HPLC原理和操作详解

hplc原理及操作高效液相色谱分析法(HPLC）是一种以溶剂梯度对样品进行分离和测定的方法。

系一种以压力作为体系内物质运动活动的发动力，以色谱柱为分离器件，以固定及或变量流速溶液作为流动介质的技术。

HPLC的工作原理：样品以溶剂梯度的方式从高压柱头处潜入并向柱底流动，溶质在～20MPa的高压力下正常行驶。

溶质有一定的分馏程度，有分子大小及分子形状的分离和鉴定，其中含有高度纯化的物质结构体，具有极高的灵敏度和准确性，因此常用于检测化学品、药物、农药、食品等样品。

结合柱色谱技术进行分离分析，以溶剂分馏样品中多种物质，基于它们在色谱柱中的不同以及相同的拖动力，从而实现分离和测定。

被分离的分子是从色谱柱进入注入支路的溶质的部分种类，当经过偏光器后，各种物质会被它们所产生的信号鉴定出来，这样就实现找出溶质的分子类型，同时还测定它们出现的百分比以及分析速度等工作。

HPLC仪器由4个基本构成部分：检测器、泵系统、色谱柱和控制系统组成。

1. 检测器：配合色谱柱，根据每个溶质所产生信号进行检测；2. 泵：将溶剂柱体内的样品系流动；3. 色谱柱：负责充当样品分离器；4. 控制系统：控制泵的运转，优化溶剂梯度；并计算并显示每个溶质的信号强度及分离程度等。

HPLC操作：1. 把样品溶于洗涤液中，常用的洗涤液为醇型或水型溶剂。

2. 向色谱柱中倒入洗涤液，使用含具有良好紫外将固定流出，色谱柱中的柱管把不同溶质分开，当柱管中的溶质流出到气体室后，可以改变溶质流量，调节溶质含量或检查特定溶质含量。

3. 启动泵，通过泵向色谱柱内加入溶剂，洗洗涤液渗入样品柱体，梯度洗液流动在柱体内，也可以用不同比例的液体梯度来分离多种溶质；4. 启动检测器，可以看到溶质的表象，根据每个溶质产生信号的特征及强度，确定物质含量以及分析速度等参数，最终得出相应结果；5. 用计算机系统分析数据，根据植测所需，进行图象与数据处理，以及报告和图表的生成等。

HPLC分析法是一种表征分子大小及它们的特征的分离技术，是一种灵敏、用于样品分析的高精度的技术手段。

HPLC高效液相色谱仪工作原理操作、维护
要点的梳理总结
HPLC（高效液相色谱）是一种常见的分析仪器，用于分离、鉴定和定量分析化合物。

下面是HPLC高效液相色谱仪的工作原理、操作和维护要点的梳理总结：
工作原理：
1. 样品通过高压注射器注入进入液相色谱柱，柱内填充有固定相（如硅胶或离子交换树脂），流动相（溶剂）通过柱子，样品中的化合物在不同的固定相上有不同的分配系数，从而被分离出来。

2. 分离后的化合物通过检测器进行检测，检测器将化学信号转换为电信号，然后通过数据系统进行数据处理，得到化合物的保留时间、峰面积等信息。

操作要点：
1. 准备工作：检查仪器是否正常工作，准备好样品，选择合适的溶剂进行样品制备和提取。

2. 启动仪器：启动仪器，调节流速、温度等参数，使其达到预设值。

3. 注入样品：通过注射器注入样品，注意控制注入速度和量。

4. 运行分析：启动色谱柱和检测器，开始进行分析。

5. 数据处理：通过数据系统对分析结果进行数据处理，得到化合物的保留时间、峰面积等信息。

维护要点：
1. 定期清洁和维护仪器：定期清洁仪器，更换滤芯和柱子，保证仪器的正常工作。

2. 定期校准仪器：定期对仪器进行校准，保证分析结果的准确性。

3. 注意安全操作：在操作过程中应遵守安全规范，避免意外事故发生。

4. 储存样品：储存样品时应注意保存条件，避免样品变质或污染。

总之，HPLC高效液相色谱仪的工作原理、操作和维护要点都需要认真掌握，才能保证分析结果的准确性和仪器的正常工作。

附录---HPLC原理及方法简介I．概论一、液相色谱理论发展简况色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。

又称为色层法、层析法。

色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法(Chromatography)因之得名。

后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。

液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。

高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。

它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。

又因分析速度快而称为高速液相色谱法(High Speed Liquid Chromatography，HSLP)。

二、HPLC的特点和优点HPLC有以下特点：高压——压力可达150-300 Kg/cm2。

色谱柱每米降压为75 Kg/cm2以上。

高速——流速为0.1-10.0 mL/min。

高效——可达5000塔板每米。

在一根柱中同时分离成份可达100种。

高灵敏度——紫外检测器灵敏度可达0.01 ng。

同时消耗样品少。

HPLC与经典液相色谱相比有以下优点：速度快——通常分析一个样品在15-30 min，有些样品甚至在5 min内即可完成。

分辨率高——可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。

高效液相色谱的工作原理及操作注意事项高效液相色谱的工作原理及操作注意事项一、高效液相色谱的工作原理高效液相色谱（HPLC）是一种常用的分离和分析技术，主要应用于化学、生物、医药等领域。

