方法学验证中各项指标的深度剖析 谢沐风

质量标准中制订有关物质的原则
● 采用杂质对照品法、用于降解产物的准确测定， 如氢氯噻嗪、对乙酰氨基酚等。
● 采用强破坏试验破坏出杂质。如中国药典中的氧 氟沙星所有品种，均在HPLC法的色谱条件下拟 定了：取供试品溶液，置紫外灯下（254nm）照 射4小时以上，使产生的紧邻主峰前的杂质峰与 主峰的分离度应符合规定。
四、检测限
● 信噪比的三倍 —— 纯属“纸上谈兵”， 实际测定中根本用不上。 ● 是相对值，不是绝对值。是相对于供试品 溶液浓度的多少分之一而言，一般至少要在 5000倍以上。
有关物质、含量与自身对照三者浓度的关系
浓 度 进样量 绝对值 相对于样品测定浓度的
最大进样量 50mg/ml 以上 20μl
入1%浓度的杂质对照品，以模拟样品 中有可能存在的状态。
介绍配制方法 —— 先配制杂质贮 备液，再用供试品溶液（或浓的对照 品溶液）来稀释，简便、易行！
存在问题 —— 配制相同浓度，测定 样品时，主成分峰骤然加大，将杂质 峰覆盖。
强破坏试验的目的： 验证药品在遭遇了极端的气候环境 条件下产生的杂质，在所建立的色谱 条件下是否能够分离、测定。
方法学认证中溶液稳定性的全面判定 不能单从主成分入手！ 还要注意所有组分的百分比变化，
绝对值变化！
流速、柱温与溶剂的选择
● 在测定时通常调节流速使主成分保留时间稍长些， 且使主成分峰不拖尾即可。
● 柱温对分离效果的影响虽有一定的影响，但不甚 显著，如有柱温箱，通常设定不超过35℃。
● 溶剂的选择应测定样品溶液在该溶剂中的稳定性 来衡量，尽量勿选择挥发性强的溶剂；同时应保 证对照溶液的主成分峰面积精密度良好。
强力破坏试验
● 水破坏 取原料适量，加水溶解后，在90℃放置24小时。 ● 氧化破坏 取原料适量，用5%过氧化氢溶液溶解后，在 90℃放置24小时。 ● 强碱破坏 取原料适量，用1mol/L氢氧化钠溶液溶解后， 在90℃放置24小时。 ● 强酸破坏 取原料适量，加1mol/L盐酸溶液溶解后，在 90℃放置24小时。 ● 高温破坏 取原料适量，依据各自品种的熔点不同，在高 温下破坏至外观性状改变 ● 强光破坏 取原料适量，置紫外灯下照射48小时。

高效液相色谱法测定有关物质
(4) 测定空白溶剂（梯度洗脱时一定要先行测定）
(5) 每一样品进样一针，对杂质峰进行积分。积分 时注意事项：
最小峰面积：设定为对照溶液主峰面积的1/10-1/50（讲 述原理）
斜率与峰宽：与对照溶液积分参数相同。
技巧：对照溶液稀释后，若主峰面积呈线性（一般均呈 线性），归一化法计算结果与自身对照法测定结果基本一 致（相差在0.02%以内），可用归一化直接观测。
即认为2份对照品溶液配制均无误、且仪器已稳定。
取f均值测定样品。 (2) 样品溶液亦配制2份，每份进样一针，两份百分 含量差值在〒2.0%以内即可。
高效液相色谱法测定含量
(3) 待全部样品检测结束后（无所谓n针，即便运转
了一天、亦无须担忧），任取一份对照溶液回进一 针，计算含量（浓度），应在理论浓度偏差的 〒2.0%以内，便可确保检测过程中仪器性能的稳 定。 (4) 如原方法为内标法，秉承药审中心提出的“仿 产品不是仿标准”理念，一定要改为外标法！除非
残留溶剂研究思路
★ 质量标准拟定原则：如仅残留有重结晶溶剂、
且为低沸点（如乙醇、丙酮等），完全可采用
105℃干燥失重方法予以替代。从而省略掉气相测
定，且干燥失重限度可酌情放宽。
★ 质量标准是一个不断完善的过程：
列举“自套枷锁”、“事倍功半”实例！
列举阿法骨化醇无需研究测定实例！
气相色谱法测定时应注意事项(1)
高效液相色谱法应用时经常出现的问题
※ 柱温箱一定要配制。试验温度建议在30-50℃。 清洗温度可高于试验温度5℃。 ※ 色谱柱清洗：
对于正相、实验结束用流动相再冲洗半小时即可。 对于反相，除非流动相采用单纯的甲醇/乙腈-水，其他所 有流动相皆建议先用纯水冲洗半小时（流速1.0ml/min），再 改用20%甲醇冲洗半小时，随后取下、两头密闭即可。绝不 推荐……

谢沐风 上海市药品检验所 xiemufengsina
一、线性试验
主成分含量测定 以测定浓度为100% ， 50%~120%之间选取5个点即可。
溶出（释放）度测定 以释放量的10%～ 120%间选取5个点即可。
杂质含量用杂质对照品准确测定 以杂质限 度为100% ，50%~120%之间选取5个点即可。
130
120
91708 5.923 0.86
110
100
90
80
70
60
0
2
4
6
10432888 8.410 98.16
160
150
140
130
120
110
59185 14.626 0.56
100
90
80
70
60
8
10
12
14
16
18
20
22
24
m in
时间(h) 0 0.5 1 1.5 2 3
RSD
● 采用自身对照法时，对照溶液与供试品溶液必须 在同一斜率、峰宽下进行积分计算。
● 供试品溶液最小峰面积的设定将直接导致测定结 果。设定得太小，会导致很多小峰甚至是基线漂 移的小峰均被积分出作为杂质峰，从而导致杂质 峰面积增加，易判断为不合格；如设定得过大， 又将反映不出杂质情况。
方法学认证中的耐受性试验 是指更换试验因素，如不同人员、 不同仪器，不同色谱柱型号、厂家， 不同试剂等因素。这一点才是真正至 关重要的！认证时不可能做到这一点， 出现问题时往往要考虑到。
四、检测限
● 信噪比的三倍 —— 纯属“纸上谈兵”， 实际测定中根本用不上。 ● 是相对值，不是绝对值。是相对于供试品 溶液浓度的多少分之一而言，一般至少要在 5000倍以上。

在每个强制条件下降解的主要降解产物进行鉴定一个经验规则是对超过总降解产物10的物质进行鉴定因此如果药物降解10单个降解产物相对主药降解3占总降解产物的30这个降解产物需鉴定或者如果药物降解10单个降解产物相对主药降解08仅占总降解产物的8这个降解产物不需鉴定见phrma的现有指导和最佳实践等文献最近phrma白皮书文件提出了类似方法作为确定强制降解试验中产生的降解产物进行结构鉴定的算法该白皮书结合ichq3a和q3b中的鉴定限给出了强制降解试验中降解产物的鉴定限