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课程名称：植物生理学及实验指导老师：周启发成绩：__________________ 实验名称：植物组织衰老的指标测定实验类型：综合同组学生姓名：朱张世昌一、实验目的和要求（必填）1.掌握可溶性蛋白测定的原理；2.掌握植物组织中丙二醛的测定方法；3.掌握植物组织中超氧物岐化酶（SOD)活性测定方法；4.了解植物衰老的原理。
二、实验内容和原理（必填）（1）可溶性蛋白测定：缓冲液提取后可溶性蛋白溶于上清液中，蛋白质提取液与考马斯亮蓝G-250反应呈蓝色。
在595nm处有最大吸收峰。
（2）丙二醇的测定：MDA在高温、酸性条件下与硫代巴比妥酸(TBA)反应，形成三甲基复合物该复合物最大吸收峰在532nm处;最小吸收峰600nm处消光系数为155 (mM)-1 cm-1（3）超氧物岐化酶（SOD)活性测定原理：四氮唑蓝(NBT)光照还原的分光光度法：核黄素受光照产生的O2.-能将NBT还原为蓝色的甲腙，甲腙在560nm波长有最大吸收,而SOD能清除O2.-,抑制甲腙的产生使吸收减小。
通过分光光度检测SOD对O2.-的抑制率,可以表征出SOD含量。
三、主要仪器设备（必填）材料：不同叶龄的同种植物叶片试剂：磷酸缓冲溶液，考马斯亮蓝，TBA与TCA混合液、NBT反应液设备：分光光度计，高速离心器四、操作方法和实验步骤（1）可溶性蛋白测定：称叶龄差异明显的叶片各0.5g ，加入5ml 磷酸缓冲液（50mmol，pH值为7.8）及少量石英砂，于冰浴中研磨提取，匀浆液以10000g 离心力作用下（4度）离心10min，其上清液即为蛋白提取液。
取40μL蛋白提取液和160μL磷酸缓冲液于玻璃试管中，加入4.8ml考马斯亮蓝溶液，混匀后放置2min，用10mm厚的比色杯在595nm下比色读取OD值。
对照为空白的磷酸缓冲液加上4.8ml考马斯亮蓝溶液。
（2）丙二醇的测定：取上清液1.0ml于7ml离心管中，加TBA与TCA混合液4.0ml，92ºC水浴保温30min空白管：1mL Pi-buffer +TBA与TCA混合液4.0ml （92ºC水浴30min）比色，冷却后，平衡，离心5min;5000g，测定A532, A450和A600。
生物必修一细胞的衰老知识点
生物必修一细胞的衰老知识点包括以下几个方面：
1. 细胞衰老的定义：细胞衰老是指细胞功能逐渐减弱，并最终失去分裂能力的过程。
2. 细胞衰老的原因：细胞衰老可能是由多种因素引起的，包括遗传因素、环境因素、
氧化应激等。
其中，最主要的原因是端粒缩短和DNA损伤。
3. 端粒缩短：端粒是染色体末端的重复DNA序列，而人类细胞的DNA复制过程中，
由于末端无法完全被复制，导致每次细胞分裂时，端粒都会缩短一点。
当端粒缩短到
一定长度时，细胞无法继续分裂，从而发生衰老。
4. DNA损伤：DNA损伤是指DNA链上的碱基序列发生改变，包括突变、损伤和修复
过程中的错误等。
DNA损伤可能由内外因素引起，如紫外线、离子辐射、化学物质等。
未修复的DNA损伤会导致细胞衰老和突变，并可能引发癌症等疾病。
5. 细胞衰老的影响：细胞衰老会导致细胞功能下降，包括代谢能力减弱、分泌功能减退、蛋白质合成降低等。
此外，细胞衰老还与多种疾病的发生和发展密切相关，如心
血管疾病、癌症、神经退行性疾病等。
6. 延缓细胞衰老的方法：尽管细胞衰老是一个不可避免的过程，但可以通过一些方法
来延缓细胞衰老。
如保持健康的生活方式，包括均衡饮食、适量运动、充足休息等；
减少DNA损伤的可能性，如避免暴露在紫外线和有害化学物质中；保护端粒的长度和稳定性，如维持端粒酶（telomerase）活性；以及使用抗氧化剂等。
细胞衰老是一个复杂的过程，还有许多相关的研究课题，上述知识点只是对细胞衰老
的基本概念进行了介绍。
你是否衰老了，请用以下标准来测量你是否衰老了，请用以下标准来测量在日常生活中，人们总是把中年时期看作是身强力壮、精力充沛的时期，认为中年人的生理功能发育成熟。
对外界一些不良刺激抵抗力强，所以，许多人对儿童和老人的健康比较关心，而对中年的保健却不大重视。
中年人自身对一些慢性疾病多采取忍耐、迁就，抱无所谓的态度。
其实，这都是不妥当的。
从保健角度讲，这与无病早防，有病早治的原则是相违背的，也不符合中年时期的生理变化特征，对中年人的健康是极为不利的。
