药物分析方法的开发与验证

• （3）对于有机酸的碱金属盐，通常采用水-乙醚双相溶剂，用盐酸滴定液滴 定。如苯甲酸钠的含量测定。
• （4）对于易水解的酯类药物，可采用定量过量加入碱滴定液水解后，用酸 滴定液回滴的剩余滴定法。如氯贝丁酯、阿司匹林片的含量测定。
• 示例： 氯贝丁酯(Clofibrate，降血脂药)的含量测定
• 取本品2 g，精密称定，置锥形瓶中，加中性乙醇(对酚酞指示液显中 性)10mL与酚酞指示液数滴，滴加氢氧化钠滴定液(0.lmol/L)至显粉红色，再 精密加氢氧化钠滴定液(0.5mol/L)20mL，加热回流1小时至油珠完全消失， 放冷，用新沸过的冷水洗涤冷凝管，洗液并入锥形瓶中，加酚酞指示液数滴， 用盐酸滴定液(0.5mol/L)滴定，并将滴定的结果用空白试验校正。每1mL氢 氧化钠滴定液(0.5mol/L)相当于121.4mg的C12H15ClO3。
第二法：测定有机弱酸及其盐类（异维A酸、苄氟噻嗪、环吡酮等）
• 第二法：除另有规定外，精密称取供试品适量 [约消耗碱滴定液(0.1 mol/L)8 mL]，加各品种 项下规定的溶剂使溶解，再加规定的指示液 1~2滴，用规定的碱滴定液(0.1 mol/L)滴定。 终点颜色应以电位滴定时的突跃点为准，并将 滴定的结果用空白试验校正。
• 为消除这些酸性物质的干扰，采用两步滴定法：
第一步—中和供试品中的各种酸性杂质，消耗的氢氧化钠量较少，故采用较 稀的碱滴定液(0.1mol/L)
第二步—水解后返滴定，加入定量过量较浓的碱滴定液(0.5mol/L)，进行加热 回流1h，以保证水解完全，并可以准确滴定剩余量。
（三）氧化还原滴定法
• 该法是以氧化还原反应为基础的滴定分析法，既可直接测定具有氧化性或还 原性的物质，又可间接测定不具有氧化性或还原性的物质。

○ A．做空白试验 B．做对照实验 ○ C．做回收试验 D．增加平行测定次数 ○ E．选用多种测定方法
[B型题]
HPLC。
按分离方法分为：PC；TLC；柱色谱；GC；
（一）HPLC法
1. 对HPLC仪器一般要求 色谱柱、流动相按品种项下要求。
色谱柱的理论板数：n = 5.54(tR /Wh/2)2
2. 系统性试验 于1.5

分离度：R = 2（tR1 – tR2)/(W1 + W2); 要大
拖尾因子：T = W /2d 应在0.9 ～
1. 原料药 可用已知纯度对照品或样品进行测定；或与已建准 确
度的另一方法测定的结果进行比较。 2. 制剂 要考察辅料对回收率的影响。采用在空白辅料中加入 原
料对照品的方法作回收率试验，然后计算RSD。 具体做法：测定高、中、低三个浓度，n=3, 共9个数据来评价
回收率的RSD＜2%；用UV和HPLC发时，一般
三．含量测定 常用的方法对照品比较
法:Ci = (Ri-Rib)/(Rr-Rrb) ×Cr
Ch.P收载地高辛片、利血平片、洋地黄毒苷片。
二．荧光分析仪 有二个单
色光器—激发单色光器与
发射单色光
器；且激发光源、样品池和检测器成直 角。
三、色谱分析法
按分离原理分为：吸附；分配；离子交换；排阻色 谱
方法分类
2. 用硫酸水解后测定法 例如：硬脂酸镁的含量测定
Mg(C17H35COO)2 + H2SO4
H2SO4 + 2NaOH
MgSO4 + 2C17H35COOH Na2SO4 + 2H2O
（三）经氧化还原后测定法
COOH
I
I

