实验三 琼脂免疫电泳实验

免疫电泳实验报告摘要：本实验运用火箭电泳、微量电泳、双向免疫扩散等方法测定抗体的效价。

关键词：抗体效价测定；火箭电泳；微量电泳；双向免疫扩散1 前言免疫电泳(immunoelectrophoresis)的方法很多，主要有单向免疫扩散、双向扩散电泳、对流免疫电泳、微量免疫电泳、免疫火箭电泳、免疫固定电泳等几种方法。

其中比较常用方法有以下三种。

火箭免疫（rocket immunoelectrophoresis），该方法是在琼脂板内掺入适量的抗体，在电场的作用下定量的在含适量抗体的离子琼脂中泳动，当走在前面的抗原遭到琼脂板内的抗体时，形成抗原体复合物而沉淀出来，走在后面的抗原继续在电场的作用下向正极泳动，在向前泳动过程中，遇到了前面抗原所沉淀的抗原抗体复合物，由于抗原的增加造成抗原过量时复合物沉淀溶解，并一同向正极移动而进入新的琼脂板内与未结合的抗体结合，有形成新的抗原抗体复合物沉淀出来，这样不断地沉淀—溶解—再沉淀，直到全部抗原与抗体结合，当比例合适时，可在短时间内出现锥形沉淀线，此沉淀线形似火箭，故称火箭电泳，抗原含量越高所形成的火箭峰愈长，因此依据火箭峰的长度，与标准抗原比较精确地计算抗原的浓。

微量电泳，该方法的原理是不同蛋白质颗粒所带电荷不同，在同一电场中，因泳动速度不同而发生分离，用于抗原、抗体纯度测定，以及临床诊断。

双向免疫扩散（double immunodiffuison）,根据出现沉淀线时抗体的最高稀释度来计算抗体的效价，或者依据沉淀线的出现定性抗原，检测疾病。

2 材料与方法2．1 材料抗体，抗原，巴比妥钠-HCl缓冲液（pH8.6，0.4M），1.5%琼脂糖凝胶，7%醋酸，电泳仪，温箱，玻璃板，打孔器等。

2．2 方法2．2．1 火箭电泳法配制巴比妥钠-HCl缓冲液（pH8.6，0.4M）；制备1.5%琼脂糖凝胶，煮沸至完全溶解；取琼脂糖凝胶约15ml，置55 ºC水浴中降温，并加入抗体200μL，共同孵育；将二者混匀，铺火箭电泳板，放置冷凝倍比稀释抗原抗体；电泳板打孔(6孔)，加入已稀释的抗原(约10 μL/孔)；电泳3~4h，电流：30mA/块，电压：100~120V；待火箭电泳结束，用0.1%氨基黑染色10min，7%醋酸脱色至条带清晰。

实验三琼脂糖凝胶电泳一、实验原理琼脂糖凝胶电泳是分离和纯化DNA 片段的常用技术。

把DNA样品加入到一块包含电解质的多孔支持介质（琼脂糖凝胶）的样品孔中，并置于静电场上。

由于DNA分子的双螺旋骨架两侧带有含负电荷的磷酸根残基，因此在电场中向正极移动。

在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应。

具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，因而可依据DNA分子的大小来使其分离。

凝胶电泳不仅可分离不同分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，而构型不同的DNA分子。

在电泳过程中可以通过示踪染料或相对分子质量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测。

相对分子质量标准参照物相对可以提供一个用于确定DNA片段大小的标准。

在凝胶中加入少量溴化乙锭(ethidium bromide, EB)，其分子可插入DNA的碱基之间，形成一种络合物，在254～365nm波长紫外光照射下，呈桔红色荧光，因此也可对分离的DNA 进行检测。

一般琼脂糖凝胶电泳适用于大小在0.2kb～50kb范围内的DNA片段。

本实验介绍琼脂糖凝胶的制备以及琼脂糖凝胶电泳在DNA片段分离中的应用方法。

二、仪器及试剂1.仪器及耗材：水平电泳槽、电泳仪、凝胶成像分析系统、微波炉、微量移液器、透明胶带、点样板或parafilm、100 ml或250 ml锥形瓶、量筒、吸头等。

2.试剂及配制：50×TAE缓冲液的配制：2 mol/L Tris-乙酸，0.05 mol/L EDTA（pH8.0）配制1000 mlTris 242 g冰乙酸 57.1 ml0.5 mol/L EDTA 100 ml加入600 ml去离子水后搅拌溶解，将溶液定容至1 L后。

高温高压灭菌，室温保存。

1×TAE缓冲液的配制：称量20 ml的50×TAE缓冲液，再加入980 ml的去离子水。

溴化乙啶贮存液：10 mg/ml 溴化乙啶配制：100 ml称取1 g溴化乙啶，置于100 ml烧杯中，加入80 ml去离子水后搅拌溶解。

适用于药典0541第三法琼脂凝胶电泳法下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。

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实验三聚合酶链式反应（PCR）以及琼脂糖凝胶电泳实验目的1.掌握PCR反应的原理及各反应成分的作用；2.熟悉PCR反应程序的设计规则；3.掌握引物的设计原则及其与PCR其他成分的配制方法；4.掌握琼脂糖凝胶电泳的原理及其应用范围；5.熟悉琼脂糖凝胶电泳相关缓冲液的配制方法。