其工作原理是利用不同物质在固定相和移动相之间的分配平衡，实现对待测组分的高效分离。

以下是高效液相色谱的工作原理：1.流动相：高效液相色谱中的流动相也称为溶剂或载体，是携带待测组分通过色谱柱的介质。

流动相的选择应根据样品的性质、检测器的类型以及分离效果等因素进行选择。

2.固定相：高效液相色谱中的固定相是色谱柱中的填料，通常是涂布在硅胶或氧化铝等载体上的高分子聚合物。

不同物质根据其在固定相和流动相之间的分配系数进行分离。

3.洗脱过程：在高效液相色谱中，待测组分随流动相通过色谱柱，经过固定相和流动相之间的分配平衡实现分离。

分离后的组分会按照其在固定相和流动相之间的分配系数依次流出色谱柱，进入检测器进行检测。

4.检测器：高效液相色谱中使用的检测器根据待测组分的性质和检测要求进行选择，常见的有紫外-可见光检测器、荧光检测器、电导检测器等。

检测器的作用是将组分的浓度转化为可测量的电信号，以便进行记录和分析。

二、高效液相色谱的操作注意事项在使用高效液相色谱进行实验操作时，需要注意以下事项：1.样品准备：在进行高效液相色谱分析前，需要对样品进行必要的处理和制备。

应尽可能避免样品中的杂质和干扰物质对分离和分析的影响。

同时，样品的浓度应适中，以避免色谱柱过载或检测器过载。

2.流动相选择：流动相的选择对高效液相色谱的分离效果和分析结果至关重要。

应根据样品的性质、实验要求以及分离效果等因素选择合适的流动相。

同时，应注意流动相的纯度和稳定性，以保证实验结果的可靠性。

3.色谱柱选择：高效液相色谱中使用的色谱柱是分离和分析的关键元件。

应根据样品的性质、待测组分的类型以及分离要求等因素选择合适的色谱柱。

同时，应注意色谱柱的粒径、孔径和填料性质等参数，以确保达到最佳的分离效果。

仪器分析高效液相色谱法高效液相色谱法（HPLC）是一种常用的仪器分析方法，广泛应用于化学、药学、环境科学、食品科学等领域。

本文将介绍HPLC的原理、仪器组成、操作步骤以及应用领域。

HPLC的原理是利用样品在液态流动条件下在固定相上的分配行为进行分离和定量分析。

相比于传统的色谱法，HPLC具有操作简便、分离效果好、灵敏度高等优点。

HPLC的仪器组成主要包括溶液配制系统、进样系统、柱温控制系统、分离柱、检测器和数据处理系统。

其中，溶液配制系统主要用于调配流动相，进样系统用于将样品注入分离柱，柱温控制系统用于控制柱温度，分离柱用于实现样品的分离，检测器用于检测样品，数据处理系统用于处理和分析检测结果。

