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免疫沉淀经典的免疫沉淀是可溶性抗原与其抗体产生可见沉淀反应的血清学试验。
后来发展为抗原抗体结合后，用固相化的蛋白A或蛋白G小珠等来吸附分离抗原抗体复合体，达到检测微量抗原或抗体的目的。
（1）收获细胞，加入适量细胞IP裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂）（2）取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液将1μg相应的抗体和10-50 μl protein A/G-beads加入到细胞裂解液，4°C缓慢摇晃孵育过夜；（3）免疫沉淀反应后，在4°C 以3,000 g速度离心5 min,将protein A/G-beads离心至管底；将上清小心吸去，protein A/G-beads用1ml裂解缓冲液洗3-4次；最后加入15μl的2×SDS 加样缓冲液，沸水煮10分钟；（4）SDS-PAGE, Western blotting或进行质谱分析。
免疫沉淀的实验过程比较简单，一般分为3个阶段；①抗原溶液的制备；②裂解物非特异性本底的预处理；③免疫复合物的形成与纯化。
免疫沉淀的第一步是制备抗原溶液。
任何抗原溶液均可作为免疫沉淀的材料来源，但免疫沉淀一般采用细胞或组织制备的裂解物。
裂解物的制备可采用多种方法，其中首选用温和的去污剂如非离子去污剂来裂解细胞。
该方法能溶解细胞膜，破坏蛋白质之间许多微弱的相互作用，释放出大多数细胞内抗原。
更重要的是方法十分温和，不破坏大多数抗原的结构和酶的活力。
如果对抗原结构的完整或活力要求不严，或者抗原结合较为紧密，可以采用比较剧烈的条件来制备裂解物，如在强变性剂的溶液中进行煮沸，然后在免疫沉淀前经过稀释去除变性剂。
一旦细胞裂解液制备好，即可进行预处理。
免疫沉淀一般用于分析抗原的生化特性，因此要求抗原的纯度尽可能高。
抗原和抗体的相互作用与其各自的内在性质有关，故提高该技术信—噪比最容易的方法是降低本底。
如用不与待检抗原结合的非特异性抗体预处理，可以从抗原溶液中除去非特异性结合蛋白，即此法第一次是用非免疫抗体降低本底，第二次再用所研究的抗体，这样进行二次免疫沉淀是达到纯化免疫沉淀物最有效的方法。
免疫共沉淀试验原理及方法免疫共沉淀试验基于抗体-抗原相互作用的原理进行。
首先，通过对目标蛋白质进行免疫反应，用特异性的抗体与目标蛋白质形成抗原-抗体复合物。
然后，将抗体与目标蛋白质的复合物与磷酸化的蛋白质、蛋白质复合物或其他特定蛋白质结合，形成更大的复合物。
最后，通过沉淀这些复合物，从而使复合物分离于整个细胞提取物中。
1.固相免疫共沉淀：该方法使用固相支持材料，如蛋白A或蛋白G结合的琼脂糖磁珠或亲和树脂柱。
首先，将目标蛋白质与特异性抗体免疫反应，然后将抗体与蛋白A或蛋白G结合的支持材料结合。
接下来，将细胞提取物与抗体-蛋白质复合物和支持材料一起孵育。
随后，用磁力或离心将复合物分离，并通过洗涤去除非特异性结合的蛋白质。
最后，用洗涤液溶解复合物，并通过离心或磁力分离来收集目标蛋白质及其相互作用伴侣。
2.液相免疫共沉淀：该方法使用溶液中的特异性抗体与目标蛋白质进行免疫反应。
