他们的工作效率，也就是脱氢酶的活性测定结果啦。

pH值也是一样的道理，太酸或者太碱，小工匠们也会不开心，测定结果就不准啦。

土壤脱氢酶的测定方法虽然有点小复杂，但就像探索一个神秘的小世界，充满了乐趣呢。

脱氢酶活性测定（一）基本原理利用2，3，5-三苯基四氮唑氯化物（TTC）为基质（氢受体），由于土壤中脱氢酶的作用使之形成红色的TPF，两者在一定范围内呈线性关系，因此，用比色法测定其形成量作为土壤脱氢酶的活性指标。

（二）实验试剂1、酶促反应试剂（1）0.5mol/L三（羟甲基）氨基甲烷-盐酸缓冲液，pH7.6：2mol/L三（羟甲基）氨基甲烷溶液50mL与1mol/L盐酸溶液75mL混合，加蒸馏水定容到200mL。

（2）0.5%TTC溶液：TTC0.5g溶于0.5mol/L三（羟甲基）氨基甲烷-盐酸缓冲液中，定容到100mL。

2、测定试剂（1）甲醇（2）TPF标准溶液：称取TPF30mg,置于100mL容量瓶中，用甲醇定容到100mL，此溶液浓度即为1μg/Ml.再用甲醇稀释该溶液，配制成25、50、75、100、150ng/mL的标准溶液。

（三）操作步骤1）称取通过2mm筛的土样5g于带塞试管（0.7*15.0cm）中，加入TTC溶液5mL，充分混合。

2）同时设置对照，即在试管内加入三（羟甲基）氨基甲烷-盐酸缓冲液5mL 以替代土壤与TTC。

3）将以上试管置暗处30℃保温培养12h后，分次少量地加入甲醇100mL，移入带塞三角瓶中，用振荡机震荡1h，过滤。

4）取滤液用分光光度计（波长485nm）测定其光密度。

以甲醇作为空白。

5）用上述同样方法测定不同浓度TPF标准溶液光密度，在半对数纸上绘制标准曲线。

6）根据减去空白的光密度查标准曲线，即可求出产生的TPF的量，该量（μg/g 干土）即表示脱氢酶活性。

脱氢酶的活性可按下式计算：土壤脱氢酶活性（μg TPF/g干土）=C×V/dwtC：滤液中TPF的量（μg/mL）（由标准曲线查知）；V：滤液的体积（mL）；dwt:烘干土壤重量（g）。

一种活性污泥ttc脱氢酶活性测定方法本发明属于微生物活性测定技术领域，具体涉及一种废水生物处理过程中活性污泥脱氢酶活性的测定方法。

背景技术：脱氢酶属于氧化还原酶类，它参与从有机物到分子氧化的电子得失的整个过程。

脱氢酶活性经常作为评价污泥活性的指标，很大程度上反映了活性污泥中微生物对有机物的代谢能力。

ttc-脱氢酶活性测定法，其原理是利用脱氢酶将氯化三苯基四氮唑(ttc)还原成三苯基甲臜(tf)后在485nm处有特征吸收，从而测定脱氢酶活性。

早期，国内外常在90℃高温条件下萃取生成的tf，但是萃取剂在高温下极易蒸发，破塞而溢，导致测定结果不稳定。

而后众多研究者提出了常温萃取测定法的分析程序，萃取温度通常37℃，效果良好。

在标准曲线制作中，早期使用还原剂连二亚硫酸钠，但生成的tf稳定性极差，其颜色在40分钟后几乎全部消失，连二亚硫酸钠逐渐被硫化钠取代。

酶反应终止剂主要有浓h2so4、甲醛、乙醇和丙酮等试剂，浓h2so4会与污泥培养液和残留细胞反应，出现“茶色现象”，甲醛的酶反应终止效果优于乙醇和丙酮，一般情况下，甲醛的用量为反应液体积的1/10。

在甲醇、乙醇及丙醇等萃取剂中，丙酮的萃取效果最好，有利于萃取颜色的稳定，而且80％的丙酮比纯丙酮萃取效果更好。

活性污泥呈颗粒状，对tf具有很强的吸附能力，加入萃取液并在摇床中振荡提取，仍然有部分tf无法溶解。

酶反应结束，离心分离后去除上清液的过程中，活性污泥易悬浮，造成tf的损失，从而导致结果不准确，无法完全去除上清液。

技术实现要素：本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种方便、可靠、准确的污泥脱氢酶活性测定方法，以克服标准曲线制作过程中硫化钠易氧化，样品测试过程中活性污泥强吸附、易悬浮的特点，从而提高活性污泥脱氢酶活性测定的可操作性和准确性。

本发明为解决背景技术中的技术问题，采用的技术方案是一种活性污泥ttc脱氢酶活性测定方法，包括两个部分：标准曲线制作和样品测定；1)标准曲线制作：标准曲线制作包括酶反应、萃取测试和线性回归三个步骤；(1)酶反应：将ttc储备液稀释成一系列不同浓度ttc使用液，在10ml离心管中依次加入ttc使用液1ml，2mltris-hcl 缓冲液(ph8.0)、1ml去离子水和1ml新配的10％的na2s，漩涡振荡混匀后，37℃下暗处振荡反应30min，180r/min，加入0.5ml的甲醛终止酶反应，漩涡振荡混匀；(2)萃取测试：反应混合液在5000r·min-1下离心5min，用滴管弃去上清液，使液面在1ml刻度线以下，加入5ml丙酮，再滴加去离子水使液面至6ml刻度线，37℃下暗处振荡萃取10min，180r/min，在485nm处读取萃取液吸光度a；(3)线性回归：以ttc浓度为横坐标，tf萃取液的a值为纵坐标作图，即得到ttc-a标准曲线，对标准曲线进行线性回归，即得标准方程：y＝kx-b式中，x为反应体系的ttc浓度(mg·l-1)，y是tf萃取液的a 值；2)样品测定：样品测定包括酶反应、萃取测试和定量分析三个步骤；(1)酶反应：在10ml离心管中依次加入1ml活性污泥样品、2mltris-hcl缓冲液(ph8.0)、1ml去离子水和1ml0.4％ttc溶液；对照组依次加入1ml活性污泥样品、2mltris-hcl缓冲液(ph8.0)、1ml去离子水、0.5ml甲醛溶液后和1ml0.4％ttc溶液；漩涡振荡混匀，37℃下暗处振荡反应30min，180r/min，除对照组以外，加入0.5ml的甲醛终止酶反应，漩涡振荡混匀；(2)萃取测试：反应混合液在5000r·min-1下离心5min，用滴管弃去上清液，使液面在1ml刻度线以下，加入5ml丙酮，再滴加去离子水使液面至6ml刻度线，37℃下暗处振荡萃取10min，180r/min，漩涡振荡一分钟，0.22μm有机滤膜过滤，在485nm处读取萃取液吸光度a；(3)定量分析：通过标准曲线计算tf的生成量式中，ui为ttc-比脱氢酶活性(mgttc·g-1·min-1)，v为萃取剂体积(ml)，k为ttc-a标准曲线的斜率，w为污泥样品的干重(mgmlss)，t为酶促反应时间(min)。