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实验七重组质粒DNA的提取及酶切鉴定【实验原理】分离制备质粒DNA的方法很多，其中常用的方法有碱裂解法、煮沸法、SDS法、羟基磷灰石层析法等。
在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA的用途进行选择。
本实验采用SDS碱裂解法提取重组质粒DNA，十二烷基磺酸钠（SDS）是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性。
限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。
限制性内切酶识别序列长度一般为4～8个呈回文序列的特异核苷酸对。
由于限制性内切酶的切割特性不同，分子生物学中主要用到Ⅱ型限制性内切酶（切割位置在识别序列内部）。
对质粒进行酶切，通过跑胶观察片段大小，从而鉴定质粒。
【实验步骤】本次实验所用的质粒提取试剂盒为天根的质粒小提试剂盒，操作步骤按说明书进行。
1. 吸附柱中加500ul 平衡液(BL)，12000rpm离心1min ，弃收集管中的液体。
2.取1.5ml菌液至2ml离心管中，12,000rpm离心1min，弃上清。
3. 加250ul solution Ⅰ（P1），vortex。
4. 加250 solution Ⅱ（P2），上下颠倒混匀。
操作时间不能超过5min 注：此步骤不宜超过5 min。
5. 加350 solution Ⅲ（P3），立即颠倒混匀几次。
12000rpm离心10min。
6. 吸取上清加入吸附柱中，尽量不要吸出沉淀12000rpm离心1min ，弃收集管中的液体。
注：此时4℃离心不利于沉淀沉降。
7. 加入600μL漂洗液（PW）于离心吸附柱中，12000rpm离心1min ，倒掉废液。
8. 重复上一步，9. 空管离2min。
将吸附柱放入1.5ml离心管中，在超净台中晾5min。
10. 将700 μl的Rinse B加入Spin Column中，12,000 rpm离心30 sec，弃滤液。
实验八重组克隆筛选（酶切鉴定）【实验目的】1.掌握质粒提取的基本方法的原理；2.学习和掌握限制性内切酶的使用方法。
【实验原理】重组克隆的筛选和鉴定是基因工程中的重要环节之一。
不同的克隆载体和相应的宿主系统，其重组克隆的筛选和鉴定方法不尽相同。
从理论上说，重组克隆的筛选是排除自身环化的载体、未酶解完全的载体以及非目的DNA片断插入的载体所形成的克隆。
常用的筛选方法有两类。
一类是针对遗传表型改变筛选法，以－半乳糖苷酶系统筛选法为代表。
另一类是分析重组子结构特征的筛选法，包括快速裂解菌落鉴定质粒大小、限制酶图谱鉴定、Southern 印迹杂交、PCR、菌落（或噬菌斑）原位杂交等方法。
1．－半乳糖苷酶系统筛选法（蓝白斑筛选法）使用本方法的载体包括M13噬菌体、pUC质粒系列、pGEM质粒系列等。
这些载体的共同特征是载体上携带一段细菌的基因lacZ。
lacZ编码－半乳糖苷酶的一段146个氨基酸的肽，载体转化的宿主细胞为lacZ△M15基因型。
重组子由于外源片断的插入使肽基因失活不能形成互补作用，也就是说，宿主细胞表现为－半乳糖苷酶失活。
因此，在X-gal平板上，重组克隆为无色噬菌斑或菌落，非重组克隆为蓝色噬菌斑或菌落。
这种筛选方法操作简单，但当插入片断较短（小于500bp），且插入片断没有影响lacZ基因的读框时，有假阴性结果的出现。
2．快速裂解菌落鉴定质粒大小从平板中挑取菌落，过夜培养后裂解，直接进行凝胶电泳，与载体DNA比较，根据迁移率的减小初步判断是否有插入片断存在。
本方法适用于插入片断较大的重组子的初步筛选。
3．限制酶图谱鉴定对于初步筛选具有重组子的菌落，提纯重组质粒或重组噬菌体DNA，用相应的限制性内切酶（一种或两种）切割重组子释放出的插入片断，对于可能存在双向插入的重组子还可用适当的限制性内切酶消化鉴定插入方向，然后用凝胶电泳检测插入片断和载体的大小。
