血管性血友病因子裂解酶抗原及活性与年龄及性别的关系分析
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血管性血友病因子裂解酶抗原及活性与年龄及性别的关系分析1董宁征，季顺东，阮长耿苏州大学附属第一医院，江苏苏州（215006）E-mail：changgengruan@摘要：目的：通过检测健康体检者血浆中ADAMTS13的抗原及活性，比较不同性别和年龄组间ADAMT13的抗原及活性的差别，分析ADAMTS13与年龄及性别的关系，为ADAMTS13相关疾病的判断提供依据。
方法：用Frests-VWF73试剂盒检测血浆中ADAMTS13的活性；用夹心酶联免疫反应试剂盒（ELISA）检测ADAMTS13抗原含量。
结果：各年龄组ADMATS13 的活性均值无显著差异；而ADAMTS13抗原量随年龄的改变而改变，21-40岁年龄组最高，为109.7 ± 23.3 % ，在60岁以上组及低龄组（16-20岁）显著降低；ADAMTS13的抗原及活性水平在男女性别间无显著差异。
关键词：血管性血友病因子裂解酶; 抗原; 活性；年龄；性别血管性血友病因子裂解酶(ADAMTS13) 是一种调控血管性血友病因子（vWF）结构与功能的金属蛋白酶，其作用于vWFA2区 842位酪氨酸与843 位蛋氨酸之间的肽键，将VWF 单体裂解为相对分子量为170 × 103和140 × 103的两个片段[1]。
ADAMTS13活性的变化与多种生理病理状态下相关，ADAMTS13活性的缺乏，系血栓性血小板减少性紫癜（TTP）发病的主要机制，也是诊断TTP的重要标准。
ADAMTS13抗原及活性在不同年龄正常人群的分布情况，及其与性别的关系，国内外研究资料甚少，国外仅有文献报道ADAMTS13活性与年龄的关系[2]。
本文旨在研究ADAMTS13与年龄及性别的关系，为临床疾病的判断提供依据。
1. 对象及方法1.1 研究对象健康体检者共 87 例，年龄l6～78岁，平均年龄(45.3±21.4)岁；男性44例，年龄16～78岁，平均(45.0±21.6)岁；女性43例，年龄l7～75岁，平均年龄(42.6±21.2) 岁，均无血栓性疾病史。
正常人混合血浆取自40例献血员。
1.2方法1.2.1 血样标本采集和保存:取静脉血, 使用0.129mol/L的枸橼酸钠抗凝，采集后均3000rpm离心5分钟，分离血浆，分装后冻存-30℃备用。
1.2.2 ADAMTS13 活性的测定[3]应用Frets-VWF73试剂盒（购自日本Peptide Institute）检测ADAMTS13的活性。
根据试剂盒使用说明进行操作，使用前依次加入37µl DMSO和117µl水溶解荧光标记的ADAMTS13底物Frets-VWF73，用反应缓冲液（5 mM Bis-Tris, 25mM CaCl2, 0.05%Tween-20,1本课题得到国家自然科学基金资助项目（30470732）教育部博士点基金（k5122501）苏州大学附属第一医院血液学“135工程”重点学科开放课题基金（135XY0406）的资助。
pH 6.0）稀释正常人混合血浆和待测样本（1:25稀释），加入96孔板，每孔100 µl，随后每孔再加入100µl的底物（终浓度为2 µM）。
检测荧光，连续检测１h,每5分钟测一次。
以不同比例稀释的正常人混合血浆作标准曲线，计算待测样品ADAMTS13的活性水平。
1.2.3 ADAMTS13抗原的测定[4]用三抗体夹心ELISA法（试剂盒由比利时Leuven大学血栓研究室提供）检测ADAMTS13抗原水平。
具体方法如下，使用抗ADAMTS13单克隆抗体2G3（4µg/ml）包被96孔板，4℃过夜。
以一定比例稀释的正常人混合血浆作标准曲线。
50µl患者血浆按1/4，1/8，1/16稀释，加入每孔。
37℃孵育1h。
一抗为2株生物素标记的抗ADAMTS13单克隆抗体13F7、8C10，混合后浓度1µg/ml，室温孵育1h。
加1/15000稀释的辣根过氧化物酶标记的Avidin（Sigma公司，美国），室温孵育1小时。
使用邻苯二胺显色。
1.5M的硫酸终止反应。
酶标仪读取490nm条件下的吸光度值。
计算待测样品ADAMTS13的抗原水平。
1.2.4 统计学方法以SPSS6.0 软件, 以ANOV A进行组间比较检验, 各组结果以⎯x ± s 表示。
2.结果2.1 不同年龄组正常人血浆中ADAMTS13抗原和活性的测定87例健康体检者中， ADAMTS13抗原最低值为60.8 % mU/ml，最高值为141.%，平均值为90.8 ± 24.2%；活性平均值为82.1± 14.8 %，最低值为 46.3%，最高值为119.0%。
正常人群中ADAMTS13抗原及活性均无极端值出现。
不同年龄组人群血浆中ADAMTS13的抗原及活性测定结果见表1及图1。
各年龄组ADMATS13 的活性均值无显著差异；而ADAMTS13抗原量随年龄的改变而改变，21-40岁年龄组达到最高值109.7 ± 23.3 % ，在60岁以上组及低龄组（16-20岁）抗原量显著降低,与21-40岁年龄组相比，差异显著，p<0.01。