首先，将目标蛋白质与特异性抗体免疫反应，然后添加蛋白A或蛋白G结合的琼脂糖磁珠或亲和树脂，形成抗体-蛋白质复合物。
接下来，将细胞提取物加入到抗体-蛋白质复合物中，使复合物与目标蛋白质的相互作用伴侣结合。
随后，用磁力或离心将复合物分离，并通过洗涤去除非特异性结合的蛋白质。
最后，用洗涤液溶解复合物，并通过离心或磁力分离来收集目标蛋白质及其相互作用伴侣。
1.直接鉴定特定蛋白质的相互作用伴侣。
2.可以识别特定蛋白质的翻译后修饰形式，如磷酸化、乙酰化等。
3.可以从复杂的细胞提取物中寻找目标蛋白质的结合伴侣。
然而，免疫共沉淀试验也存在一些局限性，包括：1.需要具有较高特异性的抗体。
2.可能产生伪阳性结果，特别是在存在非特异性结合的情况下。
3.难以从细胞提取物中完全分离复合物。
总结：免疫共沉淀试验是一种常用的实验技术，可以用于寻找细胞中特定蛋白质的相互作用伴侣或靶向蛋白的修饰形式。
根据不同的实验需求，可以选择固相免疫共沉淀或液相免疫共沉淀方法进行。
技能训练6 沉淀试验一、目的要求1、掌握环状沉淀反应的操作方法及结果判定2、掌握双向免疫扩散试验的操作方法及结果分析二、内容与方法（一）环状沉淀反应1、材料待测血迹干燥纸片抗人血清抗体、抗羊血清抗体和抗鸡血清抗体生理盐水环状沉淀管及管架、吸管等。
2、方法（1）、取环状沉淀管3支，分别加入抗人、抗羊和抗鸡血清抗体各0.1ml 于管底部，并注明，置于管架上。
（2）、另取3支试管，分别将3种血迹纸片加入，再各加生理盐水1ml，室温5-10分钟后将溶液摇匀。
（3）、吸取上清液分别加入上述含有抗人、抗羊、抗鸡血清抗体的环状沉淀管内，并使两者形成一清晰交界面。
置室温下1-5分钟观察结果。
3、结果分析根据是否与已知抗血清出现白色沉淀环，判定血迹类型。
4、注意事项（1）、因血清分子密度及比重均大于生理盐水，故当加入含有抗原的生理盐水时只需将沉淀管倾斜，加抗原的吸管勿接触抗血清，使含抗原的生理盐水沿管壁缓缓流下，再将沉淀管直立即可呈一清晰交界面。
（2）、在加抗原时，吸管的头部切勿触及抗血清，否则不仅使抗原抗体混合，不能呈清晰交界面，而且如再用此吸管加抗原于另一支含不同抗血清的沉淀管后，必然会出现交叉反应，无法判定结果。
（二）双向扩散试验1、材料1% 琼脂糖，玻片或培养皿，凝胶打孔器（直径3mm ），水浴箱，10ml吸管，5 μl 微量加样器，抗原，抗体。
2、方法1 ）取一张玻璃片，用水冲洗干净，再用少量75% 乙醇冲洗，晾干后置于水平台备用。
2 ）将1% 琼脂糖融化，56 ℃水浴中保温。
3 ）将1% 凝胶约3ml 铺于玻片上，待凝固后打孔，直径3mm ，间距10mm 。
（如图所示）4 ）中心孔加5 μl 抗体，周围孔内每孔加5 μl 抗原样品（抗原抗体均需预先做系列稀释以获得适宜的抗原抗体比例）。
5 ）将凝胶板置于湿盒，室温过夜（24h 以上）后观察结果。
3、结果分析1 ）阳性结果为在抗原孔与抗体孔之间出现沉淀线。
第六章沉淀反应沉淀反应是指可溶性抗原与相应抗体在特定条件下发生特异性结合时出现的沉淀现象。
第一节沉淀反应的特点沉淀反应中的抗原多为蛋白质、多糖、血清、毒素等可溶性物质。