4．Southern 印迹杂交为确定DNA插入片断的正确性，在限制性内切酶消化重组子、凝胶电泳分离后，通过Southern 印迹转移将DNA移至硝酸纤维膜上，再用放射性同位素或非放射性标记的相应外源DNA片断作为探针，进行分子杂交，鉴定重组子中的插入片断是否是所需的靶基因片断。
第三次分子生物学实验报告重组质粒的酶切鉴定及PCR实验一、实验目的1、通过酶切鉴定重组质粒的插入片段的大小；2、学习并掌握PCR技术的原理和基本操作。
二、实验原理1、重组质粒酶切鉴定将含有外源DNA的转化子的E.coliDH5α菌株进行培养，并用试剂盒提取其质粒DNA，将所提取的DNA用切pUC19质粒的同一种限制性内切酶进行切割以验证所插入的外源DNA的大小。
2、PCR原理PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应是1986 年由Kallis Mullis 发现。
这项技术已广泛地应用于分子生物学各个领域，它不仅可用于基因分离克隆和核酸序列分析，还可用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析等方面。
本次实验旨在通过学习和掌握PCR反应的基本原理和实验技术，以验证重组质粒插入片段大小。
（1）聚合酶链式反应原理CR是一种利用两种与相反链杂交并附着于靶DNA两侧的寡核苷酸引物，经酶促合成特异的DNA 片段的体外方法。
反应过程由高温变性，低温退火和适温延伸等几步反应组成一个循环，然后反复进行，使目的的DNA 得以迅速扩增。
置待扩增DNA 于高温下解链成为单链DNA 模板，人工合成的两个寡核苷酸引物在低温条件下分别与目的片段两侧的两条链互补结合，DNA聚合酶在72℃将单核苷酸从引物3'端开始掺入，沿模板5'—3'方向延伸，合成DNA 新链。
由于每一循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，所以PCR 产物以指数方式增加，经25—30次周期之后，理论上可增加109倍，实际上可增加107倍。
PCR 技术具有操作简便、省时、灵敏度高特异性强和对原始材料质量要求低等优点，但由于所用的TaqDNA 聚合酶缺乏5'—3'核酶外切酶活性，不能纠正反应中发生的错误核苷酸掺入，估计每9000个核苷酸会导致一个掺入错误，但是错误掺入的碱基有终止链延伸的作用倾向，使得错误不会扩大。
实验8重组质粒的转化及筛选实验⼋、重组质粒的转化及筛选转化（transformation）：是将异源DNA分⼦引⼊受体细胞，使其获得新的遗传性状的⼀种技术⽅法。
进⼊细胞的DNA分⼦通过复制表达，才能实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
热激转化将⼤肠杆菌感受态细胞与待转化的DNA样品⼩⼼混合均匀，置于冰上约10min，使DNA充分粘附于细胞表⾯，经42℃短时间热激处理，促进细胞吸收DNA样品。
将已转化处理的细胞置于⽆选择压⼒的培养基中保温⼀段时间，然后涂布于有选择压⼒的平板培养基上，获得重组⼦。
实验材料DNA材料：连接产物、质粒pQE30-EGFP；感受态细胞：⼤肠杆菌DH5α；培养基：LB抗⽣素：AMP（氨苄青霉素），在培养基冷却到60℃以下添加，添加量为1/1000。
已灭菌的EP管操作步骤1.从冰箱取出的感受态细胞放置冰上融化，分别取100µl转移到2⽀已灭菌的1.5ml离⼼管中，分别加⼊质粒1µl、连接产物10µl，温和混匀，冰上放置5~10min；2.热激处理：将EP管置于42℃恒温⽔浴锅中，保温90秒，不要摇动，然后迅速转移到碎冰块中，冷却1~2分钟。
3.往EP管中加⼊500µl新鲜LB培养液（37℃预热），37℃，培养30min~60min（注：转纯质粒可省略，转连接产物需进⾏）。
4.取100~150µL细胞（可离⼼，重悬）涂布于含有抗⽣素的LB平板上，室温放置3~5分钟。
5.37℃培养12~16h（过夜）；然后把培养箱温度调⾄30℃培养3~4h，观看EGFP基因表达情况。
转化实验流程感受态细菌100µl 质粒1 µl冰浴中10′混匀420C⽔浴90′冰浴1-2 ′加⼊500 l LB370C培养30′涂板培养过夜勿动热激＋⽤CaCl法制备的感受态细胞，可使每微克超2螺旋质粒DNA产⽣5 106-2 107个转化菌落。