第三节 药物分析中的有效数字 一、有效数字 （一）定义：分析中，实际能测量到的数字。
根据测定方法和使用仪器的准确程度来确定，只有最
后一位欠准，欠准度为±1。
例: 电子分析天平读数0.3526 滴定管体积读数22.25
2、有效位数确定 （1）0在数据中位置不同，作用不同。
例：1.002---4位，0.0980---3位，2.0×103---2位
第三章 药物分析方法的设计和验证 第一节 药物分析方法的分类和设计 一、分类
常量分析（0.1~1g或10~100mL）
按取样量分
半微量 (10~100mg或1~10mL)
微量分析 微量 (0.1~10mg或10uL~1mL)
超微量(<0.1mg或10uL)
按测定原理与操作方法 分
重量分析法
化学分析法 滴定或容量分析法
一、误差及其分类 （一）绝对误差和相对误差
（二）系统误差和随机误差
1、系统误 差
（1）方法误差
解决方法
（2）仪器和试剂误差 （3）操作误差
对照或空白试验 校正仪器
2、随机误差-----多次平行测定
3、测量结果检验-----方差分析 （t检验、G检验、F检验）
一、准确度和精密度 （一）准确度（Accuracy)
50.11.45 0.281 50.11.4 0.3 51.8
（二）乘除法 以有效数字最少的那个测量值为准（相对误差最大）。
例：0.231× 20.24÷3.2=14.9618 ≈15
三、药物含量测定结果的表达法
测量结果的有效数字的保留取决于仪器的精确度和要求。一 般滴定和重量分析取4位有效数字；仪器分析取3 位有效数字。
实例分析
苯溴马隆

体内药物分析方法验证主要有哪些内容
一、线性度验证
1.直线回归分析：检查溶出物的定量测定结果是否与应用的参考标准物或其它分析方法的结果服从一定的线性关系；
2.拟合度检查：应用样条拟合法拟合出的曲线的 R平方值，该值的要求为r2值大于0.99；
3.加标重现性：检查加标样品与原始样品的定量测定结果之间的差异是否在一定的统计学水平上；
4.偏差检查：计算偏差用于衡量实验测定值与理论参考值之间的差异，如果偏差落入指定范围，则认为测定结果是可靠的；
二、特异性验证
1.特异性检查：检查所开发的测定方法是否对待测药物具有良好的特异性；
2.干扰物检查：应用检测方法对溶出物中相干物、有机溶剂等其他物质的影响检查，其方法包括加标回收率等。

三、稳定性验证
1.热稳定性检查：将待测物加热处理，检查溶出物在热处理后含量大小以及定量分析方法的稳定性；
2.光稳定性检查：检查溶出物对光及其他辐射能线的稳定性；
3.溶出稳定性检查：检查溶出物在多次溶出条件下的稳定性。

2. 验证方法
（1） 含量测定
1）基质无（原料药）/可模拟（制剂）
回收率(%)=
测得量 加入量
100
2）基质不可模拟（制剂、中药）
回收率(%)=
测得量 - 本底值 加入量
100
（2） 杂质检查——方法同2）
2. 验证方法（其他方法）
• 可与已知准确度的另一方法的测定结果比较 ——药典标准方法 / 经过验证的方法
• LOD是一种限度检验效能指标， 反映方法的灵敏度
1 直观法
目视法评价的方法: 化学反应 / TLC ——鉴别的显色法； 杂质检查的TLC
2 信噪比法
3 标准偏差/ 标准曲线
显示信号与噪声水平的方法: HPLC ——S/N=3（2） 时的相应浓度或量
其他分析方法: UV-Vis法
LOD 3.3 / S δ空白响应偏差
含量水平
限度（%）
100 % 10 % 1% 0.1%
98~101 95~102 92~105 90~108
0.01 % 10 g/g （ppm） 1 g/g （ppm） 10 g/kg （ppb）
85~110 80~115 75~120 70~125
（二） 精密度
1. 定义 • 同一均匀供试品多次取样测定 所得结果之间的接近程度 • 相对标准偏差（%， RSD）；
• 也可由所测定的精密度、线性和专属性推算 ——原料药含量HPLC测定法
3. 数据要求 • 9个测定结果（n=9）
3水平×3样品 • 化药：1 ︰ 0.8、1 ︰ 1、1 ︰ 1.2 • 中药: 1 ︰ 0.5、1︰1、1︰1.5
3. 数据要求
样品中被测成分的含量水平 与回收率限度 要求的关系

