下载文档原格式
流式细胞仪实验方法一、实验准备1．标本制备：2．最小化非特异性结合：二、凋亡1．凋亡的检测方法：网站和其它2．PI染色法3．Annexin V 法4．TUNNEL法三、细胞因子1．激活的细胞因子2．CBA四、血小板1．活化2．活化检测3．网织血小板五、红细胞1．网织红细胞2．PNH3．胎儿红细胞六、肿瘤学1．DNA 细胞周期2．蛋白3．多药耐药4．微小残留白血病第一部分标本处理一、流式细胞术常规检测时的样品制备(一)直接免疫荧光标记法取一定量细胞(约1X106细胞／ml)，在每一管中分别加入50μl的HAB，并充分混匀，于室温中静置1分钟以上(),再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应(如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入)，。
孵育20-60分钟后，用PBS(pH7．2—7．4)洗1-2次，加入缓冲液重悬，上机检测。
本方法操作简便，结果准确，易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。
虽然直标抗体试剂成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰，因此更适用于临床标本的检测。
(二)间接免疫荧光标记法取一定量的细胞悬液(约1X106细胞／ml)，先加入特异的第一抗体，待反应完全后洗去未结合抗体，再加入荧光标记的第二抗体，生成抗原—抗体—抗抗体复合物，以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。
本方法费用较低，二抗应用广泛，多用于科研标本的检测。
但由于二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，非特异性荧光背景较强，易影响实验结果。
所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。
另外，由于间标法步骤较多，增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标本。
二、最小化非特异性结合的方法1．荧光标记的抗体的浓度应该合适，如果浓度过高，背景会因为非特异性的相互作用的增加而增加。
2．在使用第一抗体之前，将样品与过量的蛋白一起培育，如小牛血清蛋白（BSA），脱脂干奶酪，或来自于同一寄主的正常血清来作为标记的第二抗体。
流式细胞术操作规程
《流式细胞术操作规程》
流式细胞术是一种用于研究细胞表型和功能的重要技术。
在进行流式细胞术时，操作规程的严谨性和标准化是非常重要的。
以下是流式细胞术操作规程的一般步骤：
1. 样品准备：首先，需要准备好待测的细胞样品。
这包括细胞的培养和收集，以及必要的处理和染色。
2. 仪器准备：在进行流式细胞术之前，需要确保流式细胞术仪器的正常运行。
这包括检查流式细胞仪和细胞分选仪的通电和冷却系统，以及其它相关设备的准备。
3. 校准仪器：在进行流式细胞术之前，需要对流式细胞仪进行校准，以确保其准确测量样品中细胞的特定参数。
4. 样品测量：将准备好的细胞样品加入流式细胞仪，并进行测量。
测量完毕后，需要对数据进行分析和记录。
5. 数据分析：对测量得到的数据进行分析，包括确定细胞的表型和功能，以及对其它相关参数进行分析和比较。
6. 结果解释：根据数据分析的结果，进行结果的解释和报道，并对相关实验现象进行讨论和总结。
在进行流式细胞术时，需要严格遵守操作规程，以确保实验结果的准确性和可靠性。
此外，对于一些特殊的实验操作，可能