人类生命的机体在生长发育成熟后。
各种生理功能趋向稳定，但这种稳定是相对的，随着时间的推移，机体各种生理功能在起着各种变化，只是变化的程度不同，速度有快有慢，有迟有早罢了。
中年是一个跨越近30年的生活阶段。
在这过程中，机体的生理功能经历了发育成熟、旺盛强壮(35岁以后)，相对稳定平衡(40岁左右)及功能减退逐渐衰老(45岁以后)三个不同的阶段。
处于不同阶段的人，虽然都可称为中年，但各自的生理功能、心理欲望、所担负的社会家庭责任及社会生活的经历可能会有很大的差别。
因此，我们在研究中年人疾病时，不能脱离上述特点。
中老年时期机体生理功能的变化特点有如下几个方面：1.内分泌的变化健康管理专家说：人到中年，机体各种生理功能逐渐出现衰老的迹象，最先是内分泌的改变。
首先生长激素停止分泌，肾上腺皮质激素的降解率减慢，血液的浓度相对的升高，通过反馈机制来抑制下丘脑垂体释放ACTH以调节血中皮质醇的水平。
其次是性激素的变化。
近年的一些研究结果表明，在进入老年以前，性激素已出现明显变化的过渡时期，据报告：正常男性激素(T)在青春期最高，平均值为65mmol/h，从40岁开始下降，59岁已下降到正常的l0～15%，以后稳定在此低水平，但80岁时仍保留有30%左右，可见这种变化在40岁后最为明显。
健康管理专家说：祖国医学早在《黄帝内经》中就有较为精确的论述，并和上述资料是一致的。
认为妇女衰老始于35岁，“35岁任脉衰，面始焦发始堕，49岁任脉虚。
细胞衰老标志物及检测方法1. Telomeres: 在细胞分裂过程中，染色体末端的DNA重复序列，逐渐变短。
使用末端限制性片段长度多态性（TRFLP）和荧光原位杂交（FISH）等技术可以检测telomeres的长度。
2. 蛋白质修饰: 蛋白质修饰受到氧化应激、甘糖化和甲基化等生物化学过程的影响。
采用Western blotting等技术可以检测蛋白质修饰的变化。
3. 染色质重组: 细胞老化会导致染色质结构的改变。
采用荧光原位杂交（FISH）和全基因组测序等方法可以检测染色质重组的程度。
4. DNA损伤修复: 细胞老化会影响DNA损伤修复能力。
通过单细胞凝胶电泳（comet assay）和免疫组化分析（immunohistochemistry）等方法可以检测DNA损伤和修复的情况。
5. 胰岛素抵抗: 细胞老化和胰岛素抵抗之间存在相互关系。
通过胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）和葡萄糖耐量试验（OGTT）等方法可以检测胰岛素抵抗的程度。
6. 细胞凋亡: 细胞老化会导致细胞凋亡的增加。
使用DNA laddering和免疫组化技术可以检测细胞凋亡的发生。
7. 氧化应激指标: 细胞内氧化应激的程度与细胞老化密切相关。
可通过测量过氧化物酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GPx）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）等指标来评估氧化应激的水平。
8. 端粒酶活性: 端粒酶对端粒的修复和维持起着关键作用。
通过荧光原位酶活性测定（TRAP）和端粒酶逆转录酶定量PCR等方法可以检测端粒酶活性。
9. 甘糖化终产物: 甘糖化终产物的积累是细胞老化的标志之一。
可以使用高性能液相色谱（HPLC）和质谱分析等方法检测甘糖化终产物的水平。
10. 炎症标志物: 细胞老化伴随着炎症反应的增加。
通过检测白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和C-反应蛋白等标志物的水平可以评估炎症的程度。
衡量衰老的标准是什么胡德祥既然按日历计算的实际年龄大小不足以衡量衰老，哪衡量衰老的标准究竟是什么呢？目前，科学家们制定了生理和心理年龄的测量方法，我们可以通过这些方法来衡量自己的衰老程度。
生理年龄的测量生理年龄是指生理学上的年龄，它表示一个人生命活力的高低。
英国科学家日前制订出一套新的健康检测法，可以大致测试出个体的生物学年龄。
测试1：瞳孔大小年纪越大瞳孔越小，但在强光下瞳孔会收缩，因此应在平日的光线下测量瞳孔大小。
得分：4毫米30岁，2毫米60岁。