沉淀反应分两个阶段，第一阶段为抗原抗体发生特异性结合，几秒到几十秒即可完成，出现可溶性小的复合物，肉眼不可见；第二阶段为形成可见的免疫复合物，约需几十分钟到数小时才能完成，如沉淀线、沉淀环。
第二节液体内沉淀试验一、絮状沉淀试验抗原抗体溶液在电解质的存在下结合，形成絮状沉淀物，这种絮状沉淀受抗原和抗体比例的直接影响，因此常用来作为测定抗原抗体反应最适比例的方法，常见类型有：（一）抗原稀释法抗原进行一系列稀释与恒定浓度抗血清反应。
（二）抗体稀释法抗体进行一系列稀释与恒定浓度抗原反应。
（三）方阵滴定法方阵滴定法即棋盘滴定法。
二、免疫浊度测定属于液体内沉淀反应，其特点是将现代光学测量仪器与自动化检测系统相结合应用于沉淀反应，可进行液体中微量抗原、抗体及小分子半抗原定量检测。
（一）免疫比浊测定的影响因素1.抗原抗体的比例是浊度形成的关键因素。
当抗原过量时，形成的IC分子小，而且会发生再解离，使浊度反而下降，光散射亦减少，这就是高剂量钩状效应。
当抗体过量时，IC的形成随着抗原递增而增加，至抗原、抗体最适比例处达最高峰，这就是经典的海德堡曲线理论。
在反应体系中保持抗体适当过量，如形成抗原过量则造成测定的准确性降低。
2.抗体的质量对免疫比浊测定法的抗体要求（1）特异性强：抗血清最核心的要求是单价特异性，即该抗体只针对某一种抗原，与其他无关抗原不发生交叉反应，特异性抗体和相应抗原结合后形成的浊度代表真实的试验结果。
（2）效价高：低效价（＜1:20）抗体会增加非特异性浊度（伪浊度）的产生。
（3）亲和力强：则抗体的活性高，不仅可以加快抗原抗体反应的速度，而且形成的IC较牢固，不易发生解离。
在速率比浊法中尤为重要。
（4）R型和H型抗体：根据抗血清来源的动物种类不同，分为R型抗体和H型抗体。
免疫沉淀反应实验报告免疫沉淀反应实验报告免疫沉淀反应是一种常用的实验方法，用于检测特定抗原与抗体之间的相互作用。
本实验旨在通过免疫沉淀反应，探究抗原与抗体之间的结合情况，从而深入了解免疫系统的工作原理。
实验材料与方法：1. 实验材料：- 抗原样品：选择目标抗原，如蛋白质或细胞表面分子。
- 抗体：选择与目标抗原特异性结合的抗体。
- 免疫沉淀缓冲液：用于提供适宜的反应环境。
- 洗涤缓冲液：用于去除非特异性结合物。
- SDS-PAGE凝胶：用于分离蛋白质。
- 蛋白质标记的二抗：用于检测目标抗原与抗体的结合。
- 蛋白质标记的探针：用于检测目标抗原的存在。
2. 实验方法：- 步骤一：制备免疫沉淀复合物将抗原样品与特异性抗体加入免疫沉淀缓冲液中，孵育一段时间，使抗原与抗体结合形成免疫沉淀复合物。
- 步骤二：免疫沉淀将免疫沉淀复合物加入待测样品中，使目标抗原与抗体结合，形成沉淀物。
- 步骤三：洗涤使用洗涤缓冲液洗涤沉淀物，去除非特异性结合物。
- 步骤四：蛋白质分离将洗涤后的沉淀物进行SDS-PAGE凝胶电泳，将蛋白质分离。
- 步骤五：蛋白质检测使用蛋白质标记的二抗与蛋白质标记的探针，检测目标抗原的存在。
实验结果与讨论：通过免疫沉淀反应实验，我们成功地观察到了抗原与抗体之间的结合现象。
在实验中，我们选择了一种特定的抗原，并与其特异性结合的抗体进行反应。
在免疫沉淀复合物形成后，我们将其加入待测样品中，并进行了洗涤和蛋白质分离的步骤。