表1：不同年龄组正常人血浆中ADAMTS13抗原和活性（⎯x±s）年龄组例数 ADAMTS13活性 %ADAMTS13抗原 %16 - 20 20 80.8 ± 15.9 76.0 ± 12.8△△21 - 40 29 81.1 ± 14.3 109.7 ± 23.341 - 60 15 77.9 ± 16.7 99.3 ± 22.4> 60 23 87.3 ± 12.4 74.5 ± 11.4 △△△△与21-40岁年龄组相比p＜0.01，差异显著。
Fig1: ADAMTS13 antigen and activity in different age groups**与21-40岁年龄组相比p＜0.01，差异显著。
2.2 不同性别组血浆中ADAMTS13抗原和活性的测定ADAMTS13抗原量及活性水平与性别的关系见图2，男性血浆中ADAMT13的抗原及活性水平均分别为87.1 ± 21.9 % 和80.8 ± 14.3 %，低于女性人群（抗原和活性分别为94.7 ±26.8 % 和86.1 ± 17.2 %，但性别间的差异无统计学意义。
Fig. 2 . ADAMTS13 antigen and activity in females and males3. 讨论ADAMTS13活性的改变见于多种生理及病理条件，活性明显降低见于大部分TTP患者（ADAMTS13基因突变或机体产生抗ADAMTS13的抗体），新生儿、肝炎、慢性肾功能不全、急性炎症、外科大手术后及老年人也可见ADAMTA13活性的降低[2]，其活性的增高见于ITP患者[5]。
而ADAMTS13抗原的变化仅见于遗传性及获得性TTP患者[6]。
不同年龄组及性别间ADAMTS13的变化情况国内尚无研究报告。
本研究对不同年龄组及性别间正常人血浆中ADAMTS13抗原和活性进行了测定，结果发现各年龄组ADMATS13 的活性均值无显著差异；而ADAMTS13抗原量随年龄的改变而改变，21-40岁年龄组最高，为109.7 ± 23.3 % ，在60岁以上组及低龄组（16-20岁）显著降低；ADAMTS13的抗原及活性水平在男女性别间无显著差异。
在国际上首次报道了ADAMTS13的抗原与年龄性别的关系，而ADAMTS13活性与年龄的关系也不同于以前国外的报道[2]。
本研究结果之一，ADAMTS13活性与年龄的关系，即各年龄组ADMATS13 的活性无显著差异，不随年龄的增大而降低，不同于国外的报道[2]。
可能的原因有：1. 人种的不同，文献显示，中国汉族人群ADAMTS13的抗原量显著低于高加索人[5]，ADAMTS13 基因的某些多态性分布也不同于西方人群及日本人群[7]；2. 检测方法的不同，ADAMTS13活性检测方法有多种[8]，以前多采用残余胶原结合试验[9]（也采用该法），该法血浆需要置于含尿素的缓冲液中透析, 可能的影响因素较多，故目前国际上多采用方便、重复性好的Frets-VWF73法，即本文采用的检测方法。
本研究的结果，提供了不同年龄段ADAMTS13活性及抗原的范围，排除了性别对ADAMTS13的影响，为ADAMTS13的变化的判断提供依据，也为不同年龄段患者的诊断提供一定的依据，有一定的临床应用价值。
参考文献1. Dong, J.F., Structural and functional correlation of ADAMTS13. Curr Opin Hematol, 2007. 14(3): p. 270-6.2. Mannucci, P.M., et al., Changes in health and disease of the metalloprotease that cleaves von Willebrandfactor. Blood, 2001. 98(9): p. 2730-5.3. Kokame, K., et al., FRETS-VWF73, a first fluorogenic substrate for ADAMTS13 assay. British Journal ofHaematology, 2005. 129(1): p. 93-100.4. Feys HB, L.F., Dong N, Pareyn I, Vauterin S, Vandeputte N, Noppe W, Ruan C, Deckmyn H, VanhoorelbekeK. , ADAMTS-13 plasma level determination uncovers antigen absence in acquired thrombotic thrombocytopenic purpura and ethnic differences. J Thromb Haemost. , 2006. 4((5)): p. 955-62.5. Liu, F., et al., Alteration of ADAMTS13 antigen levels in patients with idiopathic thromboticthrombocytopenic purpura, idiopathic thrombocytopenic purpura and systemic lupus erythematosus. Thromb Haemost, 2006. 