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SYBRGreen实时定量PCR检测转基因大豆中外源基因拷贝数的影响[J].土壤,2004,36(1):56-60.[31]彭诚.土壤施硒对白菜和堇叶碎米荠生理指标的影响[J].湖北民族学院学报,2007,25(1):88-90.[32]院金渴,王朴,刘正兴,等.土壤施硒对大蒜生理特性、含硒量及产量的影响[J].新疆农业大学学报,2010,33(1):19-22.[33]周大寨,唐巧玉,陈建英,等.土壤施硒对花椰菜硒质量分数及主要营养成分的影响[J].湖北民族学院学报,2005,23(2):121-123.[34]冶军,单维东,褚贵新.叶面喷施硒肥对大豆产量和质量效应的初步研究[J].新疆农业科学,2009,46(3):506-509.[35]郁飞燕,寇太记,张联合,等.硒对植物生理功能影响的研究进展[J].安徽农业科学,2008,36(26):11202-11204.[36]邵志慧,林匡飞,徐小清,等.硒对小麦和水稻种子萌发的生态毒理效应的比较研究[J].生态学杂志,2005,24(12):1440-1443.[37] 贾宏昉,宋家永,王海红,等.硒对作物生理、生长发育及产量、品质的影响研究进展[J].河南农业大学学报,2006,40(4):449-454.[38]苏爱国,陈大清,李亚男.植物硫转运蛋白及其硒盐胁迫响应研究进展[J].长江大学学报,2008,5(1):70-73.[39]王晋民,赵之重,沈增基.叶面施硒对青花菜含硒量及产量与品质的影响[J].西北农林科技大学学报,2006,34(3):127-130.[40]Wang H L,Zhang J S,Yu H Q.Elemental selenium at nano sizepossesses lower toxicity without compromising the fundamental effect on selenoenzymes:Comparison with selenomethionine in mice[J].Free Radical Biology and Medicine,2007,42:1524-1533.[41]Huang B,Zhang J S,Ho J W,et al.Free radical scavengingefficiency of nano-se in vitro [J].Free Radical Biology andMedi-cine,2003,35(7):805-813.[42]周毅峰,吴永尧,唐巧玉.硒对大豆叶片谷肤甘肤过氧化物酶和过氧化氢酶歧化酶活的影响[J].湖北民族学院学报,2005,23(2):127-129.SYBR Green 实时定量PCR 检测转基因大豆中外源基因拷贝数冀志庚，高学军*，敖金霞，张明辉，霍楠（东北农业大学生命科学与生物技术研究中心，哈尔滨150030）摘要：采用SYBR Green Ιreal-time PCR 方法检测转基因大豆中外源基因35S 边界基因的拷贝数，以大豆凝集素基因（Lectin ）作为内参照基因，以转基因大豆基因组DNA 为内参照基因标准品，初始浓度为0.43μg ·μL -1，进行5倍梯度稀释得到内参照基因C T 值与起始模板量的相关性标准曲线：y =-2.9915x +22.3321，R 2=0.996；以含35S 边界序列的质粒DNA 为目的基因为标准品，初始浓度为0.64μg ·μL -1，同样进行5倍梯度稀释，建立目的基因C T与起始模板量的相关性标准曲线：y =-3.4021x +17.7219，R 2=0.999。
利用实时荧光定量ＰＣＲ法检测转基因水稻外源基因拷贝数的研究摘要：转基因植物中外源基因拷贝数是影响目的基因表达水平和遗传稳定性的重要因素，因此外源基因拷贝数的检测成为转基因研究的关键，利用高通量、快速、灵敏的SYBR Grcen I荧光定量实时PCR法，检测了转大麦烟酰胺合成酶基因(NAS1)水稻中外源基因拷贝数，以蔗糖磷酸合成酶基因(SPS)作为水稻的内源参照基因，通过梯度稀释法，分别获得了NA51和SPS基因的Ct值与起始模板数的相关性标准曲线，相关系数分别为0.99976和0.99571，相关性高，通过目的基因NASl和水稻內源参照基因SPS起始模板数的比较，获得了目的基因在转基因水稻中的拷贝数，在8株转基因株系中，1株为假阳性，1株拷贝数为1，3株拷贝数为2，其余3株拷贝数分别为3、4和7，而阴性对照拷贝数为0，这种方法快速、简便、准确，可以满足转基因育种工作中对后代优良株系的选择。
关键词：SYBR Creen I实时荧光定量PCR；烟酰胺合成酶基因；转基因水稻；拷贝数植物遗传转化是作物改良和新基因功能鉴定的常用方法，但在转基因植物中外源基因拷贝数常影响目的基因的表达水平和遗传稳定性，因此，转基因研究中关键的一步就是检测外源基因的拷贝数，以筛选出拷贝数少或单拷贝的转基因植株供进一步的研究或育种利用，传统的转基因植株拷贝数检测主要是Southern 杂交法，但该方法工作量大，需要的DNA材料较多，费时费力，并且经常要用到放射性同位素等具有潜在危险的药品，近年来，利用高通量、快速、灵敏的定量PCR方法检测转基因拷贝数逐渐受到科研人员的青睐。