通过SDS-PAGE凝胶电泳，我们成功地将目标抗原与抗体结合的蛋白质分离出来。
接下来，我们使用蛋白质标记的二抗与蛋白质标记的探针，对目标抗原进行了检测。
结果显示，目标抗原的存在得到了确认，进一步验证了抗原与抗体之间的结合情况。
这个实验结果对于研究免疫系统的工作原理具有重要意义。
免疫系统是人体抵御外界病原体入侵的重要防线，而抗原与抗体之间的结合是免疫系统中的关键步骤。
通过深入了解抗原与抗体的相互作用，我们可以更好地理解免疫系统的工作机制，为疾病的预防和治疗提供理论依据。
主管检验师资格考试临床免疫学和免疫检验复习习题第六章沉淀反应（附答案解析）一、A1题型1、免疫比浊实验属于（）A、中和反应B、凝集反应C、沉淀反应D、补体结合反应E、溶血反应2、免疫固定电泳的英文缩写是（）A、ECLB、RIEC、RIAD、IFEE、IEP3、对流免疫电泳的原理是（）A、单向免疫扩散与电泳相结合的定向加速的免疫扩散技术B、双向免疫扩散与电泳相结合的定向加速的免疫扩散技术C、单向免疫扩散与两相反向的规律改变的电流相结合的免疫扩散技术D、双向免疫扩散与两相反向的规律改变的电流相结合的免疫扩散技术E、抗原抗体反应与电泳相结合的定向免疫扩散技术的统称4、能够定量测定待检标本的免疫学试验是（）A、间接凝集试验B、协同凝集试验C、单向扩散试验D、双向扩散试验E、对流免疫电泳5、免疫比浊法对抗体的要求不正确的是（）A、特异性强B、效价高C、亲和力强D、使用H型抗体E、使用R型抗体6、免疫比浊法的基本原则是（）A、反应体系中保持抗原过量B、反应体系中保持抗体过量C、反应体系中保持抗原抗体为最适比例D、抗体特异性强E、抗体亲和力强7、直接影响絮状沉淀实验的因素是（）A、抗原分子量B、抗体分子量C、抗原抗体比例D、反应体系的PHE、反应体系的例子强度8、免疫沉淀法目前应用最广、定量比较准确的主要是下列哪种方法（）A、免疫比浊法B、絮状沉淀试验C、单向扩散试验D、双向扩散试验E、棋盘滴定法9、关于双向扩散试验，下列说法错误的是（）A、可用于抗原抗体定性分析B、抗原或抗体相对分子量的分析C、可用于抗原纯度分析D、可用于抗原抗体半定性分析E、可用于抗体效价的滴定10、关于免疫电泳技术的基本原理，说法正确的是（）。
A、应将凝胶扩散置于交流电场中B、抗原及抗体在一定条件下离解成为带正电或负电的电子，在电场中向同相电荷的电极移动C、电子所带净电荷量越多、颗粒越小，泳动速度越慢D、电流会阻碍抗原、抗体的运行速度，延长两者结合的时间E、多种带电荷的物质电泳存在，抗原决定簇不同的成分可得以区分11、下列说法错误的是（）。
第六章沉淀反应沉淀反应是指可溶性抗原与相应抗体在特定条件下发生特异性结合时出现的沉淀现象。
第一节沉淀反应的特点沉淀反应中的抗原多为蛋白质、多糖、血清、毒素等可溶性物质。
沉淀反应分两个阶段，第一阶段为抗原抗体发生特异性结合，几秒到几十秒即可完成，出现可溶性小的复合物，肉眼不可见；第二阶段为形成可见的免疫复合物，约需几十分钟到数小时才能完成，如沉淀线、沉淀环。
第二节液体内沉淀试验一、絮状沉淀试验抗原抗体溶液在电解质的存在下结合，形成絮状沉淀物，这种絮状沉淀受抗原和抗体比例的直接影响，因此常用来作为测定抗原抗体反应最适比例的方法，常见类型有：（一）抗原稀释法抗原进行一系列稀释与恒定浓度抗血清反应。