实验原理一．聚合酶链式反应原理在已知待扩增模板全部或部分序列的情况下，依据DNA半保留复制的机理，在含有Mg2+的缓冲溶液中，采用耐热的DNA聚合酶（Taq酶）在特异性引物（分为上游和下游引物）的引导下，通过dNTP为原料，以cDNA或DNA等为模板，在人为控制DNA合成系统（PCR仪）温度调节下，通过变性（95℃）、退火（50-60℃）及延伸（72℃）等3个步骤的循环进行（30-35循环），在体外进行双链DNA变性为单链，单链DNA与特异性引物退火形成局部双链，进而在DNA聚合酶的作用下使引物沿相应模板延伸为特异性引物所限定范围的大量双链DNA的体外合成反应。

本质为体外DNA合成的酶反应。

二．琼脂糖凝胶电泳反应原理琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。

在一定电场强度下偏碱性的缓冲液中（TAE pH8.0或TBE pH7.5-7.8），DNA分子带负电，其迁移速度取决于分子筛效应，在电荷效应与分子筛效应作用下，具有不同的相对分子量及构型的DNA片段泳动速度不同。

DNA 分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。

凝胶电泳不仅可分离不同分子量的DNA，也可以分离分子量相同，但构型不同的DNA分子。

如质粒的三种构型的泳动速率不同：超螺旋闭合环状质粒最快，线型质粒其次，开环质粒最慢。

实验步骤（一）PCR 加样术式在一微量离心管中依次加入下列试剂：水煮裂解后的细菌液4µL10PCR buffer（含MgCl2） 2 µLdNTPs (10mM) 1µL5’引物(10µM) 1µL 20µL3’引物(10µM) 1µLTaq DNA pol. (2U/µL) 1 µL去离子水（补足反应体系）10µL轻弹管底混合（用离心机甩一下）（二）缓冲液组成10×PCR buffer:500 mM KCl100 mM Tris-Cl (pH 8.3)15 mM MgCl2有的会加入硫酸铵(ammonium sulfate)，化学式（NH4)2SO4 ，通过破坏蛋白质在稳定因素（亲水行），而使蛋白析出。

免疫电泳实验免疫电泳是将免疫扩散和电泳相结合的一种免疫学分析技术，由Grabar与Williams于1953年创立。

此项技术由于既有抗原抗体反应的高度特异性，又有电泳分离技术的快速、灵敏和高分辨力，是广泛应用于生物医学领域的一项免疫学基本技术。

【实验原理】将蛋白质抗原在琼脂糖凝胶上进行电泳，样品中不同的抗原成分因所带电荷、分子量及构型不同，电泳迁移率各异，而被分离成肉眼不可见的若干区带。

停止电泳后，在与电泳方向平行的琼脂槽内加入相应抗体进行双向免疫扩散。

分离成区带的各种抗原成分与相应抗体在琼脂中扩散后相遇，在二者比例合适处形成肉眼可见的弧形沉淀线。

根据沉淀线的数量、位置和形状，即可对样品中所含成分的种类及其性质进行分析、鉴定。

【主要试剂与器材】1. 0.05mol/L pH8.6巴比妥缓冲液。

2.12g/L琼脂凝胶用0.05mol/L pH8.6巴比妥缓冲液配制，置4℃冰箱保存备用。

3.小鼠全血清。

4.兔抗鼠血清。

5.电泳仪、电泳槽、37℃温箱。

6.载玻片、吸管、打孔器、毛细滴管、挖槽刀、湿盒、水平台等【实验方法】1．取已溶化的1%离子琼脂倾注于玻片上制成琼脂板。

孔直径3ml2．冷却凝固后，按照模板于挖槽线上下两侧各打孔一个，并分别用微量加样器加入待检血清及1%的溴酚兰各15μl。

3．置电泳槽内，注意电泳标本近孔端连接负极“―”一侧。

并将已浸透缓冲液的滤纸一端覆盖于琼脂板两侧各约0.5mm，另一端浸于电泳液中。

4．接通电源。

电压、电流及时间应视仪器性能而定。

100v恒压电泳。

5．电泳完毕，关闭电源，取出琼脂板。

按模板位置用解剖刀挖横槽，用热的1.2%的琼脂封底，加入抗血清抗体。

6．置湿盒中，于37℃温箱中扩散24小时，观察结果。

【结果】根据沉淀弧的位置及形状，参照免疫球蛋白迁移范围示意图，识别主要Ig。

准备实验材料：1：小鼠全血清（取活鼠，麻醉后心脏去血。

37度放置整夜，第二天吸取上层血清。

分装，将暂时不用的放于-20度冻存，其余放置于4度）兔抗鼠血清-20度冰箱中取出，实验时可能PBS 稀释部分10倍巴比妥缓冲液（先将0.46g 巴比妥置于三角瓶中，加入50ml蒸馏水，加热溶解后加入巴比妥钠2.575g，最后加蒸馏水至250ml）琼脂凝胶：称取1.2g 琼脂粉至250ml三角瓶中，加巴比妥50ml，沸水浴中溶解后，再加上述巴比妥缓冲液50ml,(混匀后置于4度冰箱保存备用)。