还需要根据具体情况进行相应的调整和改进。
流式细胞术的操作规程是一个很重要的研究工具，它可以帮助研究人员进行高效、准确的实验，从而为科学研究和医学诊断提供更为可靠的数据和方法。
facs技术操作规程
《FACS技术操作规程》
流式细胞仪（FACS）是一种用于细胞分析和分选的高级仪器。
它可以分析、计数和分选细胞，对于细胞学和免疫学研究非常重要。
在使用FACS技术时，操作规程非常重要，可以确保实验的准确性和可重复性。
首先，操作人员需要准备好实验所需的样本和试剂。
样本可以是细胞悬液或者组织细胞悬液，而试剂包括细胞染色剂、抗体等。
在进行实验前，要确保所有试剂和仪器都是干净的，并且符合实验要求。
其次，需要根据实验设计设置FACS仪器。
这包括设置激光器的参数、选择合适的滤光片和检测通道，以及校准仪器。
合理的仪器设置可以确保后续实验的准确性。
接下来，操作人员需要将样本加入到流式细胞仪中进行分析。
在分析过程中，要确保样本被均匀地分散，并且避免气泡的产生。
此外，要根据实验目的选择合适的参数进行数据采集。
最后，如果需要进行细胞的分选，操作人员需要进行细胞的标记和排序。
细胞标记可以使用荧光染料或者特定的抗体，而排序可以根据细胞的特定荧光信号进行。
在进行分选时，要确保细胞的纯度和活性。
总之，FACS技术操作规程对于实验的成功至关重要。
遵循规
程可以确保实验结果的准确性和可重复性，同时也可以降低实验中的操作失误。
因此，操作人员在使用FACS技术时应该严格遵守相关规程，并按照标准操作步骤进行操作。
流式细胞仪常用的几种检测方法1.细胞计数和生存率检测：流式细胞仪可以通过测定细胞的大小、形状和胞内染色物来实现细胞计数和生存率的检测。
通过自动聚焦和自动获取图像的功能，可以对大量的细胞进行计数和分析，并得出生存率数据。
2.表面标记检测：流式细胞仪可以利用荧光染料或荧光标记抗体对细胞表面的蛋白质、糖类或其他生物分子进行检测。
这种检测方法主要用于检测细胞表面标记的数量和分布情况，例如测定细胞表面特定抗原的表达水平。
3.细胞周期分析：流式细胞仪可以通过染色剂或荧光标记抗体对细胞进行染色，然后分析细胞在不同细胞周期阶段的比例。
这种检测方法可以用于研究细胞的增殖能力、细胞周期调控机制以及细胞周期与疾病发展的关系。
4.细胞凋亡检测：流式细胞仪可以利用染色剂或荧光标记抗体对细胞凋亡的标志物进行检测。
凋亡是细胞死亡的一种形式，通过测定凋亡细胞的数量和凋亡标志物的表达水平，可以研究细胞凋亡的调控机制以及细胞凋亡与疾病的关系。
5.细胞功能检测：流式细胞仪可以通过检测细胞内Ca2+浓度、ROS （活性氧物种）水平、蛋白质磷酸化等细胞功能指标来研究细胞的信号转导和功能活性。
例如，利用荧光染料可以测定细胞内钙离子的浓度变化，以研究细胞响应外界刺激的机制。
此外，流式细胞仪还可以进行细胞分选、多色细胞分析和细胞细胞间相互作用的研究。
细胞分选功能可以根据细胞标记物的表达水平将细胞分离出来，用于研究特定功能细胞的特性。
多色细胞分析可以用于同时检测多种标记物的表达水平，以揭示不同细胞类型的分子特征。
细胞间相互作用的研究可以通过检测细胞间的共聚或共表达标记物来研究细胞间的相互作用和相互影响。
总的来说，流式细胞仪是一种功能强大的实验室设备，常用于细胞生物学和疾病研究。
通过不同的检测方法，可以在细胞水平上研究细胞的数量、表面标记、周期、凋亡、功能以及细胞间相互作用等方面的特征。
流式细胞仪检测细胞凋亡方法（AnnexinV法）实验概要Annexin V是一种检测细胞凋亡的试剂，本实验介绍了一个用流式细胞仪检测细胞凋亡的方法(Annexin V 法)。