SYBR Green I实时荧光定量PCR法是在PCR反应体系中加入SYBR Green I 荧光染料，该染料能够结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域并具有受激发产生绿色荧光的能力，当它与PCR合成的双链DNA结合，在激发光照射下产生荧光，由于荧光信号强度的增加与PCR产物的增加完全同步，因此通过对PCR反应进程中的荧光信号强度进行实时检测，就可间接的获得PCR扩增数据，根据Ct(cycle thresholds)值与起始模板数的对数值成反比线性关系的原理，制作标准曲线，获得Ct值与起始模板数的相关性方程，将样品的Ct值代人该方程就可获得目的基因的起始模板数，通过与水稻内源参照基因起始模板数的比较，就可知道基因组中该外源基因拷贝数，内源参照基因一般选择拷贝数少，同一物种内的不同生态类型间具有稳定的序列结构和拷贝数的一类基因，Ding等通过对水稻、小麦、玉米、大麦等十几种作物的研究发现，蔗糖磷酸合成酶(sucrose phosphate synthase，SPS)基因是水稻特有的基因，并且为单拷贝，可以作为水稻的内源参照基因。
实时荧光定量PCR技术的原理及应用在PCR扩增反应结束之后，可对扩增产物进行定性和定量的分析。
但是无论定性还是定量分析，分析的都是PCR终产物。
但是在许多情况下，我们所感兴趣的是未经PCR扩增之前的起始模板量。
例如我们想知道某一转基因动植物转基因的拷贝数或者某一特定基因在特定组织中的表达量。
在这种需求下荧光定量PCR技术应运而生。
实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，实现了PCR从定性到定量的飞跃。
1.实时荧光定量PCR技术的基本原理在实时荧光定量PCR 反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR 反应的进行，PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。
所谓实时荧光定量PCR技术，是指通过对PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。
每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。
一般而言，荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段, 荧光信号指数扩增阶段和平台期。
在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物量的变化。
而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加，PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA 拷贝数。
只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR 产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可以选择在这个阶段进行定量分析。
在扩增曲线中：荧光阈值(threshold)是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，荧光阈值的缺省设置是3～15个循环的荧光本底信号(baseline)标准差的10倍；Ct值的含义是指在PCR循环过程中,荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数,也就是每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环次数；Rn+表示每点测量的荧光强度,代表反应管含有模板DNA ;Rn-表示荧光基线强度,代表反应管不含有模板DNA,其在理想情况下是一条平线,只具有背景荧光数值;ΔRn表示PCR过程中,探针降解的量,也即PCR产物的量；基线( baseline)是背景曲线的一段,范围为从反应开始不久荧光值开始变得稳定,到所有反应管的荧光都将要但是还未超出背景。
Taqman定量PCR技术检测转基因大豆中外源基因拷贝数仇有文;张明辉;高学军;曲波;敖金霞;袁肖寒;刘营;霍楠【摘要】[目的[采用Taqman定量PCR技术检测转基因杂交大豆中外源nos终止子基因的拷贝数.[方法]以大豆凝集素基因为内参照基因,以非转基因大豆基因组DNA为内参照基因标准品,通过梯度稀释法分别求取了内参照基因和质粒DNA的Ct值与拷贝数对数值的相关性标准曲线方程,并通过将得到的Ct值代入标准曲线方程求取了样品的拷贝数.[结果]内参照基因标准曲线方程为y=-3.422x+35.201,R2=0.998;外源基因标准曲线方程为y=-3.348x+34.890,R2=0.999.nos终止子基因及其下游边界序列在转基因杂交大豆中为单拷贝.[结论]为确定转基因大豆外源基因拷贝数提供了理论依据.