样品能在足够的氧气中燃烧分解完全样品能在足够的氧气中燃烧分解完全有利于将燃烧分解产物较快地吸收到吸有利于将燃烧分解产物较快地吸收到吸防止爆炸的可能性防止爆炸的可能性26燃烧瓶要洁净不能残留有机溶剂不能用有机润滑剂涂抹瓶塞要有防爆措施氧气要充足确保燃烧完全产物不能有黑色炭化物燃烧产生的烟雾要被完全吸收充分振摇和放置都是为了保证吸收完全例
③要有防爆措施 ④氧气要充足，确保燃烧完全，产物不能有黑色
炭化物 ⑤燃烧产生的烟雾要被完全吸收
充分振摇和放置都是为了保证吸收完全 例：碘产生紫色烟雾；氯、氟产生白色烟雾，烟
雾颜色完全消失后，即表示吸收完全 ⑥测定含氟有机化合物时要用石英燃烧瓶
26
4、应用
含卤素、硫、磷、氟及硒等有机药物的鉴别、杂 质的检查及含量测定
100%
注射剂：标示量％＝
V0
V T 标示量
100%
V VO
T F 标示量
100%
VO : 量取注射剂的体积， ml
36
(2)间接滴定法 1）生成物滴定法
供试品＋试剂 A 化合物 B
化合物 B＋滴定液 C 化合物 D
计量滴定液消耗的量，计算供试品的含量 计算同直接滴定法
37
2）回滴定法（剩余滴定法） 原理：先在待测样品溶液中加定量、过量的滴定
10
（一）湿法破坏
（1） 硝酸-高氯酸法 适用于血、尿、组织等生物样品的破坏，有
机金属药物经破坏后，得到的无机金属离子一 般呈高价态。
本法不能用于含氮杂环药物的破坏
干法灼烧法 11
（2） 硝酸-硫酸法 适用于大多数有机物质的破坏，破坏得到的
无机金属离子均为高价态。 不能用于含碱土金属有机药物的破坏
27
氧瓶燃烧

• Pharmaceutical Analysis
2019/11/5
1
第四章 药物定论量分析与分析方法验证
主 要 内 容
2019/11/5
一、 定量分析样品的前处理方法 二、 定量分析方法特点 三、药品质量标准分析方法验证 四、 生物样品分析方法的基本要求
2
第一节 定量分析样品前处理方法
一、概述
含金属与卤素药物须处理后方可进行测定。
处理方法视结合牢固程度而异。
卤素与芳环相环相连牢固；与脂肪族碳相连 结合不牢固。
含金属药物：金属不直接与碳相连为含金属 的有机药物，不牢固，一般直接测定；金属与碳 原子以共价键相连，结合比较牢固---为有机金 属药物，须适当处理。
2019/11/5
3
含卤素有机药物的分析
T 0.1 1 134.14 3.429(mg/ml) 4
2019/11/5
含量% (VI2 FI 2 -VNa2S2O3 FNa2S2O3 ) T 100 W
40
T M b B(mg/ ml) a
直接滴定法： 含量% V T 100%
W
含量% V T F 100% W
20203241药物分析?pharmaceuticalanalysis20203242一定量分析样品的前处理方法二定量分析方法特点三药品质量标准分析方法验证四生物样品分析方法的基本要求主要内容主要内容论第四章药物定量分析与分析方法验证20203243一概述含金属与卤素药物须处理后方可进行测定
药物分析
I
I
COOH
I
I
NH C (CH2)4 C NH
I
O
O
I
胆影酸