实验原理Annexin V是检测细胞凋亡的灵敏指标之一。
它是一种磷脂结合蛋白，可以与早期凋亡细胞的胞膜结合，而细胞质膜的改变是细胞发生凋亡时最早的改变之一。
在细胞发生凋亡时，膜磷脂酰丝氨酸(PS)由质膜内侧翻向外侧。
Annexin V与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，因而与细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸结合。
由于在发生凋亡时，磷脂酰丝氨酸外翻的发生早于细胞核的改变，因此，与DNA碎片检测比较，使用Annexin V可以更早地检测到凋亡细胞。
因为细胞坏死时也会发生磷脂酰丝氨酸外翻，所以Annexin V常与鉴定细胞死活的核酸染料(如PI或7-AAD)合并使用，来区分凋亡细胞(Annexin V /核酸染料-)与死亡细胞(Annexin V /核酸染料 )。
主要试剂1. PBS缓冲液：含0.1%NaN3，过滤后2-8°C保存。
2. Annexin V Binding Buffer缓冲液(Cat. No. 66121E)：浓度为10×，使用时，用稀释为1×浓度的应用液。
3. Annexin V试剂与核酸染料：Annexin V 核酸染料Annexin V-Biotin(Cat. No. 65872X) PI(Cat. No. 66211E)或Streptavidin-FITC(Cat. No. 13024D) 7-AAD(Cat. No. 34321X)Annexin V-FITC(Cat. No. 65874X) PI(Cat. No. 66211E) Annexin V-PE(Cat. No. 65875X) 7-AAD(Cat. No. 34321X)1. 一次性12×75mm Falcon试管。
细胞计数方法细胞计数是生物学和医学领域中非常重要的实验技术之一。
它用于确定细胞数量，评估细胞增殖率，研究细胞生长和细胞死亡等。
在科研实验室、临床诊断和药物研发中，细胞计数方法被广泛应用。
本文将介绍几种常用的细胞计数方法，包括显微镜计数法、血细胞计数仪法和流式细胞仪法。
显微镜计数法是最传统的细胞计数方法之一。
它通过在显微镜下直接观察和计数细胞来确定细胞数量。
首先，将待计数的细胞悬浮液均匀涂布在载玻片上，然后在显微镜下使用细胞计数室或九宫格计数。
通过计算细胞在特定面积内的数量，再乘以稀释倍数，即可得到总细胞数。
这种方法简单直观，但需要较长的操作时间，并且受到操作者主观因素的影响。
血细胞计数仪法是一种自动化的细胞计数方法，主要用于血液细胞计数。
它利用血细胞计数仪对待测样品进行自动计数和分类，可以快速准确地得到各类血细胞的数量。
这种方法操作简便，结果准确可靠，适用于大批量的细胞计数工作。
但是，血细胞计数仪的价格较高，使用和维护成本也较高，因此在一般实验室中并不常见。
流式细胞仪法是一种高通量、高灵敏度的细胞计数和分析方法。
它利用流式细胞仪对细胞进行快速连续检测和计数，可以同时获取细胞数量、大小、形状、表面标记物等多种信息。
流式细胞仪广泛应用于细胞免疫学、细胞生物学、肿瘤学等领域，可以帮助研究人员深入了解细胞的特性和功能。
但是，流式细胞仪的价格昂贵，操作复杂，需要专业的技术人员进行操作和数据分析。
总的来说，不同的细胞计数方法各有优缺点，适用于不同的实验需求和场景。
在选择细胞计数方法时，需要根据实验目的、样品特性、实验条件等因素综合考虑，选取最适合的方法进行细胞计数。
随着科技的不断进步和发展，相信会有更多更高效的细胞计数方法出现，为科研工作者和临床医生提供更多选择。