%[ Objective ] It is to adopt Taqman quantitative PCR technique to detect the copies of foreign nos terminator in transgenic hybrid soybean. [ Method ] With endogenous reference gene of soybean lectin, and endogenous reference standard of gene complex DNA in non-GMO soybeans, the method of gradient dilution was used to separately calculate Ct value of endogenous reference gene and plasmid DNA and relevance standard curve equation of logarithm of copies, and then to calculate the copies of samples through substituting thus-obtained Ct into standard curve equation. [ Result ] The standard curve equation of endogenous reference gene isy = - 3.422x + 35. 201 , R2 = 0. 998; and the standard curve equation of foreign gene is y = - 3. 348x + 34. 890, R2 = 0.999. Nos terminator and its lower boundary sequences in transgenic soybean is ofsingle copy. [ Conclusion] The study has provided a theoretical basis for determining foreign gene copies in transgenic soybean.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2011(039)017【总页数】3页(P10150-10152)【关键词】Real-time PCR;转基因杂交大豆;拷贝数;Lectin;nos终止子基因边界序列【作者】仇有文;张明辉;高学军;曲波;敖金霞;袁肖寒;刘营;霍楠【作者单位】东北农业大学生命科学与生物技术研究中心,农业部转基因生物产品成分监督检测测试中心,黑龙江,哈尔滨,150030;东北农业大学生命科学与生物技术研究中心,农业部转基因生物产品成分监督检测测试中心,黑龙江,哈尔滨,150030;东北农业大学生命科学与生物技术研究中心,农业部转基因生物产品成分监督检测测试中心,黑龙江,哈尔滨,150030;东北农业大学生命科学与生物技术研究中心,农业部转基因生物产品成分监督检测测试中心,黑龙江,哈尔滨,150030;东北农业大学生命科学与生物技术研究中心,农业部转基因生物产品成分监督检测测试中心,黑龙江,哈尔滨,150030;东北农业大学生命科学与生物技术研究中心,农业部转基因生物产品成分监督检测测试中心,黑龙江,哈尔滨,150030;东北农业大学生命科学与生物技术研究中心,农业部转基因生物产品成分监督检测测试中心,黑龙江,哈尔滨,150030;东北农业大学生命科学与生物技术研究中心,农业部转基因生物产品成分监督检测测试中心,黑龙江,哈尔滨,150030【正文语种】中文【中图分类】S188+.1实时荧光定量PCR技术是一种新的DNA定量方法[1]。
实时荧光PCR技术定量检测转基因大豆方法的研究吴影;宋丰顺;陆徐忠;赵伟;杨剑波;李莉【期刊名称】《作物学报》【年(卷),期】2007(33)10【摘要】以转基因大豆Roundup Ready为材料,通过特异性引物和探针,对转基因大豆中外源基因cp4-epsps进行了定量检测.研究发现Taqman荧光探针法和SYBR荧光染料法均可作为转基因大豆定量检测的方法,但前者比后者具更高的检测灵敏度和精确度,其检测阈值可降到0.05%,变异系数为0.09%～0.53%.在此基础上,建立和优化了Taqman探针实时荧光定量PCR检测技术体系,有助于提高转基因作物及产品的生物安全性定量检测的准确度和可靠性.【总页数】5页(P1733-1737)【作者】吴影;宋丰顺;陆徐忠;赵伟;杨剑波;李莉【作者单位】安徽省农科院水稻研究所,安徽合肥,230031;安徽农业大学生命科学学院,安徽合肥,230036;安徽省农科院水稻研究所,安徽合肥,230031;安徽省农科院水稻研究所,安徽合肥,230031;安徽省农科院水稻研究所,安徽合肥,230031;安徽省农科院水稻研究所,安徽合肥,230031;安徽省农科院水稻研究所,安徽合肥,230031【正文语种】中文【中图分类】S5【相关文献】1.实时荧光定量PCR技术检测转基因大豆方法的建立 [J], 陈颖;徐宝梁;苏宁;王媛;王丙武;葛毅强2.实时荧光PCR技术定量检测转基因豆粉的研究 [J], 白卫滨;孙建霞;程国灵;罗云波;姜桂传;黄亚东3.TaqMan MGB实时荧光PCR对转基因大豆定量检测的研究 [J], 黄东东;翁少萍;吕玲;常迪;何建国4.实时荧光定量PCR技术检测腐乳中大豆转基因成分 [J], 许银叶;许佩勤;庄俊钰;冯志强5.应用实时荧光PCR技术定性定量检测改良品质的转基因小麦 [J], 栾凤侠;张洪祥;白月因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