测试2：大脑活性由100开始倒数到零，每次隔7个数字(100,93,86......)，并记录所花时间。
得分：少于20秒 40岁以下，20-25秒40-60岁。
测试3：眼角膜环在镜子中观察自己的眼球，多数人会发现角膜会围着一条白色的曲线，曲线越长，说明体的胆固醇越高。
如果生理年龄有80岁，就会发现一个完整的角膜环。
测试4：皮肤弹性捏着手背皮肤1分钟，然后放松，留意皮肤回复平坦状态的时间。
皮肤越老，需要的复原时间就越长。
得分：少于1秒20岁以下，1-2秒20-30岁，3-4秒30-40岁，5-10秒40-50岁，11-30秒50-60岁，30-45秒60-70岁。
测试5：反射动作测试者将一把45厘米长的尺子垂直拎起，使其下端与被测者的手处于同一水平上。
测试者松手使尺子自由降落，记录被测者接住尺子时已下落的距离，年纪越小则尺子下落距离越少。
得分：少于14厘米20岁以下，14-24厘米20-30岁，24-29厘米30-40岁，29-35厘米40-50岁，35-40厘米50-60岁。
测试6：平衡将右腿弯曲成45度，用左脚站立，双手放在臀部，闭上眼睛，记录失去平衡右脚落地的时间。
这样做3次，每次相隔数分钟，计算平均时间。
得分：60-69秒30-40岁，50-59秒40-50岁，40-49秒50-60岁，30-39秒60-70岁，20-29秒70-80岁。
心理年龄的测量心理年龄反映着某人的心理健康状态，可表达心理活动的发育、成长与老化的程度。
衰老的生物学标志3马 宏 张宗玉 童坦君(北京大学医学部生物化学与分子生物学系,北京100083)摘要 目前制约哺乳动物衰老研究的一个重要因素就是缺少可靠、易测的评估生物学年龄的衰老标志,本文论述了八项可作为衰老生物学标志的指标及其检测方法,它们是成纤维细胞的体外增殖能力、DNA损伤修复能力、线粒体DNA片段缺失、DNA甲基化水平、端粒的长度、衰老相关β2半乳糖苷酶活性、晚期糖基化终产物水平、基因表达谱。
关键词 生物学标志;复制衰老;生物体衰老;细胞增殖学科分类号 Q255;R592 人口老化是本世纪人类面临的一个主要难题,为了有效地延缓衰老,就必须在分子水平了解衰老的机制。
目前,制约哺乳动物衰老研究的一个重要因素就是缺少可靠、易测的评估生物学年龄的标志。
美国亚利桑大学Mooradin曾把衰老生物学标志概括为主要标准和辅助标准。
主要标准是(1)该标志与年龄有定量关系,相关性愈密切,灵敏度愈高;(2)该标志不因疾病而改变;(3)该标志不因代谢或营养状况的改变而改变;(4)能影响衰老进程的因素亦能影响该标志;(5)永生化的细胞不存在该标志的变化。
目前,在细胞水平,分子水平发现一些指标,可作为衰老生物学标志,但尚不能满足上述所有判断标准。
现概括如下:一、成纤维细胞的体外增殖能力1965年,Hayflick发现人二倍体成纤维细胞在体外培养的寿命有限,随体外培养所传代数的增加,细胞的增殖能力逐渐丧失,且发现胚胎的成纤维细胞增殖能力强于成人的成纤维细胞,基于这些实验, Hayflick提出细胞的衰老参与生物体衰老的整体进程,这就是衰老的细胞假说。
根据细胞的衰老假说,成纤维细胞体外增殖能力是可靠的估算供者衰老程度的指标。
1970年,Martin等取不同年龄人皮肤成纤维细胞体外培养发现,细胞的复制寿限与供者的年龄呈负相关,供者年龄每增加一岁,其细胞的体外复制寿限降低0.2代,人二倍体成纤维细胞体外复制寿限约为60代,由此推算人类的最高寿限约为120岁,这与实际情况相符。
一种人体衰老生物学标志的“可干预性”分析
卫生研究2000年第2期第29卷短篇报道
作者：陈献文宋其林李侠高本
单位：陈献文（江苏省江阴市卫生防疫站，江阴214400）；高本（江苏省江阴市卫生防疫站，江阴214400）；宋其林（中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所）；李侠（Medical
Center，Vanderbilt University，USA）文章编号：1000-8020(2000)02-0127-01
衰老生物学标志是根据日历年龄来测定一定功能年龄的手段，是确定衰老速度的方法，是延缓衰老药物疗效的标准，是论证健在型衰老的依据［1］。
增龄变化、多元组合以及流行病学意义并不能说明指标系作为衰老生物标志的成立，它还必须具有可变性。
1材料与方法