流式细胞仪的使用方法及相关资料仪器名称：流式细胞仪生产厂家：美国贝克曼库尔特有限公司使用方法：一．开机程序1．检查稳压器电源，打开电源，稳定5分钟。
2．打开储液箱，倒掉废液, 并在废液桶中加入400ml漂白水原液。
打开压力阀，取出鞘液桶，将鞘液桶加至4/5满（一般可用三蒸水，做分选必须用PBS或FACSFlow），合上压力阀。
确实盖紧桶盖，检查所有管路是否妥善安置。
3．将FACSCalibur开关打开，此时仪器功能控制钮的显示应是STANDBY，预热5－10分钟。
排出过滤器内的气泡。
4．如果需要打印，打开打印机电源。
5．打开电脑,等待屏幕显示出标准的苹果标志。
6．执行仪器PRIME功能一次，以排除Flow cell中的气泡。
7．分析样品时，先用FACAFlow 或PBS进行HIGH RUN约2分钟。
做过分选后，每次开机后需冲洗管道：向分选装置上装上两个50ml离心管，不接通浓缩系统，摁下右下角白色按钮开始冲洗。
待自动停止后接通浓缩装置，同上法冲洗一次。
二．预设获取模式文件(Acquisition Template Files)1．从苹果标志中选择CELLQuest见一个新视窗，可利用此视窗编辑一个获取模式文件。
2．选取屏幕左列绘图工具中的Dot plot，绘出一个或多个Dot Plots（点图）。
从Dot Plot对话框中选取Acquisition作为图形资料来源，并确定适当的x轴和y轴参数。
3．选取屏幕左列绘图工具中的Histogram，同上法可绘出Histogram（直方图）。
4．将此视窗命名后储存于FACStation G3\BD Applications \CELLQuest Folder \EXP文件夹中，下次进行相同实验时可直接调用。
本计算机中已设定两个模式文件：ACQ和EXP，储存于FACStation G3\BD Applications \CELLQuest \EXP文件夹中，ACQ用于细胞DNA检测，EXP用于细胞表面标志分析。
流式细胞仪检测细胞周期原理和方法流式细胞仪（Flow Cytometry）是一种现代生物学实验技术，主要用于检测和分析细胞的形态、结构、功能及其分子水平的变化。
它通过利用激光传感器探测透过细胞的激光散射或荧光信号，同时可以通过细胞的大小、荧光强度和荧光波长的变化将细胞分为不同的亚群。
流式细胞仪的使用已经广泛应用于细胞生物学、免疫学、肿瘤学、生殖医学等领域。
流式细胞仪检测细胞周期的原理主要基于细胞的DNA含量不同于不同细胞周期阶段。
细胞周期通常分为G1期（细胞生长期）、S期（DNA复制期）、G2期（前期）、M期（有丝分裂期）和G0期（休止期）。
在细胞周期中，细胞会通过分子调控机制从一个阶段进入到下一个阶段。
细胞在G1期，其DNA含量为单倍体（2N）。
G1/S转变时，细胞准备开始进入DNA复制期（S期），在S期中，细胞的DNA含量翻倍，达到二倍体（4N）。
接下来，细胞进入G2期，准备进入有丝分裂期（M期），在M期，细胞的DNA含量达到四倍体（8N），细胞核开始分裂。
而G0期，则代表细胞处于休眠或未分裂状态，DNA含量不变（通常是2N）。
1.细胞样本制备：首先需要制备良好的单细胞悬浮液，通常通过细胞消化酶处理细胞集落或组织样本，将细胞分散为单细胞。
同时，还要对细胞进行化学固定或冷冻处理，以保持其形态和结构的完整性。
2.细胞染色：将细胞进行荧光染色或抗体标记。
如果使用荧光染料，可以直接将染料加入到细胞悬浮液中，使其与DNA结合。
如果使用抗体标记，先将抗体与细胞混合，然后再加入荧光二抗进行染色。
3.流式细胞仪检测：将样品注入流式细胞仪仪器中。
细胞悬浮液在仪器中通过微细管道流动，激光通过细胞悬液时，细胞会散射激光，形成散射信号。