4）加量为生物样本体积的2% 5）难溶药物，适当降低系列标准溶液浓度，蒸干 6）线性模拟的标准曲线5-8点；线性模拟的标准曲线增加 7）标准曲线系列浓度为等梯度，公比为2 2.内标物溶液的配制 1）精称内标物适量，配内标物贮备液 2）精量配贮备液适量，配制内标物标准溶液 3）内标物标准溶液浓度为“标准曲线系列浓度”的中间浓度 3.标准系列模拟生物样品的配制 1）取空白血数份，加入“标准曲线系列浓度”适量（在加入内标液适量），混匀
2）标准系列模拟生物样品高低浓度比1/10-1/20 3）同时配制空白样C=0 4）防止生物基质中加入过多溶剂，干扰测定，可将标准液和 内标液先加到试管中，蒸干后加生物基质 4.标准曲线的绘制 1）以待测物的响应值（A；h）或与内标物的响应值的比（A1/A2；h1/h2）为（y）对浓度（x），回归得y=a+bx及r。绘 制标准曲线。 2）回归分析时在至少7个浓度构成的标准曲线中，至多2个浓度点数据因确切原因“离群”，可剔出，余至少5点数据线性良好。
5.限度要求 1）标准曲线5-8浓度，最高和最低浓度比1/10-1/20 2）回归方程a应近于零，斜率b接近1或大于1，系数R接近1， HPLC R>0.99；生物学法R>0.98。 3）需分区制备标准曲线（最高和最低浓度比>100） 三）准确度 指用该法测得的生物样；样品中待测药物的浓度与其真实浓 度的接近程度。 1.测定法 取空白生物基质数份，照“标准曲线下”配制，至少选标准 曲线的高、中、低3个浓度样品。每个浓度5个平行样，每个 样测定一次。与随行的标准曲线同测定
A:比较待测物的对照品、空白生物基质、模拟生物样品的检测 信号，确证内源性物质对分析物有无干扰 B:比较的内容 Tr；n；TБайду номын сангаасR 2.代谢产物干扰 比较模拟生物样品和实际生物样品的检测信号（Tr；n；T； R），确证代谢产物对分析物有无干扰 3.配伍用药的干扰 A:比较待测药物、同时服用的药物、空白生物样本、待测药物模拟生物样品、待测药物+同时服用的药物模拟生物样品的检测信号