（二）抗体稀释法抗体进行一系列稀释与恒定浓度抗原反应。
（三）方阵滴定法即棋盘滴定法。
二、免疫浊度测定属于液体内沉淀反应，其特点是将现代光学测量仪器与自动化检测系统相结合应用于沉淀反应，可进行液体中微量抗原、抗体及小分子半抗原定量检测。
（一）免疫比浊测定的影响因素1.抗原抗体的比例是浊度形成的关键因素。
当抗原过量时，形成的IC分子小，而且会发生再解离，使浊度反而下降，光散射亦减少，这就是高剂量钩状效应。
当抗体过量时，IC的形成随着抗原递增而增加，至抗原、抗体最适比例处达最高峰，这就是经典的海德堡曲线理论。
在反应体系中需保持抗体适当过量，如形成抗原过量则造成测定的准确性降低。
2.抗体的质量对免疫比浊测定法的抗体要求（1）特异性强（2）效价高：低效价（＜1:20）抗体会增加非特异性浊度（伪浊度）的产生。
（3）亲和力强：则抗体的活性高，可加快抗原抗体反应的速度，且形成的IC较牢固，不易发生解离。
（4）R型和H型抗体：R型抗体是指以家兔为代表的小型动物被注射抗原免疫后制备的抗血清。
这类抗血清的特点是亲和力较强，抗原抗体结合后不易发生解离。
H型抗体是指以马为代表的大型动物注射抗原后制备的抗血清，这类抗血清的亲和力弱，抗原抗体结合后极易解离。
第六章沉淀反应沉淀反应是指可溶性抗原与相应抗体在特定条件下发生特异性结合时出现的沉淀现象。
第一节沉淀反应的特点沉淀反应中的抗原多为蛋白质、多糖、血清、毒素等可溶性物质。
沉淀反应分两个阶段，第一阶段为抗原抗体发生特异性结合，几秒到几十秒即可完成，出现可溶性小的复合物，肉眼不可见; 第二阶段为形成可见的免疫复合物，约需几十分钟到数小时才能完成，如沉淀线、沉淀环。
第二节液体内沉淀试验一、絮状沉淀试验抗原抗体溶液在电解质的存在下结合，形成絮状沉淀物，这种絮状沉淀 因此常用来作为测定抗原抗体反应最适比例的方法，常见类型有:抗原进行一系列稀释与恒定浓度抗血清反应。
抗体进行一系列稀释与恒定浓度抗原反应。
方阵滴定法即棋盘滴定法。
二、免疫浊度测定属于液体内沉淀反应，其特点是将现代光学测量仪器与自动化检测系统相结合应用于沉淀反应，可进 行液体中微量抗原、抗体及小分子半抗原定量检测。
（一）免疫比浊测定的影响因素1. 抗原抗体的比例 是浊度形成的关键因素。
当抗原过量时，形成的IC 分子小，而且会发生再解离，使浊度反而下降，光散射亦减少，这就是高剂量钩状效应。
当抗体过量时，IC 的形成随着抗原递增而增加，至抗原、抗体最适比例处达最高峰，这就是 经典的海德堡曲线理论。
在反应体系中保持抗体适当过量，如形成抗原过量则造成测定的准确性降低。
2. 抗体的质量 对免疫比浊测定法的抗体要求（1） 特异性强 （2） 效价高（3） 亲和力强：则抗体的活性高，不仅可以加快抗原抗体反应的速度，而且形成的IC 较牢固，不易 发生解离。
在速率比浊法中尤为重要。
（4） R 型和H 型抗体：根据抗血清来源的动物种类不同，分为R 型抗体和H 型抗体。
R 型抗体是指以家兔为代表的小型动物 被注射抗原免疫后制备的抗血清。
这类抗血清的特点是 亲和力较强，抗原抗体结合后不易发生解离。
H 型抗体是指以 马为代表的大型动物 注射抗原后制备的抗血清, 这类抗血清的 亲和力弱，抗原抗体结合 后极易解离。