重组DNA分子的酶切、连接、转化和筛选摘要：本实验利用酶切后的目的片段（500bp）与puc18为材料，运用氯化钙法制备感受态细胞和外源的重组体DNA转入受体菌细胞，经过筛选培养基筛选后得到重组子。
关键词：酶切重组筛选前言重组克隆是指含有外源DNA的细胞增殖而产生的细胞群体，或由其经生长、发育和再生而形成的组织、器官、个体。
重组克隆的筛选主要依靠DNA载体上的选择标记，加上合适的选择（培养）条件来进行。
一是通过选择培养基使只有带外源DNA的细胞才能生长；二是根据选择性遗传标记选择带有目的基因的细胞克隆。
1材料与方法1.1材料质粒DNA、目的DNA、E.coli受菌体、质粒pUC18、重组体DNA 1.2方法1.2.1PCR法扩增目的片段（CER3A）1.2.1.1 PCR反应体系反应物体积/ulPCR Taq mix 12.5CER3Ar，CER3Af 各1dd水9.5质粒CER3A 11.2.1.2 PCR扩增条件在PCR仪上设计94℃5min，然后进入循环，循环中第一步为94℃30s，第二步为58℃退火30s，第三步为72℃延伸1min，共进行35次循环，然后再72℃延伸10min以提高产物的扩增率，取出放在4℃条件下终止反应。
1.2.2目的片段的电泳将10倍loading buffer 5ul和25ulPCR产物混匀，在1.2%的琼脂糖凝胶中电泳，分析。
1.2.3目的片段的回收通过琼脂糖电泳尽可能将目的DNA片段与其他片段分开，用干净的手术刀，将含目的片段DNA的琼脂糖凝胶块切下，放入2ml离心管称重。
根据凝胶重量和浓度，按每100mg琼脂糖加400ml的比例加bufferB2。
将离心管置于50℃水浴5~10min，间或混匀，直至胶块完全溶化。
在酶切反应体系中加入5倍bufferB2，混匀。
将熔化好的溶液全都移到吸附柱，静止2min，8000×g离心30s，倒掉收集管的液体，将吸附管放入同一收集管中。
实验八重组克隆筛选（酶切鉴定）
【实验目的】
1.掌握质粒提取的基本方法的原理；
2.学习和掌握限制性内切酶的使用方法。
【实验原理】
重组克隆的筛选和鉴定是基因工程中的重要环节之一。
不同的克隆载体和相应的宿主系统，其重组克隆的筛选和鉴定方法不尽相同。
从理论上说，重组克隆的筛选是排除自身环化的载体、未酶解完全的载体以及非目的DNA片断插入的载体所形成的克隆。
常用的筛选方法有两类。
一类是针对遗传表型改变筛选法，以－半乳糖苷酶系统筛选法为代表。
另一类是分析重组子结构特征的筛选法，包括快速裂解菌落鉴定质粒大小、限制酶图谱鉴定、Southern 印迹杂交、PCR、菌落（或噬菌斑）原位杂交等方法。
1．－半乳糖苷酶系统筛选法（蓝白斑筛选法）
使用本方法的载体包括M13噬菌体、pUC质粒系列、pGEM质粒系列等。
这些载体的共同特征是载体上携带一段细菌的基因lacZ。
lacZ编码－半乳糖苷酶的一段146个氨基酸的肽，载体转化的宿主细胞为lacZ△M15基因型。
重组子由于外源片断的插入使肽基因失活不能形成互补作用，也就是说，宿主细胞表现为－半乳糖苷酶失活。
因此，在X-gal平板上，重组克隆为无色噬菌斑或菌落，非重组克隆为蓝色噬菌斑或菌落。
这种筛选方法操作简单，但当插入片断较短（小于500bp），且插入片断没有影响lacZ基因的读框时，有假阴性结果的出现。
2．快速裂解菌落鉴定质粒大小
从平板中挑取菌落，过夜培养后裂解，直接进行凝胶电泳，与载体DNA比较，根据迁移率的减小初步判断是否有插入片断存在。
本方法适用于插入片断较大的重组子的初步筛选。
3．限制酶图谱鉴定
对于初步筛选具有重组子的菌落，提纯重组质粒或重组噬菌体DNA，用相应的限制性内切酶（一种或两种）切割重组子释放出的插入片断，对于可能存在双向插入的重组子还可用适当的限制性内切酶消化鉴定插入方向，然后用凝胶电泳检测插入片断和载体的大小。
4．Southern 印迹杂交
为确定DNA插入片断的正确性，在限制性内切酶消化重组子、凝胶电泳分离后，通过Southern 印迹转移将DNA移至硝酸纤维膜上，再用放射性同位素或非放射性标记的相应外源DNA片断作为探针，进行分子杂交，鉴定重组子中的插入片断是否是所需的靶基因片断。