标准偏差
三、专属性 系指在其它成份（如杂质、降解产物、辅料等） 系指在其它成份（如杂质、降解产物、辅料等）可能存在 采用的方法能准确测定出被物的特性。 下，采用的方法能准确测定出被物的特性。 四、检测限（LOD） 检测限（ ） 指试样中被测物能被检出的最低浓度或量。 指试样中被测物能被检出的最低浓度或量。 五、定量限（LOQ） 定量限（ ） 指样品中被测物能被定量测定的最低量， 指样品中被测物能被定量测定的最低量，其测定结果具有 一定的准确度和精密度。 一定的准确度和精密度。 六、线性 系指在设计的范围内， 系指在设计的范围内，测试结果与试样中被测物浓度直接 呈正比关系的程度，相关系数R-->1 ,用软件可得回归方程 用软件可得回归方程. 呈正比关系的程度，相关系数 用软件可得回归方程
VT 含量% = × 100% W
T—滴定度 滴定度;V—消耗滴定液体积 消耗滴定液体积;W—供试品取量 滴定度 消耗滴定液体积 供试品取量 校正因子F: 校正因子 当滴定液浓度与药典中规定浓度不相同时,要校正 要校正: 当滴定液浓度与药典中规定浓度不相同时 要校正 实际摩尔浓度 F= 规定摩尔浓度 在药检部门实验里的试剂瓶子一般不标浓度,而是 值 在药检部门实验里的试剂瓶子一般不标浓度 而是F值. 而是 实际滴定度:T’=TF 实际滴定度
二、光谱分析法 光照在物质上，物质内部发生能级跃迁而产生辐射， 光照在物质上，物质内部发生能级跃迁而产生辐射，利用 光谱进行定性或定量的结构分析称为光谱分析法。 光谱进行定性或定量的结构分析称为光谱分析法。 1、紫外-可见分光光度法（200nm—760nm) 、紫外 可见分光光度法 可见分光光度法（ (1)朗伯 比耳定律 朗伯-比耳定律 朗伯 A=ELC A-吸光度；L-液层厚度；C-溶液浓度；E-吸收系数 吸光度； 液层厚度 液层厚度； 溶液浓度 溶液浓度； 吸收系数 吸光度 （2）百分吸收系数 ）百分吸收系数E 1% 溶液浓度为1%（ 溶液浓度为 （W/V）厚度为 ）厚度为1cm的吸收度 E1cm 的吸收度 A （3）吸收系数法测含量 ） ×D 1% E1cm 含量%= ×100% W × l ×100 A-供试品吸光度；D-供试品稀释倍数； 供试品吸光度； 供试品稀释倍数 供试品稀释倍数； 供试品吸光度 W-供试品取量（标示量）（ ）； 液层厚度（cm） 供试品取量（ ）（g）； 液层厚度（ ） 供试品取量 标示量）（ ）；L-液层厚度

药物分析的方法学验证
药物分析的方法学验证是指针对某一特定的分析方法，通过一系列的实验验证其可行性、准确性、精密度、重复性、稳定性、线性范围、灵敏度、特异性、精确度等性能指标，确保该方法符合要求。

常见的方法学验证包括以下方面：
1.线性范围：检验药物浓度与信号响应之间的线性关系，通常需要使用多个浓度水平进行验证。

2.准确度：准确度是指药物分析方法在测量结果中接近真实值的程度。

比如通过添加标准品或对标，验证测量结果与标准值之间的误差。

3.精密度：精密度指药物分析方法的测量结果在重复性试验中的一致性。

通常使用多次测量同一样品，计算其相对标准偏差（RSD）或方差。

4.稳定性：稳定性是指药物分析方法在一定时间内，分析结果的变异程度。

通常通过长时间存储、变温、光照等实验验证。

5.特异性：特异性是指药物分析方法针对目标分析物的选择性。

通常需要验证该方法能否识别和测量其他可能存在的干扰物质或杂质。

6.检测限和定量限：检测限是指药物分析方法中能够被检测到的最低限度，定量限是指能够准确测量药物浓度的最低限度。

7.精确度：精确度是指药物分析方法在测量结果中的一致性。

通常通过同一样品在不同条件下进行测量，比较测量结果的一致性。

在药物分析中，以上方法学验证通常需要符合某些国际标准或药典规定，如美国药典、欧洲药典、日本药典等。

空白生物基质和模拟生物样品试验——确定的分析方法及其条件 ——不能完全确认是否适合于实际生物样品的测定 ——药物在体内可能与内源性物质结合(如血浆蛋白结合物) 或代谢生成数个代谢产物及其进一步的结合物(或缀合物)
实际生物样品——确立分析方法后，尚需进行实际生物样品的测试
考察目标 ——代谢产物对药物、内标物质的干扰情况 ——进一步验证方法的可行性
——大多采用色谱及其脱线或在线联用技术，如HPLC、LC-MS
毒代动力学——确定新化合药物预期人用剂量水平与其毒性水平之间的安全范围
2018/10/15
7
三、生物样品的类型与预处理方法
生物样品的类型与预处理方法——决定分析方法的应用
以血浆或血清为分析样品 蛋白沉淀 溶剂萃取 ——分析样品较为“干净”，可用HPLC或HPLC-MS检测
新药研发中药物分析 方法建立与验证
袁艳娟 2015.04.17
内容提要
分析方法的设计依据 分析方法建立的一般步骤 分析方法验证的内容与要求 药物分析应用示例
2018/10/15
2
第一节
分析方法的设计依据
建立分析检测方法的主要依据 待测药物的理化性质及在生物体内的存在状况 分析测定的目的与要求 生物样品的类型与预处理方法 实验室条件
2018/10/15
14
(二)分离条件的筛选
在进行分离条件筛选时，应考察生物基质中的内源性物质及代谢 产物对分离与检测的干扰，步骤如下：
1．空白溶剂试验 ——溶剂(方法特异性) 2．空白生物基质试验 —— endogenous compounds(方法特异性) 3．模拟生物样品试验 —— 方法效能指标 4．实际生物样品测试 —— 代谢产物(方法特异性)