HPLC的操作步骤如下：1.首先，需要根据需要选择合适的固定相和流动相，然后将固定相充填到分离柱中。

2.将样品溶解于合适的溶剂中，并按照一定的稀释比例稀释溶液。

3.将稀释后的溶液注入进样器中。

4.打开柱温控制系统，设置合适的柱温。

柱温的选择应考虑到样品的性质以及分离柱的要求。

5.打开溶液配制系统，调配合适的流动相，并将流动相以一定的流速通过分离柱。

6.启动检测器，并设置适当的检测波长和灵敏度，以便对样品进行检测。

7.数据处理系统会自动记录检测结果，并进行相应的数据处理和分析。

HPLC广泛应用于化学、药学、环境科学、食品科学等领域，常见的应用包括药物分析、环境污染物检测、食品成分分析等。

例如，可以利用HPLC对药物中的成分进行分离并进行定量分析，以保证药物的质量和疗效。

在环境科学中，HPLC可以用于检测空气、水体和土壤中的有机污染物。

在食品科学中，HPLC可以用于检测食品中的残留农药、添加剂和重金属等。

总之，HPLC是一种常用的高效仪器分析方法，通过流动相在固定相上的分配行为实现样品的分离和定量分析。

由于其操作简便、分离效果好、灵敏度高等优点，成为化学、药学、环境科学、食品科学等领域中不可或缺的分析工具。

_HPLC基础高效液相基本原理和使用方法HPLC（高效液相色谱）是一种分离和分析化学品的常用技术。

它通过将需要分离的化合物溶解在流动相中，然后在高压马达的驱动下，将混合物通过填充了固定相的柱子，利用固定相与流动相间的相互作用来分离混合物中的成分。

HPLC主要由柱子系统、流动相系统、检测系统和数据处理系统组成。

HPLC的基本原理是通过不同样品成分与固定相之间的相互作用来分离化合物。

固定相可以是各种各样的填料，如硅胶、C18烷基硅胶等。

当样品进入柱子时，各个成分会以不同的速度进行吸附和解吸，从而分离出各组分。

流动相系统是HPLC中的重要部分，它主要负责将混合物带入柱子和在柱子中移动。

流动相可以是无机溶液，也可以是有机溶剂与无机溶液的混合物。

常见的流动相包括水，甲醇，乙酸和醋酸等溶液。

检测系统用于检测流出柱子的化合物并生成信号。

HPLC的常见检测器包括紫外-可见光谱检测器（UV-Vis）和荧光检测器。

它们通过测量样品在不同波长下的吸收或荧光发射来定量分析各个组分。

数据处理系统用于接收和处理从检测系统获得的信号。

它可以通过线性回归方法将信号转换成样品浓度，并通过柱子排列和峰面积积分来确定样品中各成分的含量。

在使用HPLC之前，首先要准备样品。

样品的制备涉及样品的提取、纯化和浓缩等步骤。

样品提取方法的选择取决于所分析样品的性质和所需分离的化合物类型。

接下来，需要准备流动相。

选择适当的流动相是成功分析的关键。

流动相的选择根据所需分离的化合物种类，以及固定相和样品的亲疏水性来确定。

然后，选择适当的柱子。

柱子的选择取决于分析目标和分离条件。

HPLC柱子的尺寸和填料类型会影响分析的时间和分离的效果。

之后，需要设置检测器，并根据所需分析的化合物选择合适的检测器。

对于紫外-可见光谱检测器，需要选择合适的波长以提高灵敏度和分辨率。

在实际操作中，还需要考虑一些其他因素。

例如，设置压力和流速以控制样品在柱子中的流动速度。

还需要进行一些温度调节，以确保溶剂和柱子的稳定性。

高效液相色谱我国药典收载高效液相色谱法项目和数量比较表：鉴于HPLC应用在药品分析中越来越多，因此每一个药品分析人员应该掌握并应用HPLC。

I．概论 (2)一、液相色谱理论发展简况 (2)二、HPLC的特点和优点 (2)三、色谱法分类 (3)四、色谱分离原理 (3)II．基本概念和理论 (5)一、基本概念和术语 (5)二、塔板理论 (8)三、速率理论（又称随机模型理论） (9)III．HPLC系统 (10)一、输液泵 (11)二、进样器 (13)三、色谱柱 (14)四、检测器 (17)五、数据处理和计算机控制系统 (20)六、恒温装置 (20)IV．固定相和流动相 (20)一、基质（担体） (20)二、化学键合固定相 (22)三、流动相 (23)1．流动相的性质要求 (23)2．流动相的选择 (24)3．流动相的pH值 (24)4．流动相的脱气 (25)5．流动相的滤过 (25)6．流动相的贮存 (26)7．卤代有机溶剂应特别注意的问题 (26)8．HPLC用水 (26)V．HPLC应用 (27)一、样品测定 (27)二、方法研究 (27)附件：高效液相色谱法（HPLC）复核细则 (28)一、对起草单位的要求： (28)二、对复核单位的要求： (28)I．概论一、液相色谱理论发展简况色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。