同时，荧光标记的细胞也会发出荧光信号。
4.数据分析：通过流式细胞仪仪器，可以获取每个单个细胞的散射与荧光信号。
利用仪器中的分析软件，可以对细胞的散射与荧光信号进行分析和计数。
根据荧光信号强度，可以对细胞进行不同周期阶段的区分和计数。
流式细胞仪使用方法说明书1. 概述流式细胞仪是一种用于细胞分析和排序的先进仪器。
本方法说明书旨在向用户介绍如何正确操作流式细胞仪以及最佳的使用方法。
请用户在使用前仔细阅读本说明书并遵循相关的安全操作规程。
2. 仪器组成流式细胞仪主要由以下几个组成部分构成：- 流体传送系统：用于将样本引入仪器并排除废弃物。
- 激光系统：产生激光束以激发样本中的荧光染料。
- 光学系统：收集样本产生的荧光信号并进行检测。
- 数据分析系统：用于解析和分析收集到的数据。
3. 使用准备在进行流式细胞仪实验之前，请确保以下几个步骤已经完成：- 仪器校准：根据仪器的使用手册进行仪器校准，确保仪器工作在最佳状态。
- 样本准备：按照实验需求，对待测样本进行合适的处理，例如细胞培养、染色等。
- 试剂准备：准备好所需的荧光染料、缓冲液等试剂。
4. 仪器操作以下是流式细胞仪的一般操作步骤：- 打开仪器电源，并等待仪器启动完成。
- 将样本装入合适的样本管，并在样本管中加入适量的荧光染料或其他试剂。
- 将样本管放入仪器中的样本槽，并调整流速和其他参数。
- 启动激光系统，并调整激光强度和波长以适应实验需求。
- 开始数据采集，根据仪器界面指示收集所需数据。
- 数据分析：根据实验需要，使用相应的数据分析软件对采集到的数据进行解析和处理。
5. 安全注意事项在使用流式细胞仪时，务必注意以下安全事项：- 佩戴个人防护装备，包括实验手套和护目镜。
- 遵循实验室的生物安全规程，确保样本处理符合相关的安全要求。
- 避免直接暴露于激光束下，以免损伤眼睛和皮肤。
- 在清洁仪器时使用合适的溶剂，并按照仪器清洁的标准程序进行操作。
6. 故障排除在实际操作中，有时可能会遇到仪器故障或其他问题。
以下是一些常见问题及其排除方法：- 仪器无法启动: 检查电源连接是否正常，重启仪器。
- 数据质量差: 检查样本制备和染色的质量，调整参数和仪器校准。
- 清洗困难: 检查是否有阻塞，按照清洁程序进行清洗。
流式细胞仪检测细胞增殖方法有哪些？在生物学和医学研究中，细胞增殖是一个关键过程，对于理解生命活动的基本规律以及疾病的发病机理具有重要意义。
随着科技的发展，流式细胞仪作为一种高效、灵敏的分析工具，广泛应用于细胞增殖的检测。
流式细胞仪通过快速分析单个细胞，可以对细胞周期、细胞增殖活性、细胞凋亡等多个方面进行研究。
本文将探讨流式细胞仪在检测细胞增殖方面的主要方法，包括但不限于溴脱氧尿苷（BrdU）掺入法、细胞周期蛋白检测法以及细胞大小分析法等，为读者提供全面的技术应用概览。
流式细胞仪检测细胞增殖方法：1、3H（氚离子）掺入法原理：是在细胞DNA合成时，用3H脱氧胸腺嘧啶核苷代替普通的脱氧胸腺嘧啶核苷掺入新合成的DNA中，增殖的细胞因为掺入3H而具有放射性，通过定量检测样品细胞的放射性大小而反映细胞的增值活性缺点：1）使用的是具有放射性的同位素，操作较为复杂，同时需要采取放射性保护措施2）低比例高活跃增殖和高比例低活跃增殖可能得到的是相同的结果，用此方法无法进行鉴别3）此方法无法进一步得到具有活性的增值细胞用于下一步的研究4）此方法时间较短，无法检测加入前细胞的增殖情况，而且检测到放射性只能说明细胞DNA合成，而不能提供合成DNA的细胞是否进入增殖阶段的信息2、相对计数法原理：将对照组和各实验组控制在相同条件下直接计数然后比较计数结果得到增殖结论注意点：对照组与实验组每种细胞所加浓度必须相同，每组至少设置3个复孔，这样每个孔可以得到1个细胞数，将3个复孔取平均值后就是这个组的结果。