对药物研发中分析方法验证的几点考虑2.哈尔滨三联药业股份有限公司，黑龙江省哈尔滨市，150000摘要：受饮食结构和不良生活习惯等多方面因素的影响，现如今疾病越来越多样化和年轻化，给人们的身体健康乃至生命安全造成了极大的威胁。

这就需要加大生物制药研发力度，保证药物生产能够满足人类发展需求。

就目前情况来看，药物的研发与制造与其分析方法验证存在非常紧密的关联，药物分析即对生物材料中的药物成分进行分析，从而为药物制造与临床应用提供指导性意见，其中药品浓度的测定尤为关键，测定结果是否准确对药物临床治疗效果及药物使用的安全性具有极大的影响，和新药的生物利用度及药代动力学之间也存在密切的联系，可见进一步深入研究生物药物分析方法具有十分重要的现实意义。

关键词：药物研发；分析方法；验证；数据1药物分析方法验证的必要性药物分析是生物制药过程中非常重要的一项内容，通过药物分析可以更加清楚了解原料和制剂中所含有的各类药物成分和杂质及其具体含量，实现对药物生产制造质量的有效控制。

除此之外，药物分析还是药物临床应用和体内研究期间生物材料药物含量测定的主要依据，科学合理的药物分析能够更好地保证生物药物使用的安全性。

由此可以看出，生物药物分析工作非常重要，根据实际情况选择最为恰当的分析方法至关重要[1]。

药物分析质量控制是目前应用比较广泛的一种生物药物验证方法，通过科学验证能够判断出药物质量是否合格，同时还可以检验药物的预期效果能够实现。

将这一方法融入生物药物的研发与临床应用中，可以有效保障生物药物的临床用药时效性和安全性，同时也为药物的临床疗效提供了可靠的保障，所以近些年生物药物分析验证受到了社会各界的高度重视。