又称为色层法、层析法。

色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法(Chromatography)因之得名。

后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。

液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。

分析化学高效液相色谱法高效液相色谱法（HPLC）是一种分离和测定化学物质的重要分析方法，具有高分离效率、高灵敏度、宽线性范围和广泛的应用范围等优点。

下面将从仪器原理、工作原理和应用等方面对HPLC进行详细分析。

一、仪器原理：HPLC仪器主要由溶剂系统、进样器、柱温箱、液相分离柱、检测器和数据处理系统等组成。

1.溶剂系统：通常采用双头柱泵供应稳定的流动相。

溶剂通过比例调节阀混合形成所需的溶剂混合物。

2.进样器：它将少量的样品溶液注入到流动相中，通常使用自动进样器进行样品进样。

3.柱温箱：控制流动相的温度，以提高分离的效果。

柱温一般在室温到高温之间进行控制。

4.液相分离柱：是HPLC的核心部分，其中填充有液相固定相。

根据不同的分析目标和样品性质，可以选择不同类型的液相柱，如反相色谱柱、离子交换柱等。

5.检测器：常见的检测器有紫外-可见光谱检测器（UV-VIS）、荧光检测器、折射率检测器等。

根据不同化学物质的性质和要求，可以选择不同的检测器。

6.数据处理系统：包括记录和处理仪器所得到的信号。

常见的数据处理系统有计算机数据采集系统，可以进行数据的分析和处理，生成相应的色谱图。

二、工作原理：HPLC通过运用固定相与移动相之间的亲疏水性差异来实现化学物质的分离。

样品在液相中与固定相发生相互作用，不同化合物的相互作用程度不同，因此在液相中呈现出不同的流动速度。

根据样品分离的顺序，不同的化合物在一定时间内通过液相分离柱，进而被检测器检测到。

HPLC中的流动相一般由溶剂和缓冲液组成，并通过色谱柱中的固定相将待测试的物质分离开来。

其中，缓冲液（通常称为背后电解质）可以调节流动相的pH值，改变待测试物质的性质，从而影响其分离。

三、应用：HPLC广泛应用于药物分析、环境监测、食品安全和生化分析等领域。

1.药物分析：HPLC可以用于药物分析中，以检测药物的含量、纯度和杂质成分。

药物的测定可以通过校准曲线来进行分析。

2.环境检测：HPLC可以用于环境监测中，例如水质分析、大气污染物分析等。

高效液相的原理及应用一、高效液相(HPLC)的原理高效液相（High Performance Liquid Chromatography，简称HPLC）是一种常用的色谱分析方法，在化学、生物科学、环境科学等领域广泛应用。

它基于样品溶解于液相并通过液相与固定相之间的相互作用来分离和分析混合物中的化合物。

HPLC的原理主要有以下几个关键步骤：1.样品注射：待分析的混合物溶解在液相中，通过进样器注射到色谱柱中。

2.固定相选择：色谱柱中填充有固定相，通常使用高效液相色谱填料（如石英砂、硅胶等）或者小颗粒的吸附剂（如C18等）。

3.溶剂流动：通过色谱柱的溶剂流动来传递样品和溶液。

4.组分分离：样品的成分在固定相上通过不同的物理或化学作用进行分离。

5.检测器检测：通过检测器对分离出的化合物进行检测，如紫外线检测器、荧光检测器等。

6.数据分析：将检测到的信号传输到计算机上进行数据分析和处理，得到分析结果。

HPLC的原理可以分为几个方面的因素影响，包括溶剂的选择、固定相的性质、温度等。

根据样品的性质和分析目的，可以调整上述因素以实现最佳的分离效果。

二、高效液相的应用高效液相在不同领域有着广泛的应用，以下列举其中几个方面的应用：1. 药物分析高效液相在药学领域中常被用于药物分析。

通过HPLC可以对药物的含量、纯度、杂质等进行准确测定，为药物的研发、生产和质量控制提供重要的数据支持。

例如，HPLC可以用于检测特定药物在血液中的浓度，帮助医生根据药物在体内的代谢特点来调整给药剂量，从而提高治疗效果。

2. 食品安全高效液相在食品安全领域中也具有重要应用。

通过HPLC可以对食品中的添加剂、农药残留、重金属等有害物质进行快速、准确的检测。

例如，HPLC可以用于测定食品中的亚硝酸盐含量，以判断食品是否满足卫生标准。

此外，HPLC还可以对食品中的营养成分进行分析，用于评估食品的营养价值。

3. 环境分析高效液相在环境科学领域也有着广泛的应用。

高效液相色谱我国药典收载高效液相色谱法项目和数量比较表：鉴于HPLC应用在药品分析中越来越多，因此每一个药品分析人员应该掌握并应用HPLC。

I．概论 (2)一、液相色谱理论发展简况 (2)二、HPLC的特点和优点 (2)三、色谱法分类 (3)四、色谱分离原理 (3)II．基本概念和理论 (5)一、基本概念和术语 (5)二、塔板理论 (8)三、速率理论（又称随机模型理论） (9)III．HPLC系统 (10)一、输液泵 (11)二、进样器 (13)三、色谱柱 (14)四、检测器 (17)五、数据处理和计算机控制系统 (20)六、恒温装置 (20)IV．固定相和流动相 (20)一、基质（担体） (20)二、化学键合固定相 (22)三、流动相 (23)1．流动相的性质要求 (23)2．流动相的选择 (24)3．流动相的pH值 (24)4．流动相的脱气 (25)5．流动相的滤过 (25)6．流动相的贮存 (26)7．卤代有机溶剂应特别注意的问题 (26)8．HPLC用水 (26)V．HPLC应用 (27)一、样品测定 (27)二、方法研究 (27)附件：高效液相色谱法（HPLC）复核细则 (28)一、对起草单位的要求： (28)二、对复核单位的要求： (28)I．概论一、液相色谱理论发展简况色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。