1.1受试者
自愿受试者230人，年龄均在50岁以上，随机分为实验组和对照组，实验期为3个月。
实验结束时共收集217例个案，其中实验组113例，对照组104例，两组间性别及年龄构成均无统计学差异。
整个实验期间，实验组给予维生素C片剂，每日2次，1片／次(100mg)，对照组未作处理。
1.2方法
心电图ST段的变化情况可以反映心肌的供血及能量代谢的变化；视觉运动反应时可以代表神经传导及反应的敏感程度；而甲皱微循环作为一个反映机体脏器供血情况的“窗口”，在许多老年性疾病的诊断中有一定参考价值。
本研究进行常规心电图描记，以Ⅰ、Ⅱ及Ⅴ5导联ST段时值均数作为分析的依据。
视觉运动反应时值的测定使用北京电子所生产的同步运动计时器，连续测定2次，取均数作为实际的反应时值。
甲皱微循环使用徐州光学仪器总厂生产的微循环显微仪，用甲皱微循环总积分作为甲皱微循环综合定量的评价方法［2］。
将实验前后的全部案例的3项指标代入所立的衰老程度的判别方程中［3］，就可以对案例实现不同衰老程度的判别。
2结果与分析
利用衰老生物标志的“三维”表示方法，可以实现对不同衰老程度的定量判别，而此种衰老程度又应在一定干预措施下发生改变。
表1所列即为200mg/d维生素C干预3个月前后，实验组与对照组不同衰老程度组成的变化情况。
实验组维生素C干预前后相比，有20.4%的案例变为更加“年轻”的类型，有9.7%变为更为“衰老”的类型。
“好转”者较“恶化者”多出1倍有余。
而对照组的情况相反，实验前、后相比，有5.8%的案例变为更加“年轻”的类型，而变为更“衰老”的为9.6%，“恶化”者多出“好转”者将近1倍。
表1干预试验结果(1)
注：(1)初、中、高表示衰老程度，即初衰老、中衰老和高衰老
表2干预试验结果
实验组与对照组相比，“好转”率高出3倍之多，“恶化”率相同，2组之间差异极为显著，统计结果见表2。
维生素C的干预结果证明了所建立的衰老生物标志的可变性。
3讨论
心电图ST段时值、视觉运动反应时值以及甲皱微循环总积分都伴随增龄而延长，构成了作为衰老生物标志的基础。
这3项指标在人群中都呈现正偏态分布，且它们之间不存在可以观察到的相关关系，不可以相互取代。
提示用“三维指标系”表示和划分变衰老的程度，在理论上是合理的、可行的。
三维指标具有可操作性和实用性，利用此种方法发现影响衰老程度的危险因素，在理论上合于逻辑而可以解释。
衰老程度生物标志的一项基本要求是可变性，在一定因素的干预下可以改变，否则是无价值的“死标志”。
维生素C是天然食物中的一种营养成分，在生命活动的氧化、还原反应过程中发挥重要作用，具有解毒功能，能刺激肝脏微粒体细胞色素C的生物合成，降低许多致癌物质的活性。
增强免疫功能，降低过氧化脂质以及降低血清胆固醇，并且具有保护心
肌的作用，是许多抗衰老复方制剂中的有效成份［4］。
作者的直接目的是观察所建立的衰老生物标志的可变性，至于维生素C是否真正可以“延年益寿”，则不是这样简单试验可以回答的。
通过为期3个月的维生素C干预试验，证明所建立的三维衰老生物标志可以在一定干预因素的作用下发生改变。
与对照组相比，服维生素C组的“年轻化”案例所占的比例明显增高，而且此种转化在心电图ST段时值、视觉运动反应时值以及甲皱微循环3个方面皆有所转变。
一方面说明三维指标系的可变性，另一方面说明这种可变性相当灵敏。
作者历时2年时间，用三维的方法构建了人体的衰老生物标志，对不同衰老程度作定量划分，但还遗留几个问题有待于以后研究：
(1)本研究所建立的衰老生物标志中，所应用的3项指标是否是最佳组合?是否还存在和衰老联系更大、且也更具有稳定性、可操作性和可变性的指标?
(2)三维指标系作为衰老生物标志的意义，是否可切实地与健康长寿联系起来，还必须有前赡性的实验观察。
作者简介：陈献文，主管医师
参考文献：
［1］Adelman RC. The Biomarker of Aging. Expt Gerontol，1987，22：227—229
［2］田牛.实用临床微循环学(上册).北京：军事科学出版社，1988，28—37
［3］宋其林，高本，李侠.人体衰老生物学标志三维表示方法的应用.哈尔滨医科大学学报，1996，30(5)：425—427
［4］许士凯.当代抗衰老与养生进展.北京：中国科学技术出版社，1990，89—123
收稿日期：1999-10-11。