为了实现对生物药物质量的有效控制，促使药物临床疗效的有效发挥，为人民群众的身体健康提供良好的保障，还需对生物药物生产质量实施必要的检测和验证。

对生物药物分析质量控制工作引起足够的重视，加大药物分析研究与认证力度，在助力我国医疗临床服务水平快速提升的同时，为我国整个医疗行业的发展提供了强有力的支持。

【药物分析方法学验证】分析方法的方法学验证分析方法的方法学验证一、方法验证1．准确度该指标主要是通过回收率来反映。

验证时一般要求分别配制浓度为80％、100％和120％的供试品溶液各三份，分别测定其含量，将实测值与理论值比较，计算回收率。

可接受的标准为：各浓度下的平均回收率均应在98.0%-102.0%之间，9个回收率数据的相对标准差（RSd）应不大于2.0%。

2．线性线性一般通过线性回归方程的形式来表示。

具体的验证方法为：在80％至120％的浓度范围内配制6份浓度不同的供试液，分别测定其主峰的面积，计算相应的含量。

以含量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归分析。

可接受的标准为：回归线的相关系数（R）不得小于0.998，Y轴截距应在100％响应值的2％以内，响应因子的相对标准差应不大于2.0%。

3．精密度1）重复性配制6份相同浓度的供试品溶液，由一个分析人员在尽可能相同的条件下进行测试，所得6份供试液含量的相对标准差应不大于2.0%。

2）中间精密度配制6份相同浓度的供试品溶液，分别由两个分析人员使用不同的仪器与试剂进行测试，所得12个含量数据的相对标准差应不大于2.0%。

4．专属性可接受的标准为：空白对照应无干扰，主成分与各有关物质应能完全分离，分离度不得小于2.0。

以二极管阵列检测器进行纯度分析时，主峰的纯度因子应大于980。

5．检测限主峰与噪音峰信号的强度比应不得小于3。

6．定量限主峰与噪音峰信号的强度比应不得小于10。

另外，配制6份最低定量限浓度的溶液，所测6份溶液主峰的保留时间的相对标准差应不大于2.0%。

7．耐用性分别考察流动相比例变化±5％、流动相pH值变化±0.2、柱温变化±5℃、流速相对值变化±20％时，仪器色谱行为的变化，每个条件下各测试两次。

可接受的标准为：主峰的拖尾因子不得大于2.0，主峰与杂质峰必须达到基线分离；各条件下的含量数据（n=6）的相对标准差应不大于2.0%。

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萃取小柱一次性使用，防止交叉污染！
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固相萃取操作一般有五步：
活化——甲醇/乙腈 润湿小柱，活化填料； 平衡——水或适当缓冲液冲洗平衡小柱； 上样——将样品转移上柱，抽去废液； 淋洗——水或缓冲液最大程度洗去干扰物； 洗脱——用小体积的溶剂将被测物质洗脱下来并收集。
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实际应用中，多是取50uL的血浆，加入500uL的有机溶 剂，涡旋离心后，取上清进样；
若沉淀后，信号相应不好，可尝试更换有机溶剂或者 在沉淀时，加入酸或碱，调节pH值，可能会对结果影 响很大；
常用的酸碱有：盐酸，甲酸，乙酸，氨水等。
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优点：操作简单，为方法开发中最先考虑使用的。
尿液中药物浓度较高，但尿液浓度受尿量的影响，通常变 化较大，应测定一定时间内排入尿中药物的总量。
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5 唾液
唾液中所含成分比较简单，且容 易获得，但是只有少数药物的唾 液浓度和血浆游离药物浓度具有 相关性，实际使用不多，当药物 血浆结合率高的时候，唾液中药 物的浓度极低，很难检测。
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HPLC中化学衍生化法，包括柱前衍生化和柱后衍生化两 种方法。
柱前衍生化分析前尽可能将药物进行提取分离后再衍生 化，防止其他含有相同的功能基团的杂质也被衍生化， 影响分离。柱后衍生化是药物经色谱柱分离之后进行的 ，所以可形成对检测器具有高灵敏度的衍生物。
HPLC法常用的衍生化试剂有邻苯二醛、丹磺酰氯、荧胺 等。
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1.沉淀蛋白
①有机溶剂沉淀法 加入水溶性的有机溶剂，可使蛋白质的分子内及分子间

