献给初学者：PCR常见问题分析

PCR常见问题分析及对策(无扩增产物、非特异性扩增、拖尾、假阳性)PCR常见问题分析及对策(无扩增产物、非特异性扩增、拖尾、假阳性)2009-03-28 11:38问题1：无扩增产物现象：正对照有条带，而样品则无原因:1.模板:含有抑制物，含量低2.Buffer对样品不合适3.引物设计不当或者发生降解4.反应条件：退火温度太高，延伸时间太短对策:1.纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量2.更换Buffer或调整浓度3.重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物4.降低退火温度、延长延伸时间问题2：非特异性扩增现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带原因： 1.引物特异性差 2.模板或引物浓度过高 3.酶量过多4.Mg2+浓度偏高5.退火温度偏低6.循环次数过多对策：1.重新设计引物或者使用巢式PCR 2.适当降低模板或引物浓度 3.适当减少酶量 4.降低镁离子浓度 5.适当提高退火温度或使用二阶段温度法 6.减少循环次数问题3：拖尾现象：产物在凝胶上呈Smear状态。

原因： 1.模板不纯 2.Buffer不合适 3.退火温度偏低 4.酶量过多 5.dNTP、Mg 2+浓度偏高 6.循环次数过多对策： 1.纯化模板 2.更换Buffer 3.适当提高退火温度 4.适量用酶 5.适当降低dNTP和镁离子的浓度 6.减少循环次数问题4：假阳性现象：空白对照出现目的扩增产物原因：靶序列或扩增产物的交*污染对策： 1.操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外； 2.除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。

所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。

3.各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存PCR引物设计的黄金法则（转自tiangen） 1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。

DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。

在NCBI 上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区 2.引物长度一般在15~30碱基之间。

PCR技术之——常见问题解析及处理方法我们进行核酸扩增时，往往会不定的出现一些异常问题，本期我给大家搜集了一些平时经常性遇到的一些问题，希望对大家有所帮助。

（一）相对特异性 PCR产物的特异性主要取决于引物链的特异性。

由于存在同源序列，随意设计的引物链，其PCR产物在电泳分析时可能出现多条链，因此在设计引物链时应考虑其绝对特异性和相对特异性。

前者指两条引物链的核苷酸序列只与靶DNA片段互补，后者是指两条引物链的核苷酸序列及两者之间的DNA长度对靶DNA片段是特异的，但亦可与其他区域的DNA片段互补，而其PCR产物的长度与靶DNA片段的扩增产物的长度明显不同，应根据两引物问的DNA片段长度，预计PCR产物的大小，并与电泳分析的DNA片段大小比较．或用寡聚核苷酸限制性内切酶片段分析，或用分子杂交、核苷酸序列分析来测定。

（二）标本中存在的有形成分对反应的抑制这一点主要是针对来自临床标本中的杂质加细菌蛋白质和Taq DNA聚合酶抑制因子，须注意避免污染和去除标本中的杂质；将标本加热煮沸使抑制因子与DNA分离。

对于来自标本中的细胞和细胞器的崩解、核酸酶的激活均可使待检的DNA降解，降解的DNA是Taq DNA聚合酶作用良好底物，能与靶DNA竞争，从而扩增大量的非特异性DNA，这种非特异性DNA会使背景干扰超过了前景信号影响PCR循环扩增效率，减少特异性DNA扩增产量。

（三）Taq DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶扩增的特异性受PCR循环次数及延伸时间与温度的影响循环次数太多使延伸时间延长和Taq DNA聚合酶单位用量增长可能导致非特异性扩增；循环次数太少，则不能得到充足的扩增产物，温度不适宜会影响扩增产物数量，延伸温度一般高于复性温度。