在毕赤酵母中，外源基因能够在基因组的同一位点进行多次同源重组，从而插入多个拷贝的外源基因。
而高拷贝的外源基因通常会导致其在毕赤酵母中的高表达［1］。
比较外源基因在毕赤酵母中表达量的差异时，如比较不同启动子的转录活性时，往往需要检测外源基因的拷贝数，筛选单拷贝整合外源基因的毕赤酵母菌株。
目前，在毕赤酵母的研究中，Southern blot 是运用最多的检测外源基因拷贝数的方法［2］。
但该方法需要大量的DNA ，工作量大，操作要求高。
近年来，荧光定量PCR 技术不断成熟，并已开始用于检测外源基因的拷贝数，如在转基因植物研究领域，已利用该项技术检测外源基因的拷贝数［3］。
但相关文献报道较少。
本文以毕赤酵母中的看家基因GAP （Glycer －aldehyde -3-phosphate dehydrogenase ）为内参，绿色荧光蛋白（GFP ）基因为报告基因，采用双标准曲线实时荧光定量PCR 法，建立了一种测定毕赤酵母中外源基因拷贝数的方法，现报道如下。
1.材料与方法1.1菌株及质粒大肠杆菌Top10、毕赤酵母GS115及质粒pPIC3.5K 均购自Invitrogen 公司；含GFP 基因的毕赤酵母GS115-KDR -P 菌株由本室保存；pMD19-T Simple 载体购自TaKaRa 公司。
1.2主要试剂及仪器Premix Taq （Ex Taq TM Version ）和连接试剂DNA作者单位：华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室（上海200237）.通讯作者：周祥山，E -mail ：xszhou@中国图书分类号Q789文献标识码A文章编号1004-5503（2009）12-1236-05【实验技术】实时荧光定量PCR 检测毕赤酵母基因组中外源基因拷贝数宣姚吉周祥山张元兴【摘要】目的建立实时荧光定量PCR 检测毕赤酵母基因组中外源基因拷贝数的方法。
方法采用双标准曲线法，分别利用含有GAP 基因和绿色荧光蛋白（GFP ）基因的质粒，进行实时荧光定量PCR 反应，建立标准曲线。
实时荧光定量PCR 技术在转基因检测中的应用收稿日期：2008-03-05基金项目：东北农业大学创新团队项目（CXT004-3-2）作者简介：敖金霞（1977-），女，黑龙江人，博士研究生，助研，主要从事转基因作物基因检测技术方面研究。
*通讯作者：教授，博士生导师，E-mail:gaoxj5390@敖金霞1，高学军1*，仇有文1，郭士成2（1．东北农业大学生命科学与生物技术研究中心，农业部转基因生物产品成分监督检测测试中心，哈尔滨150030；2．东北农业大学生命科学学院，哈尔滨150030）摘要：实时荧光定量PCR 技术是一种新型的核酸定性、定量检测、分析技术。
随着转基因产品大规模商业化，转基因生物的环境安全和食用安全性问题引起了全球范围内广泛的争论和关注。
实时监测、定量准确、灵敏度高、反应速度快、重复性好及PCR 反应后不需电泳检测等优点，使RQ-PCR 逐步成为转基因检测的重要工具。
关键词：实时荧光定量PCR ；Taq Man 探针法；SYBR Green I 染料法；转基因检测中图分类号：TS207.3文献标识码：A随着有关转基因成分标签法的建立和对于转基因食品的重视程度及量化要求的提高，定性PCR 因其在转基因检测中的高敏感性差易造成假阳性现象，以及操作误差和一些反应抑制因素带来的假阴性现象，使其已经不能再满足人们的需要。
在这种基础之上实时荧光定量PCR（Real-time quantitative polymerase chain reaction ，RQ-PCR ）发展起来，RQ-PCR 技术不仅实现了对DNA 模板的定量，而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点。
目前实时荧光定量PCR 已广泛应用于分子生物学、农业、医学等学科的应用和基础研究领域，并已经在转基因检测中发挥了不可替代的作用[1-2]。
1R Q -PC R 的基本原理实时荧光定量PCR 技术是指在PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监测整个PCR 进程，最后通过标准曲线，对待测样品中的未知模板进行定量分析的方法。