95(4): p. 749-50.6. Feys, H.B., et al., ADAMTS-13 plasma level determination uncovers antigen absence in acquired thromboticthrombocytopenic purpura and ethnic differences. J Thromb Haemost, 2006. 4(5): p. 955-62.7. Gao, W.D.L., Su J, Wang ZY, Ruan CG, The frequency of P475S polymorphism in von Willebrandfactor-cleaving protease in the Chinese population and its relevance to arterial thrombotic disorders.Thrombosis and Haemostasis., 2004. 91: p. 1257-1258.8. Tripodi, A., et al., Measurement of von Willebrand factor cleaving protease (ADAMTS-13): results of aninternational collaborative study involving 11 methods testing the same set of coded plasmas. J Thromb Haemost, 2004. 2(9): p. 1601-9.9. Rick, M.E., et al., Clinical use of a rapid collagen binding assay for von Willebrand factor cleaving proteasein patients with thrombotic thrombocytopenic purpura. Thromb Haemost, 2002. 88(4): p. 598-604.Determination of ADAMTS13 antigen and activity levels in different age and gender groups of normal controlDong Ningzheng，Ji Shundong，Ruan Changgeng*Jiangsu Institute of Hematology，The First Affiliated Hospital of Soochow University，Suzhou，Jiangsu（215006）AbstractAim: ADAMTS13 is a metalloproteases regulated for von Willebrand factor multimers (VWF) size in plasma, but there is little knowledge on the behavior of the proteases in many physiological conditions. In this study, we investigated the ADAMTS13 antigen levels and activity in 87 normal controls, and analysis the relations of ADAMTS13 antigen and activity levels with age and gender, provide important knowledge to diagnosis ADAMTS13 related diseases. Methods: ADAMTS13 activity levels were detected by new developed Frests-VWF73 kits, ADAMTS13 antigen levels were analyzed by ELISA kits. Results: In the whole group of 87 healthy control, the range of ADAMTS13 activity is from 46.3% to 119.0%, and antigen is from 60.8% to 141.9%. There is no significant difference of ADAMTS13 acitivity levels in different age groups, but the antigen levels were changed with age, it reached the highest level in the age groups 21 to 40 years (109.7 ± 23.3 %), and it was significant lower in groups old than 60 years and groups 16 to 20 years; Neither antigen levels nor activity levels of ADAMTS13 were different from males and females.Keywards：ADAMTS13；antigen; activity；age；gender。