（四）复性温度与时间引物与变性DNA的复性温度对PCR 的特异性有影响，复性温度由引物的碱基成分决定。

在低温度（37℃）下复性可出现比扩增DNA长的非特异性扩增带；而在55～60℃复性的扩增带一般是特异的，复性时间过长或过短都会增加非特异性扩增。

P C R检测常见问题与解决途径------------------------------------------作者xxxx------------------------------------------日期xxxxPCR检测常见问题与解决途径利用PCR方法检测转基因成分时，经常出现假阳性、假阴性、非特异性扩增和涂抹带。

尤其是假阳性和假阴性可使检测结果得出错误结论，有时可造成严重后果。

为了提高转基因检测的准确性和可靠性，PCR检测应尽量减少假阳性、假阴性、非特异性扩增和涂抹带现象的发生。

一个好的PCR方法不但要求特异性好、灵敏度高、还要求具有高的可重复性、重现性、鲁棒性，尽量减少假阳性、假阴性和非特异性扩增。

本文对PCR检测中出现的假阳性、假阴性、非特异性扩增和涂抹带的原因及其解决方法予以综述。

一、假阳性：（一）假阳性现象假阳性是指检测阴性材料得到阳性结果。

如果一次实验中的几个阴性对照中出现一个或几个阳性结果，提示本次实验中其它标本的检测结果可能有假阳性。

实验中设立的阴性对照可提示有无假阳性结果出现。

（二）造成假阳性的原因1. 样品间交叉污染：样本污染主要有收集样本的容器被污染，或样本放置时，由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有样本而造成相互间交叉污染；样本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染；2. PCR试剂的污染：主要是由于在PCR试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。

3. PCR扩增产物污染：这是PCR反应中最主要最常见的污染问题。

因为PCR产物拷贝量大(一般为1013拷贝/ml)，远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物污染，就可形成假阳性。

4. 气溶胶污染：在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染。

据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题。

PCR常见问题及对策（一）没有得到扩增产物（1）酶失活或在反应体系中未加入酶。

Taq DNA聚合酶因保存或运输不当而失活，往往通过更换新酶或用另一来源的酶以获得满意的结果。

（2）模板含有杂质。

特别是对甲醛固定及石蜡包埋的组织常含甲酸，造成DNA脱嘌呤而影响PCR的结果。

（3）变性温度是否准确：PCR仪指示温度与实际温度是否相符，过高酶在前几个循环就迅速失活；过低则模板变性不彻底。

（4）反应系统中污染了蛋白酶及核酸酶，应在未加Taq酶以前，将反应体系95℃加热5－10分钟。

（5）引物变质失效。

人工合成的引物是否正确。

是否纯化，或因储存条件不当而失活。

（6）使用PCR试剂盒时还应注意：①是否严格按照说明书操作；②试剂使用前是否充分混匀；③试剂储存过久或不当而失效。

（二）扩增产物在凝胶中涂布或成片状（1）酶量过高。

减少酶量；酶的质量差，调换另一来源的酶。

（2）dNTP浓度过高。

减少dNTP的浓度。

（3）MgCl2浓度过高。

可适当降低其用量。

（4）循环次数过多；增加模板量减少循环次数，缩短退火时间及延伸时间，或改用二种温度的PCR循环。

（5）退火温度过低。

（6）电泳体系有问题：①凝胶中缓冲液和电泳缓冲液浓度相差太大；②凝胶没有凝固好；③琼脂糖质量差。

（7）若为PCR试剂盒则可能：①由于运输储存不当引起试剂盒失效；②试剂盒本身质量有问题，如引物选择、循环参数等选择不当。

（8）降解的陈旧模板扩增也易产生涂布。

（三）溴酚蓝前有区带（很宽）（1）模板量太低。

增加模板DNA的用量。

（2）循环次数太多。

减少循环次数。

（3）复性度偏低。

提高复性温度。

（4）预变性后没有立刻上机循环。

（5）引物3'端是否互补；重新设计合成较长的引物。

（6）引物用量偏多。

降低引物的使用量。

（四）扩增产物出现多条带（1）引物用量偏大，引物的特异性不高。

应调换引物或降低引物的使用量。

（2）循环的次数过多。

适当增加模板的量，减少循环次数。

PCR常见问题分析假阳性现象：阴性样品出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致常见问题可能原因建议解决方案PCR污染靶序列或扩增产物的交叉污染操作时应小心轻柔，防止将含靶序列的样品吸入加样枪内或溅出离心管外；试剂或器材应高压灭菌，破坏存在的核酸试剂污染各种试剂先进行分装，并低温贮存引物引物设计不合适，选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性重新设计引物出现非特异性扩增现象：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者有时同时出现特异性扩增带与非特异性扩增。