又称为色层法、层析法。

色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法(Chromatography)因之得名。

后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。

液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。

液相色谱实用技术(一) HPLC定量原理及方法液相色谱定量分析的基本原理❀在定性的基础上定量,需有纯物质作为标准物❀液相色谱定量是相对定量的方法:即由已知量的纯被测物标样推算混合物中被测物的量❀液相色谱法定量的依据是:✎被测组分的量与响应值(峰高或峰面积)成正比✎由已知量的标样可求得定量校正因子✎定量校正因子:是定量计算公式中的比例常数,其物理意义是单位响应值(峰面积)所代表的被测组分的量✎测定未知组分的响应值,通过定量校正因子即可求得其含量液相色谱定量分析的基本步骤❀开发一个适合定量分析的色谱方法:确认被检测组分峰,并达到分离度(R)大于1.5确定被测组分色谱峰的一致性确定方法的检测限及定量限;灵敏度及线性范围❀用不同浓度的标准样品建立校正曲线❀考查定量方法的准确度及精密度❀用M32色谱管理系统实施样品采集,数据处理及报告结果鉴别需定量的色谱峰(定性)❀定性鉴别每个要定量的色谱峰✎通过比较保留值(通常是保留时间)的方法,找到各色谱峰所对应的组份✎大多数情况下用与标样比较保留时间来定性❀即所谓：➀保留时间相同，可能是同样的组份➁保留时间不同，肯定不是同样的组份用保留时间定性❀用“标样”的保留值定出被测组份的位置0.000.050.100.150.200.250.300.350.400.000.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.507.00AUMinutesUracilEthylparabenPropylparaben进一步的确认(定性)❀标准加入❀同时用其他方法✎其他色谱方法（改变机理，如：用不同的色谱柱）✎其他检测器➠PDA，光谱图比较、谱库检索➠MS，质谱图解析、谱库检索✎其他仪器方法标准加入法举例❀废水样品中五氯苯（PCP）的分析梯度曲线梯度曲线PCP 4 ppm 3 ppm 2 ppm 1 ppm确认定量峰的一致性❀确认色谱峰的纯度✎保证每个色谱峰下只有一个被测的组份✎检查是否有共流出的物质（杂质）干扰❀色谱峰纯度确认的方法✎用光电二极管矩阵(PDA)检测器比较光谱图✎峰纯度鉴定,2487双波长RatioPlot✎996的纯度角理论色谱峰定性中常见问题❀鉴定色谱峰(定性)时常见问题如下:✎被鉴定峰丢失✎色谱图中出峰比预想的少✎色谱图中出峰比预想的多(鬼峰)色谱峰定性中常见问题分析❀被鉴定峰丢失✎保留时间改变✎数据处理系统中输入值不正确❀色谱图中出峰比预想的少✎样品分解✎色谱柱分辨率丧失✎用错流动相✎梯度洗脱时平衡不足(例如,过早将手动进样器扳至(Load)位置色谱峰定性中常见问题分析(续)❀色谱图中出峰比预想的多(鬼峰):✎样品分解或制样时导入了杂质✎流动相被污染,或用错流动相✎流动相中含有稳定剂或稳定剂发生变化✎前次进样的后流出物(某些RT值特大的组分)✎进样器被污染,洗针系统出问题或注射器脏✎未充分平衡进样器Loop管✎保护柱脏,色谱柱被污染,分辨率下降HPLC定量分析的常用术语(1)❀样品(Sample):含有待测物,供色谱分析的溶液❀样品类型(Sample Type)分为标样和未知两种:标样(Standard) : 浓度已知的纯品;未知样(Unknow):浓度待测的混合物❀样品量(Sample Weight):待测样品的原始称样量❀稀释度(Dilution):未知样品的稀释倍数❀组分(Componance):欲做定量分析的色谱峰,即含量未知的被测物❀组分的量(Amount):被测物质的含量(或浓度)HPLC定量分析的常用术语(2)❀积分(Integrity):由计算机对色谱峰进行峰面积测量的计算过程❀定量限:可以准确定量的样品最低量,一般要求色谱峰的S/N＞10:1❀校正曲线(Calibration Curve):组分含量对响应值的线性曲线,由已知量的标准物建立,用于测定待测物的未知含量常用的定量方法❀标准曲线法,分为外标法和内标法:❀外标法✎在液相色谱中用得最多❀内标法✎准确，但是麻烦✎在标准方法中用得最多外标法定量❀配制一系列已知浓度的标样储存标样工作标样01234增加溶质的浓度外标法定量（二）❀采集不同浓度标样的色谱图❀积分,按外标法定量计算,建立标准曲线05010015020025001,0002,0003,0004,0005,000样样样样响应值峰面积()标准曲线0.000.050.100.150.200.250.300.000.501.