的影响[J].土壤,2004,36(1):56-60.[31]彭诚.土壤施硒对白菜和堇叶碎米荠生理指标的影响[J].湖北民族学院学报,2007,25(1):88-90.[32]院金渴,王朴,刘正兴,等.土壤施硒对大蒜生理特性、含硒量及产量的影响[J].新疆农业大学学报,2010,33(1):19-22.[33]周大寨,唐巧玉,陈建英,等.土壤施硒对花椰菜硒质量分数及主要营养成分的影响[J].湖北民族学院学报,2005,23(2):121-123.[34]冶军,单维东,褚贵新.叶面喷施硒肥对大豆产量和质量效应的初步研究[J].新疆农业科学,2009,46(3):506-509.[35]郁飞燕,寇太记,张联合,等.硒对植物生理功能影响的研究进展[J].安徽农业科学,2008,36(26):11202-11204.[36]邵志慧,林匡飞,徐小清,等.硒对小麦和水稻种子萌发的生态毒理效应的比较研究[J].生态学杂志,2005,24(12):1440-1443.[37]贾宏昉,宋家永,王海红,等.硒对作物生理、生长发育及产量、品质的影响研究进展[J].河南农业大学学报,2006,40(4):449-454.[38]苏爱国,陈大清,李亚男.植物硫转运蛋白及其硒盐胁迫响应研究进展[J].长江大学学报,2008,5(1):70-73.[39]王晋民,赵之重,沈增基.叶面施硒对青花菜含硒量及产量与品质的影响[J].西北农林科技大学学报,2006,34(3):127-130.[40]Wang H L,Zhang J S,Yu H Q.Elemental selenium at nano sizepossesses lower toxicity without compromising the fundamental effect on selenoenzymes:Comparison with selenomethionine in mice[J].Free Radical Biology and Medicine,2007,42:1524-1533.[41]Huang B,Zhang J S,Ho J W,et al.Free radical scavengingefficiency of nano-se in vitro [J].Free Radical Biology and Medi-cine,2003,35(7):805-813.[42]周毅峰,吴永尧,唐巧玉.硒对大豆叶片谷肤甘肤过氧化物酶和过氧化氢酶歧化酶活的影响[J].湖北民族学院学报,2005,23(2):127-129.SYBR Green 实时定量PCR 检测转基因大豆中外源基因拷贝数冀志庚，高学军*，敖金霞，张明辉，霍楠（东北农业大学生命科学与生物技术研究中心，哈尔滨150030）摘要：采用SYBR Green Ιreal-time PCR 方法检测转基因大豆中外源基因35S 边界基因的拷贝数，以大豆凝集素基因（Lectin ）作为内参照基因，以转基因大豆基因组DNA 为内参照基因标准品，初始浓度为0.43μg ·μL -1，进行5倍梯度稀释得到内参照基因C T 值与起始模板量的相关性标准曲线：y =-2.9915x +22.3321，R 2=0.996；以含35S 边界序列的质粒DNA 为目的基因为标准品，初始浓度为0.64μg ·μL -1，同样进行5倍梯度稀释，建立目的基因C T与起始模板量的相关性标准曲线：y =-3.4021x +17.7219，R 2=0.999。
通过SYBR Green Ιreal-time PCR 获得样本中目的基因和内参基因的C T 值，将C T 值分别代入标准曲线计算该样本中内参基因和目的基因起始模板量，目的基因与内参基因起始模板量比值即是目的基因在该转基因中的拷贝数。
计算结果为4份样品中，2个拷贝的1个，3个拷贝的3个。
关键词：real-time PCR ；SYBR Green Ι；转基因大豆；拷贝数；Lectin ；35边界序列中图分类号：S565.1；Q78文献标志码：A文章编号：1005-9369（2011）10-0011-05Establishment of SYBR Green-base quantitative real-time PCR assay for determining transgene copy number in transgenic soybean/JI Zhigeng,GAO Xuejun,AO Jinxia,ZHANG Minghui,HUO Nan(Life Science and Biotechnique Research Center,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)收稿日期：2010-10-28基金项目：国家转基因重大专项课题（2008ZX08012-001）作者简介：冀志庚（1984-），男，硕士研究生，研究方向为转基因作物检测。
E-mail:hanbo001@ *通讯作者：高学军，教授，博士生导师，研究方向为转基因检测。
E-mail:gaoxj5390@ Journal of Northeast Agricultural University东北农业大学学报第42卷第10期42(10):11~152011年10月Oct.2011实时荧光定量PCR 技术是一种新的DNA 定量方法[1]。
其定量的基本原理是在PCR 反应体系中加入非特异性的荧光染料（如SYBR Green ）或特异性的荧光探针（如Taqman 探针）[2]，实时检测荧光量的变化，获得不同样品达到一定的荧光信号（阈值）时所需的循环次数—C T 值（Cycle threshold ）；根据C T 值与起始模板数的对数值成反比线性关系的原理，制作标准曲线，就可知道基因线，获得C T 值与起始模板数的相关性方程，将样品的C T 值代入该方程就可获得目的基因的起始模板数，通过与大豆内源参照基因起始模板数的比较，就可知道基因组中该外源基因拷贝数[3]。