5．PCR法
用PCR对重组子进行分析，不但可以迅速扩增插入片段，而且可以直接进行DNA序列分析。
因为对于表达型重组子，其插入片断的序列的正确性是非常关键的。
PCR法既适用于筛选含特异目的基因的重组克隆，也适用于从文库中筛选含感兴趣的基因或未知的功能基因的重组克隆。
前者采用特异目的基因的引物，后者采用载体上的通用引物。
6．菌落（或噬菌斑）原位杂交
菌落或噬菌斑原位杂交技术是将转化菌DNA转移到硝酸纤维膜上，用放射性同位素或非放射性标记的特异DNA或RNA探针进行分子杂交，然后挑选阳性克隆。
这种方法能进行大规模操作，是筛选基因文库的首选方法。
本实验采用限制酶图谱鉴定。
核酸限制性内切酶是在原核生物中发现的一类专一识别双链DNA中特定碱基序列的核酸水解酶，它们的功能类似于高等动物的免疫系统，用于抗击外来DNA的侵袭。
现已发现几百种限制性内切酶，分子生物学中经常使用的是II型限制性内切酶，它能识别双链DNA分子中特定的靶序列（4～8bp）, 以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键，产生的DNA片段5＇端为P，3＇端为OH。
由于限制性内切酶能识别DNA 特异序列并进行切割，因而在基因重组、DNA序列分析、基因组甲基化分析、基因物理图谱绘制及分子克隆等技术中收到广泛应用。
酶活力通常用酶单位（U）表示，酶单位的定义是：在最适反应条件下，1小时完全降解1μg DNA的酶量为一个单位。
【试剂与器材】
（一）试剂
1.质粒提取试剂（见实验五）
2.限制性内切酶Kpn I 及10×酶切缓冲液。
3.限制性内切酶Xbal I及10×酶切缓冲液。
4.TAE电泳缓冲液或TBE电泳缓冲液
5.琼脂糖（Agarose）
6.6×电泳加样缓冲液：0.25％溴粉蓝，40％(w/v) 蔗糖水溶液，贮存于4℃。
（二）器材
水平电泳装置、电泳仪、水浴锅、恒温振荡器、台式高速离心机、微量移液器、凝胶成像系统等。
（三）菌株
大肠杆菌DH5α转化菌。
【操作方法】
1. 质粒提取步骤(见实验五)
2. 酶切反应
1)在灭菌的0.5mL EP管中加入重组质粒DNA 1μg和相应的10×M buffer 2μL（见附录1），再加入灭菌重蒸水至酶切总体积为20μL，将管内溶液混匀后各加入1μLKpn I和Xbal I酶液双酶切，用手指轻弹管壁使溶液混匀或用微量离心机甩一下，使溶液集中在管底。
如果是同一条件下进行多个酶切反应，建议统一加好相同的组分后混匀分装，最后加入DNA样品。
酶切反应加样表：
2)混匀反应体系后，将EP管置于适当的支持物上（如插在泡沫塑料板上），37℃水浴保温2h-3h，使酶切反应完全。
3)每管加入2μL 0.1mol/L EDTA (pH8.0)，混匀，以停止反应，或置65℃水浴中10min，对限制性内切酶进行灭活，不同的酶灭活条件可能不同，可参照说明书进行。
灭活后的酶切溶液置于冰箱中保存备用。
4)琼脂糖凝胶电泳检测酶切反应的结果。
【注意事项与提示】
1.影响限制性内切酶活性的因素包括：
a)酶切割位点周围核苷酸两侧的碱基的性质；
b)识别序列在DNA中的分布频率；
c)与DNA的构象有关（SC,L,OC）；
d)DNA的纯度（蛋白、氯仿、SDS、EDTA、甘油等）
因此，酶切时应尽量注意将影响酶切的因素降低到最小。
2.市售的酶一般浓度很大，为节约起见，使用时可事先用酶反应缓冲液（1×）进行稀释；可采取适当延长酶切时间或增加酶量的方式提高酶切效率，但内切酶用量不能超过总反应体积的10%，否则，酶活性将因为甘油过量受到影响。
3.由于EDTA的存在会抑制连接酶的活性，通常采用加热方法终止酶切反应。
4.酶切反应的整个过程应注意枪头的洁净以避免造成对酶的污染，为防止酶活性降低，取酶时应在冰上操作且动作迅速。
【实验安排】
第三天观察转化结果（蓝白斑情况），计算重组率。
提取重组质粒DNA、酶切鉴定。
【实验报告要求与思考题】
1.提交重组质粒酶切琼脂糖凝胶电泳检测结果。
2.提交连接产物转化平板照片并计算重组率。
阳性重组率= [ 白色菌落数/（白色菌落+蓝色菌落）]×100%。