常见问题可能原因建议解决方案引物引物特异性差重新设计引物引物浓度过高适当减少引物浓度Mg2+浓度Mg2+浓度过高适当降低Mg2+浓度，从1 mM到3 mM，间隔0.5 mM进行一系列反应，确定最佳的镁离子浓度耐热聚合酶酶量过多以0.5U为间隔适当减少酶量退火温度退火温度过低适当提高退火温度或采用二阶段温度法PCR循环次数PCR循环次数过多减少PCR循环次数扩增无带常见问题可能原因建议解决方案引物引物设计不合适或降解重新设计引物模板模板降解重新制备模板Mg2+浓度Mg2+浓度过低适当降低Mg2+浓度，从1 mM到3 mM，间隔0.5 mM进行一系列反应，确定最佳的镁离子浓度退火温度退火温度过高适当降低退火温度延伸时间延伸时间短增加延伸时间出现片状拖带或涂抹带常见问题可能原因建议解决方案引物特异性差重新设计引物，改变引物的位置和长度，增强其特异性模板DNA 模板不纯纯化模板或使用试剂盒提取DNA耐热聚合酶酶量过多以0.5U为间隔适当减少酶量Mg2+浓度Mg2+浓度过高适当降低Mg2+浓度，从1mM到3mM，间隔0.5mM进行一系列反应，确定最佳的Mg2+浓度dNTPs dNTPs浓度过高适当降低dNTPs浓度退火温度退火温度过低适当提高退火温度。

PCR常见问题及解决方法PCR常见问题及解决方法1)、不出现扩增条带a)、引物设计有误：核对引物设计方案。

b)、扩增体系配制错误：重复实验。

c)、扩增反应条件不优化：调整Mg2+浓度、酶量、扩增程序。

d)、模板质粒质量偏差：长期放置、反复冻融会导致模板质粒断裂、开环或降解，应使用新鲜制备的质粒作为模板。

e)、模板的GC含量：GC含量过高会导致DNA的双链无法完全打开，此时加入Vazyme（诺唯赞生物）的PCR Enhancer(货号P021)可以有效降低解链温度；GC 含量过低会导致扩增效率较差，可适当延长引物长度或通过TD PCR摸索合适的反应条件。

2)、出现非特异性扩增带a)、引物设计不够优化：引物与靶序列有非特异性互补或自身聚合成二聚体，可降低引物浓度进行优化，必要时重新设计引物。

b)、模板不纯：模板被污染，需重新制备模板。

c)、试验条件不够优化：如果出现比目的条带小的杂带，可通过提高退火温度、降低循环数调整；如果出现比目的条带大的杂带，可缩短延伸时间、降低循环数；另外，可降低Mg2+及酶的浓度。

3)、条带弥散或拖尾a)、模板降解或过量：可通过电泳检查模板完整性及浓度，必要时重新纯化模板，对于简单模板(例如质粒、λDNA)，每50ul反应使用1pg-10ng DNA；对于复杂模板(例如基因组、cDNA)，每50ul反应使用1ng-1ug DNA。

b)、酶量加太多：如Vazyme（诺唯赞生物）的高保真系列：50ul反应体系加1U，Taq系列：50ul体系加2U。

4)、条带很暗a)、增加模板量，提高循环数。

b)、多扩几管，胶回收浓缩。

5)、产物有错配a)、检查原始模板是否原本就是突变或错配的。

b)、少量序列存在非严谨序列，有相似重组序列，导致重组错位。