如果同时需要得到每孔目标细胞增殖后的绝对参数，在每孔细胞中加入1*105PE标记的人工微球作为内参收集各组的细胞于EP管中，注意必须尽量将各组的所有细胞都收集起来。
标记需要计数细胞的标志表型的荧光素偶联抗体，4℃静置30minPBS洗涤一次，洗去游离的抗体3、示踪染料标记法示踪染料与细胞结合的方式：1）能够与细胞内的蛋白质上的氨基发生非特异性的共价结合2）能够非特异性地嵌入细胞膜的脂质双分子层中与细胞发生非共价性结合原理：示踪染料的荧光信号都很强，当细胞分裂时，母细胞内的染料会被平均分配到子细胞中，细胞荧光信号会被减弱一半，所以通过检测减弱的、发射示踪染料荧光信号的细胞比例就可以判断细胞增殖的强弱。
pd-1流式方法
PD-1流式方法指的是使用流式细胞术检测PD-1在细胞表面的表达水平的方法。
在免疫学中，PD-1（程序性死亡受体1）是一种重要的免疫调节分子，它可以在T细胞和B细胞表面表达。
PD-1的表达水平可以影响免疫细胞的活性，因此检测PD-1的表达对于免疫疗法和疾病的研究具有重要意义。
流式细胞术是一种常用的检测细胞表面标记的方法，通过将细胞与特异性抗体结合，可以检测细胞表面各种分子的表达水平。
在使用流式细胞术检测PD-1的表达时，通常需要将细胞与特异性抗体结合，然后使用流式细胞仪进行检测。
这些抗体可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体，可以与荧光染料结合，以便在流式细胞仪中检测。
下面是一个简单的示例，说明如何使用流式细胞术检测PD-1的表达：
1.收集细胞样品，可以是来自患者、实验动物或细胞培养的样品。
2.对细胞样品进行处理，如去除红细胞、分离特定类型的免疫细胞等。
3.将细胞与特异性抗体结合，这些抗体可以与PD-1结合，也可以是同型对照
抗体。
4.加入荧光染料或其他标记物，以便在流式细胞仪中检测。
5.将细胞通过流式细胞仪进行检测，记录每个细胞的荧光信号。
6.对数据进行分析，计算每个细胞表面PD-1的表达水平。
总之，PD-1流式方法是一种重要的技术手段，用于检测PD-1在免疫细胞表面的表达水平，对于免疫疗法和疾病的研究具有重要意义。
流式细胞仪蛋白方法
流式细胞仪可以用于检测细胞表面的蛋白表达，其原理是利用荧光标记的抗体对目的细胞进行标记，然后通过流式细胞仪检测荧光信号，从而分析和判断待检测细胞表面蛋白的表达情况。
具体步骤如下：
1. 荧光标记抗体孵育细胞：将荧光标记的抗体与待检测细胞混合孵育，使抗体与细胞表面的目的蛋白结合。
2. 洗涤去除未结合抗体：洗涤细胞，去除未结合的抗体，减少背景干扰。
3. 流式细胞仪检测：将标记好的细胞通过流式细胞仪进行检测，记录荧光信号。
4. 结果分析和判断：通过对不同条件下细胞的荧光信号进行比较，可以分析和判断待检测细胞表面蛋白的表达差异。
流式细胞仪在蛋白检测方面具有高灵敏度、高特异性和高通量等优点，被广泛应用于生命科学、医学和药学等领域的研究。
流式技术检测CD3、CD4、CD8 T细胞方法参考1. 细胞复苏（针对上一次冻存的细胞）（1）提前打开37℃水浴锅，然后去-80℃冰箱从冻存盒取出冻存细胞，先放冰盒里。
（2）将冻存管插入水上漂，放入37℃水浴锅晃动2～3 min解冻。
擦干水渍后移入生物安全柜中，开酒精灯。
（3）15 mL离心管中提前加入7 mL培养基（1640）。
（4）用移液枪吹打混匀解冻后的细胞（冻存管中），然后将细胞（原则上将冻存管中细胞全加入，即1 mL；也可加一半，留一半）加入培养基（7 mL）中，颠倒混匀后400×g室温离心6 min（升降速分别为6和6）。