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.006.507.00M in u t e s0.000.050.100.150.200.250.300.000.501.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.006.507.00M in u te s 0.000.050.100.150.200.250.300.000.501.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.006.507.00M in u t e s外标法定量（三）❀计算公式❀特点✎无需各组份都被检出、洗脱✎需要标样✎标样及样品测定的条件要一致✎进样体积要准确iX i i i X A RF C X R X C RF i i 样品响应值未知组分的浓度∶标样响应值标样浓度校正因子∶×==)()()()(内标法定量（一）❀配制一系列浓度的标样，其中加有内标样储存标样+ 储存内标样工作标样01234增加溶质的浓度内标样浓度不变内标法定量（二）❀采集不同浓度标样的色谱图❀积分,按内标法定量计算,建立标准曲线0.000.200.400.600.801.001.201.401.601.80 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00v o lts M in u te sM e th ylP a ra b e n E th y lP a ra b e n P ro p y lP a ra b e n B u ty lP a ra b e n 05010015020025001020304050样样样样标样峰面积内标样峰面积标准曲线内标法定量（三）❀计算公式：❀特点：✎无需各组份都被检出、洗脱✎需要标样，需要内标样✎结果与进样体积无关..)()()()().(s i i X i i i X A A RF C X C X R S I R RF i i 内标峰面积样品峰面积未知组分的浓度∶标样浓度标样响应值内标样响应值校正因子∶×=×=内标法定量（四）❀对内标物的要求✎化学结构与待测组分相似(同系物、异构体)✎在样品中不存在✎不与样品中组份发生任何化学反应✎保留值与待测组分接近✎浓度（响应值）与待测组分相当✎其色谱峰与其它色谱峰分离好定量分析的数据处理方法❀Millennium 32包含外标和内标法计算的程序❀处理结果自动存贮至Project 的Result 中❀M 32定量处理的程序如下:✎调用标样(Standard Standard)的色谱图,在“向导”(Wizard Wizard)的指引下建立一个处理方法(Processing Method Processing Method),将欲定量的峰填入组分表中✎在Project 的Channal 菜单中,选中欲进行定量计算的有关数据文件(按标准standard 在前,未知Unknown 在后的顺序),给标样组分表中的各组分填入Amount 值并存贮Save 之✎按动工具条中的Process 处理器,则软件自动处理并保存结果定量分析的数据处理方法(续)打开一个最低浓度的标样(类型为Standard)色谱图,建立处理方法(Processing Method)定量分析的数据处理方法(续)用建立的处理方法计算欲定量的样品定量分析的数据处理方法(续)在Project的Result标签下,观察并报告定量结果液相色谱定量的精密度❀测量的精密度好的精度不好的精度精密度的衡量❀ 测量精密度的计算)100(X%12)(X σσ=−å−=å=CV N X i X Ni X 变异系数∶标准偏差∶平均值∶液相色谱定量的准确度❀误差∶✎E = O - T➠O∶观测到的值➠T∶真值准确度的衡量❀色谱方法是相对定量方法，如不考虑损失及杂质干扰等因素，其结果同“标样”的准确程度密切相关❀一般的衡量方法是做回收率实验或不同方法之间的比较：相关系数❀相关系数：➠其中，X 及Y 分别代表不同方法的实验值及平均值åå−−−−=22)()())((Y Y X X Y Y X X r i i i i准确度的影响因素❀峰面积的测量精度(积分误差)❀校正因子的测量精度(标准曲线的r2)❀样品的稳定性和代表性,均匀性(样品是否溶于流动相)❀进样器的准确度,进样技术❀色谱方法的可靠性(保留时间的重现性)❀色谱泵的精确度（GPC的影响更大）❀检测器的灵敏度,线性范围,检测限进样技术对定量结果的影响❀固定体积定量管（loop）的进样器精度最好，其准确度取决于进样器的结构❀可变体积进样器的精度取决于操作者的技术，准确度通常更高，因为进样用的注射器结构的准确度高，操作者的技术水平也有影响，但不大❀717及2690自动进样器精确度及准确度都可达到定量管进样器的水平，因为其每一微升分27步以上。