方法验证的内容与步骤
准确度
通过对比已知浓度的样品测量值 与真实值，评估方法的准确度。
精密度
通过多次测量同一样品，评估方 法的重复性和再现性。
专属性
验证方法是否能够区分目标成分 与其他物质的干扰。
耐用性
验证方法在不同条件下的稳定性 及变化程度。
范围
验证方法适用的浓度范围。
线性
验证方法在一定浓度范围内的响 应是否呈线性关系。
响应值应无明显交叉干扰，能够准确区分目标物质与杂质。
专属性验证结果
根据响应值判断分析方法的专属性是否符合要求。
检测限与定量限验证
检测限与定量限验证方法
逐渐降低样品浓度，观察信号响应值的变化。
检测限与定量限验证要求
检测限和定量限应满足预设的灵敏度要求。
检测限与定量限验证结果
根据信号响应值判断分析方法的检测限与定 量限是否符合要求。
分析方法验证的意义
分析方法验证是确保药物定量分析结果准确可靠的重要手段。通过验证，可以证明所选用 的分析方法适用于该药物的分析，并确保其在各种条件下的稳定性和可靠性。
当前发展状况
随着科学技术的发展，药物定量分析的方法和技术也在不断进步。目前，高效液相色谱法 、气相色谱法和质谱法等先进技术已被广泛应用于药物定量分析中，大大提高了准物质进行多次测定，计算相对标准偏 差（RSD）。
精密度验证要求
RSD应符合预设的接受范围，通常不超过±5%。
精密度验证结果
根据RSD大小判断分析方法的精密度是否符 合要求。
专属性验证
专属性验证方法
采用具有相似结构或相同成分的物质进行测定，比较其响应值。
专属性验证要求
中药有效成分的定量分析
中药是我国传统医学的重要组成部分， 中药有效成分的定量分析对于确保中 药质量和临床疗效具有重要意义。

药物分析的方法学验证所要做到的事项药物分析的方法学验证所要做到的事项（一）新药申报时，药品质量标准中分析方法必须验证；药物生产工艺变更、制剂的组分变更、原分析方法进行修订时，则质量标准分析方法必须进行验证。

分析方法验证不完善是常见的问题。

药物分析检验时药品生产的GMP的药物分析的方法学验证，是保证药物分析结果准确性的前提和基础，也是实现药物分析检测GMP的必然要素。

构成药物分析中的检测方法验证，这要涉及到以下些方面的内容：1、分析方法验证成功的前提条件：（1）仪器已经确认、校正并在有效期内。

（2）经过培训的人员。

（3）可靠稳定的对照品。

（4）可靠稳定的实验试剂。

（5）确认受试溶液的稳定性，在规定时间内无降解。

2、分析方法学验证所要求验证的内容：（1）含量的测定。

（2）杂质的含量测定。

（3）药物的定性鉴定。

（4）药物的含量均匀度测定。

（5）药物的微生物检测。

（6）药物的细菌内毒素的检测。

验证内容：准确度：准确度是指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，用百分回收率表示。

测定回收率R（recovery）的具体方法可采用加样回收试验法来进行测定。

加样回收试验已准确测定药物含量P的真实样品+已知量A的对照品（或标准品）测定，测定值为M。

数据要求:规定的范围内，至少用9次测定结果评价，如制备高、中、低三个不同浓度样品各测三次。

精密度：（重复性、中间精密度和重现性精密度是指在规定条件下，同一个均匀样品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。

用偏差（d）、标准偏差（SD）、相对标准偏差（RSD）（变异系数，CV）表示。

（1）重复性（repeatability:在相同条件下，由同一个分析人员测定所得结果的精密度；在规定的范围内，至少用9次测定结果评价，如制备三个不同浓度样品各测三次或把被测物浓度当作100%，至少测6次进行评价。

（2）中间精密度同一实验室，不同时间由不同分析人员用不同设备所得结果的精密度。

药物分析方法学验证
药物分析方法学验证指的是对药物分析方法学进行验证，以确认其具有可靠性、精确性和准确性等质量特征的过程。

该过程一般包括以下步骤：
1. 确定验证目标和既定准则：包括确定药物分析方法的目标、参数、特性以及有效性、准确性等的既定标准。

2. 设计验证方案：根据既定标准，设计验证方案，确定验证的样品、测试条件、测试参数等。

3. 进行验证实验：根据验证方案，进行验证实验，记录数据，以确定药物分析方法的性能能否符合既定标准。

4. 分析和评价结果：对比验证数据和既定标准，评价药物分析方法的可靠性、精确性和准确性等质量特征。

5. 确定结论和建议：根据分析和评价结果，给出结论和建议，确定药物分析方法在实际应用中的适用性和可信度。

药物分析方法学验证是保障药品质量和安全的重要手段，其结果能够提供对药品质量的保障，对药品生产和使用具有重要的现实意义。