本研究以抗草甘膦（CP 4-EPSPS ）转基因大豆为材料，以CaMV35S 边界序列为外源基因，避免以CaMV35S 和nos 为外源基因出现假阳性。
选择大豆凝集素基因（Lectin ）作为内源参照基因进行拷贝数估算，通过SYBR Green Ι实时荧光定量PCR 法检测转基因大豆中CaMV35S 基因的拷贝数。
1材料与方法1.1材料转基因杂交大豆（由东北农业大学大豆研究所提供），非转基因大豆（购自某超市）；阳性质粒（本实验室构建）；TaKaRa LA PCR in vitro Cloning Kit （Code No.:DRR015）SYBR Premix EX Taq TM （Code No.:DRR041S ）购自大连宝生物工程有限公司；ABI实时定量荧光PCR 仪（ABI7300），96孔扳（AXYG-EN ）。
1.2方法1.2.1DNA 提取转基因大豆基因组DNA 采用CTAB 法提取[4]，用分光光度计检测DNA 含量及纯度。
内参基因标准品选用转基因大豆基因组DNA ，浓度为0.43μg ·μL -1，稀释倍数分别为50、5-1、5-2、5-3和5-4。
以含35S 边界序列的质粒DNA 为标准品，浓度为0.64μg ·μL -1，稀释倍数分别为50、5-1、5-2、5-3和5-4。
以Lectin 作为大豆的内参基因，以含35S 边界序列的质粒DNA 为阳性对照，未转基因大豆为阴性对照，水为空白对照。
1.2.2CaMV35S 边界序列的获得以转基因大豆基因组DNA 为模板，利用染色体步行法（TaKaRa LA PCR in vitro Cloning Kit ）扩增CaMV35S 上游序列。
通过测序获得CaMV35S 上游大豆基因组序列。
根据获得的序列设计特异性引物，构建pMD18-T 阳性质粒载体。
1.2.3引物设计及合成转基因大豆内、外源基因的引物由Invitrogen公司合成。
引物序列见表1。
1.2.4PCR 反应体系和程序定量PCR 反应体系：SYBR Premix EX Taq TM（2×）10μL ，PCR 上游引物（10μmol ·L -1）0.4μL ，PCR 下游引物（10μmol ·L -1）0.4μL ，ROX Re-ference Dyer （50×）0.4μL ，模板2.0μL ，灭菌蒸馏水6.8μL ，总体积20μL 。
PCR 程序（采用两步法PCR 扩增程序）：预变性95℃30s ；95℃5s ，60℃31s ，40个循环。
5个不同稀释度的内参照基因标准品，5个不同稀释Abstract:SYBR Green Ιreal-time PCR was developed to determine copy number of exogenous 35S/plantgene in transgenic soybean.A conserved soybean housekeeping gene,Lectin was used as an internal contral and 5times diluted soybean genome DNA was used as an initial template copy of Lectin .So y =-2.9915x +22.3321,R 2=0.996,the standard curves of the cycle threshold (C T )relative to the log of each initial template copy of Lectin was obtained.In the same way,the standard curves of 35S/plant y =-3.4021x +17.7219,R 2=0.999,was obtained using 5times diluted plasmid DNA which contains 35S/plant gene.By SYBR Green Ιreal-time the C T values of Lectin and 35S/plant gene in each transgenic soybean was got,the transgene copy number was calculated by comparing the initial template copy of 35S/plant to Lectin gene in the same transgenic soybean.It concluded that among four PCR putative transgenic plants:one had two copies,and the other had three copies,respectively.Key words:real-time PCR;SYBR Green Ι;transgenic soybean;copy number;Lectin ;injection sequence of35S东北农业大学学报·12·第42卷度带有目的片段的质粒DNA ，空白对照同时进行扩增，均设3个平行。