HPLC原理及基本操作HPLC（高效液相色谱法）是一种广泛应用于分析化学和制药工业中的分离技术。

它基于液相色谱法，通过将样品溶解在流动相中，并通过固定填料进行分离和分析。

1.样品的溶解：样品通常是固体或液体，在HPLC中需要将其溶解在流动相中。

流动相可以是水、有机溶剂或它们的混合物。

2.固定相填料的选择：HPLC中的填料通常是高度吸附性和具有大表面积的细小颗粒。

这些颗粒被填充在色谱柱中，提供了分离和分析的平台。

3.流动相选择：流动相的选择取决于样品的性质和目标分析的目的。

流动相的成分和配比可以根据需要进行调整，以改变分离效果和分辨率。

4.注射样品：将样品通过注射器引入HPLC系统，注射器将样品推入色谱柱中。

5.流动相的微量泵：流动相的微量泵非常重要，它通过控制流动相的流速将样品推过填料。

6.色谱分离：样品在填料中根据其亲水性（亲水性成分被保留在固定相上，疏水性成分则被推至溶剂流动相）进行分离。

固定相越亲水，则与样品中的亲水性成分相互作用越强；固定相越疏水，则与样品中的疏水性成分相互作用越强。

7.检测器：色谱柱的末端通常装有检测器，用于检测样品溶液中目标化合物的浓度。

8.数据处理：使用计算机系统分析检测器输出的图形数据，然后计算和解释结果。

HPLC基本操作：1.准备样品：将样品溶解在适当的溶剂中。

2.准备色谱柱：将填料装入色谱柱中，并使其适当压实。

3.连接色谱柱：将装有填料的色谱柱连接至HPLC系统。

4.设置流动相：根据需要设置流动相的组成和配比，通过微量泵提供流动相。

5.设置检测器：根据需要设置检测器，选择适合目标化合物的检测方法。

6.注射样品：使用自动或手动注射器将样品引入HPLC系统。

7.运行分析：通过微量泵控制流速，运行HPLC系统使样品通过色谱柱，分离和分析目标化合物。

8.数据处理：使用计算机系统分析检测器输出的图形数据，进行峰面积计算、峰高定量等数据处理。

9.结果解释：根据分析结果解释样品中的目标化合物的存在和浓度。

高效液相色谱我国药典收载高效液相色谱法项目和数量比较表：鉴于HPLC应用在药品分析中越来越多，因此每一个药品分析人员应该掌握并应用HPLC。

I．概论 (2)一、液相色谱理论发展简况 (2)二、HPLC的特点和优点 (2)三、色谱法分类 (3)四、色谱分离原理 (3)II．基本概念和理论 (5)一、基本概念和术语 (5)二、塔板理论 (8)三、速率理论（又称随机模型理论） (9)III．HPLC系统 (10)一、输液泵 (11)二、进样器 (13)三、色谱柱 (14)四、检测器 (16)五、数据处理和计算机控制系统 (20)六、恒温装置 (20)IV．固定相和流动相 (20)一、基质（担体） (20)二、化学键合固定相 (22)三、流动相 (23)1．流动相的性质要求 (23)2．流动相的选择 (24)3．流动相的pH值 (24)4．流动相的脱气 (25)5．流动相的滤过 (25)6．流动相的贮存 (26)7．卤代有机溶剂应特别注意的问题 (26)8．HPLC用水 (26)V．HPLC应用 (27)一、样品测定 (27)二、方法研究 (27)附件：高效液相色谱法（HPLC）复核细则 (28)一、对起草单位的要求： (28)二、对复核单位的要求： (28)I．概论一、液相色谱理论发展简况色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。

又称为色层法、层析法。

色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法(Chromatography)因之得名。

后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。

液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。

HPLC原理及应用HPLC（高效液相色谱，High Performance Liquid Chromatography）是一种广泛应用于生物化学、化学分析、制药、环境监测等领域的分离和分析技术。

HPLC技术基于液相色谱的原理，通过样品在液相中的溶解和分配，以及与固定相之间的相互作用来实现样品分离和分析。

HPLC的原理可以用以下步骤来解释：1.选择操作的液相：液相通常是一种极性溶剂，如水和有机溶剂的混合物。

液相的选择取决于样品的特性，以及所需的分离和分析目标。

2. 选择适当的固定相：固定相通常是一种多孔性材料，如硅胶或Reverse Phase材料。

固定相上的化学性质确定了与样品相互作用的方式。

固定相可以选择性地吸附和解吸样品，从而实现样品分离。

3.通过色谱柱进行分离：样品溶液通过色谱柱，其中装有固定相。

随着样品在柱中的运动，不同成分根据其与液相和固定相之间的相互作用，以不同速率通过柱，从而实现分离。

4.检测和记录分离的成分：通过检测器检测分离后的成分。

常见的检测器包括紫外线检测器、荧光检测器、折射率检测器等。

检测器将信号转换为电信号，并通过计算机系统记录和分析。

HPLC技术的应用非常广泛，包括以下几个方面：1.制药：HPLC被广泛用于药物的分析和质量控制，如药物的纯度确定、罗氏等效反应物的测定、控制物质的含量和残留物的检测等。

2.环境监测：HPLC在环境保护和监测中起着重要作用。

它可用于检测地下水、饮用水、废水和土壤中的有机物、重金属和有毒物质。

3.食品分析：HPLC可用于检测食品中的添加剂、残留农药、食品中的毒性物质等。

例如，HPLC可以用于检测食品中的防腐剂和食品着色剂等。

4.生物化学：HPLC在生物化学分析中发挥着重要作用，如氨基酸、蛋白质、核酸的分离和定量分析等。

5.化学分析：HPLC可用于分离和分析复杂的化合物混合物。

例如，HPLC可用于油品中不同烃类的分离和鉴定等。

6.药动学研究：HPLC常用于药物在体内的吸收、分布、代谢和排泄等药动学过程的研究。

HPLC原理和操作详解HPLC (High Performance Liquid Chromatography) 是一种高效液相色谱分析仪器，也是一种广泛应用于分析和制备化学领域的色谱技术。