免疫琼脂沉淀实验报告本实验旨在通过免疫琼脂糖凝胶电泳（immunoprecipitation assay）方法来检测和分离特定抗原在混合蛋白质溶液中的存在，进而分析其在免疫反应中的重要性和功能。

实验原理：免疫琼脂沉淀是一种通过特异性抗体与靶标抗原结合来实现蛋白质分离的方法。

在实验中，我们首先将样本中的混合蛋白质与特异性抗体结合，形成抗原-抗体复合物。

然后，将这些复合物与琼脂糖糊混合并注射到凝胶电泳槽中进行电泳。

在电泳过程中，抗原-抗体复合物会随着电场的作用向阳极方向迁移，并在凝胶中被固定下来，形成凝胶沉淀带。

通过此方法，我们可以将特定抗原从混合蛋白质中分离出来，并进一步进行鉴定和分析。

实验步骤：1.准备样本：将待检测的混合蛋白质样本制备好，并将其加入含抗原特异性抗体的试管中，形成抗原-抗体复合物。

2.制备琼脂糖糊：制备好5%的琼脂糖糊，加入蛋白质凝胶电泳缓冲液，混合均匀。

3.注射样品：将混合蛋白质样品与琼脂糖糊混合，然后使用注射器将其注入凝胶电泳槽中。

4.进行电泳：设置适当的电场强度和电泳时间，开始电泳。

5.固定凝胶：电泳结束后，将凝胶固定在特定位置，一般使用甲醛等物质进行固定。

6.染色和分析：根据需要，可以使用不同的染色方法对凝胶进行染色，然后使用分析软件或显微镜等设备分析和测量抗原-抗体复合物的大小和相对含量。

实验结果：通过免疫琼脂糖凝胶电泳实验，我们成功地分离和检测到了特定抗原-抗体复合物。

在分析结果中，我们可以观察到在琼脂糖凝胶电泳槽中形成了抗原-抗体复合物的凝胶沉淀带，并且可以通过染色方法对其进行染色，进一步加深对目标蛋白质的分析。

实验讨论和结论：免疫琼脂糖凝胶沉淀实验是一种常用的分离和检测特定抗原的方法。

它通过特异性抗体与抗原的结合，能够实现对目标蛋白质的分离和检测。

该方法相对简单、快速，并且具有较高的特异性和敏感性。

然而，我们在实验过程中需要注意的是选择合适的抗体和琼脂糖凝胶，以确保实验的准确性和可靠性。

实验名称：DNA琼脂糖凝胶电泳实验日期：2023年10月25日实验目的：1. 学习并掌握DNA琼脂糖凝胶电泳的基本原理和操作步骤。

2. 通过电泳分离不同分子量的DNA片段，观察并分析实验结果。

3. 了解DNA分子在琼脂糖凝胶中的迁移规律，并探讨影响迁移速度的因素。

实验原理：DNA琼脂糖凝胶电泳是一种常用的分子生物学技术，用于分离、鉴定和定量DNA片段。

DNA分子在电场中带有负电荷，在琼脂糖凝胶的筛分作用下，根据分子大小和构型不同，迁移速度不同，从而实现分离。

溴化乙锭（EB）作为一种荧光染料，可以嵌入DNA分子中，在紫外光照射下发出橙红色荧光，便于观察DNA片段的位置和大小。

实验材料与仪器：- 仪器：电泳仪、紫外检测仪、水平电泳槽、移液器、一次性手套等。

- 试剂：琼脂糖、EB溶液、Tris-硼酸-EDTA缓冲液、加样缓冲液等。

- 材料：分子量不同的DNA片段。

实验步骤：1. 琼脂糖凝胶的制备：- 称取1g琼脂糖，加入10ml电泳缓冲液，再加入90ml蒸馏水，在电炉上加热溶解，配制成1%琼脂糖凝胶。

- 待凝胶冷却至60-70℃时，加入数滴EB溶液，混匀。

2. DNA样品的制备：- 将DNA片段用Tris-硼酸-EDTA缓冲液稀释至适当浓度。

3. 加样：- 将制备好的琼脂糖凝胶倒入电泳槽中，插入电泳梳子。

- 使用移液器将DNA样品加至凝胶孔中。

4. 电泳：- 将电泳槽放入电泳仪中，设定合适的电压和时间进行电泳。

5. 观察与分析：- 电泳完成后，取出凝胶，用紫外检测仪观察DNA片段的迁移情况。

- 比较不同分子量DNA片段的迁移速度，分析实验结果。

实验结果：- 通过电泳观察到，不同分子量的DNA片段在琼脂糖凝胶中迁移速度不同，分子量越小，迁移速度越快。

- EB染料嵌入DNA分子后，在紫外光照射下呈现橙红色荧光，便于观察DNA片段的位置和大小。

讨论：1. 影响DNA分子迁移速度的因素主要有：分子大小、构型、电场强度、凝胶浓度等。