它通过溶液的流动将混合物中的分子分离和纯化，然后通过检测器检测和定量各个组分。

下面将详细介绍HPLC的原理和操作。

HPLC的原理是基于色谱技术的理论基础，即溶液与固体（固定相）表面之间会发生物理和化学吸附等相互作用，从而使溶液中的化合物被分离。

HPLC的主要组成部分包括溶液输送系统、色谱柱、检测器和数据处理系统。

HPLC的操作步骤如下：1.样品制备：将待分析的样品溶解在适当的溶剂中，并通过滤器过滤，去除杂质和颗粒物。

2.系统预冲洗：在运行之前，先用纯溶剂进行系统预冲洗，以去除柱子内的杂质。

3.色谱柱选择：根据需要分离的化合物性质选择适当的色谱柱。

常见的色谱柱包括反相柱、离子交换柱和凝胶渗透柱等。

4.流动相选择：根据样品性质选择合适的流动相，可以是单一溶剂或者混合溶剂。

流动相的选择对分离效果有很大影响。

5.色谱条件设定：设置合适的色谱条件，包括流速、柱温、检测器的参数等。

这些参数的选择要根据样品的特性和分析目的进行优化。

6.进样：将经过预处理的样品注入HPLC系统中。

可以选择自动进样或者手动进样的方式。

7.分离：通过调节色谱柱中的移动相流动速度和梯度等参数，使样品中的组分逐渐被分离。

分离的程度取决于色谱柱、流动相和样品的性质。

8.检测：通过检测器对分离出的化合物进行检测和定量。

常见的检测器包括紫外-可见吸收检测器、荧光检测器和质谱检测器等。

9.数据处理：将检测到的信号转换为荧光检测器和质谱检测器等。

HPLC的操作常见问题和注意事项：1.质控：在实验过程中需要进行质控，包括对流速、柱温和检测器的参数进行定期检查和校准。

2.柱寿命：色谱柱使用一段时间后会失效，需要定期更换。

柱的选择要根据样品的特性和分离目的进行优化。

H P L C原理和操作详解标准化工作室编码[XX968T-XX89628-XJ668-XT689N]高效液相色谱我国药典收载高效液相色谱法项目和数量比较表：鉴于HPLC应用在药品分析中越来越多，因此每一个药品分析人员应该掌握并应用HPLC。

I．概论一、液相色谱理论发展简况色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。

又称为色层法、层析法。

色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法(Chromatography)因之得名。

后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。

液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。

高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。

它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。

又因分析速度快而称为高速液相色谱法(High Speed Liquid Chromatography，HSLP)。

也称现代液相色谱。

二、HPLC的特点和优点HPLC有以下特点：高压——压力可达150~300 Kg/cm2。

色谱柱每米降压为75 Kg/cm2以上。

高速——流速为0.1~10.0 ml/min。

高效——可达5000塔板每米。

在一根柱中同时分离成份可达100种。

液相色谱仪操作及原理液相色谱仪（HPLC）是一种高效、高灵敏度的分析仪器，广泛应用于化学、生物、药物、环境等领域。

它通过将待测样品在流动相中进行分离，再通过检测器进行检测，从而实现对样品成分的分析和检测。

本文将介绍液相色谱仪的操作步骤及其原理。

操作步骤：1. 样品准备，首先，需要准备好待测样品，并将其溶解在适当的溶剂中。

样品的准备对于后续的分析结果至关重要，因此需要确保样品的准确性和稳定性。

2. 色谱柱选择，根据待测样品的性质和分析要求，选择合适的色谱柱。

不同的色谱柱具有不同的分离效果，因此选择合适的色谱柱对于分析结果的准确性至关重要。

3. 流动相准备，根据分析要求，准备好合适的流动相。

流动相的选择应考虑待测样品的性质和分离效果，通常为有机溶剂和水的混合物。

4. 色谱条件设置，根据待测样品的性质和分析要求，设置合适的色谱条件，包括流速、温度、检测波长等参数。

合适的色谱条件可以提高分析结果的准确性和稳定性。

5. 样品进样，将准备好的样品通过进样器引入色谱柱中，开始进行分离和检测。

原理：液相色谱仪的分离原理是利用样品在流动相中的分配系数差异，通过与固定相的相互作用实现分离。

在色谱柱中，样品成分会根据其在流动相和固定相之间的分配系数不同而发生分离，从而实现对样品成分的分析。

液相色谱仪的检测原理是通过检测器对分离后的样品成分进行检测。

常用的检测器包括紫外-可见吸收检测器、荧光检测器、电化学检测器等。

不同的检测器适用于不同类型的样品成分，可以实现对样品成分的高灵敏度和高选择性的检测。

总结：液相色谱仪作为一种高效、高灵敏度的分析仪器，在化学、生物、药物、环境等领域具有广泛的应用前景。

通过合理的操作步骤和深入理解其原理，可以实现对待测样品成分的准确分析和检测。

希望本文的介绍能够帮助读者更好地理解液相色谱仪的操作及原理，从而更好地应用于实际分析中。