（5）倒掉上清（不需要倒干净），剩余部分吹打混匀（即所获的的细胞液）。
2. 细胞计数（1）小离心管（样品量大时，使用96孔血凝板）中加20 μL细胞染色液（2%台盼蓝，平时配制好后避光保存于4℃冰箱）。
（2）再加入20 μL上一步的细胞液，吹打混匀后加20 μL样品到细胞计数板中.（3）然后使用自动细胞计数仪（Count star，BioMed；1804443W）检测活细胞浓度。
计算加样体积：流式要求的活细胞量为1×106（标准为5×105），用此1×106（5×105）除以测得的活细胞浓度即为加样体积。
3. 细胞清洗（1）算好加加体积后将将细胞加入流式管中。
（2）再加入800 μL PBS（清洗液，总体积不要超过1 mL），400×g室温离心5 min（升降速分别为6和7）。
4. 细胞染色（染CD3、CD4、CD8的荧光抗体，保存于4℃冰箱）（1）先将上一步离心后的上清液弃掉（用移液器吸干，尽量不要有液体残留）。
（2）再加入50 μL PBS，在台上震一震混匀。
（3）3种荧光抗体分别加1 、1、2 μL（即稀释倍数分别为1:50、1:50和1:25），另外设置3个单人染的和一个不染色的对照。
（4）4℃静置染色30 min。
用流式细胞仪检测钙离子流的方法流式细胞仪（Flow Cytometry）是一种用来分析和计数细胞数量，并且可以测定它们的大小、形状、表面蛋白和内部结构等的仪器。
在生物医学研究领域中，流式细胞仪被广泛地应用于细胞分析和免疫学研究中。
钙离子流则是生物细胞中一种重要的信号传导通路，通过测定钙离子在细胞内的浓度变化，可以揭示细胞的活跃状态和生理功能。
下面我们将介绍一下使用流式细胞仪检测钙离子流的方法。
一、原理介绍流式细胞仪是通过检测细胞中的荧光信号来获取细胞信息的。
当细胞中的钙离子浓度发生变化时，可以使用荧光钙指示剂来标记细胞内的钙离子，然后通过流式细胞仪来检测这些荧光信号的强度和数量，从而获得钙离子流的信息。
荧光钙指示剂可以选择Fura-2、Fluo-3、Rhod-2等。
这些指示剂在细胞内与钙结合后会发出荧光信号，通过流式细胞仪的激光激发，可以检测到这些荧光信号，并量化细胞内钙离子浓度的变化。
二、样本处理在使用流式细胞仪检测细胞内钙离子流之前，首先需要对细胞进行处理。
通常情况下，我们可以通过细胞培养来获得细胞样本。
然后将细胞用PBS（含钙和镁）洗涤，并用荧光钙指示剂染色。
在染色过程中需要注意，不要暴露在光线下或阳光下，以免荧光钙指示剂受到光照而退化失效。
三、测定条件在使用流式细胞仪测定钙离子流时，需要设置合适的测定条件。
首先是激光的选择，钙离子指示剂的激发和发射波长需要与流式细胞仪的激光波长相匹配。
然后需要设置适当的荧光信号探测器，以确保可以检测到钙离子指示剂产生的荧光信号。
此外，还需要进行空白对照，以便排除仪器本身产生的荧光信号对测定结果的干扰。
四、数据分析完成测定后，就需要对获得的数据进行分析。
可以采用流式细胞仪的数据分析软件来分析测定结果，并绘制相应的图表。
通常会绘制荧光强度随时间变化的曲线图来展示钙离子流的动态变化。
另外，还可以统计不同样本之间的荧光强度差异，以获得更加客观的实验结果。
五、应用领域流式细胞仪检测钙离子流的方法在生物医学研究中有着广泛的应用。
流式细胞检测实验方法篇流式细胞技术（Flow cytometry, FCM）是利用流式细胞仪进行的一种单细胞定量分析和分选技术。
流式细胞术是单克隆抗体及免疫细胞化学技术、激光和电子计算机科学等高度发展及综合利用的高技术产物，它能有效地从单细胞水平区分异质性细胞群体，检测对象包括但不限于悬浮细胞、贴壁细胞或从实体组织分离的单细胞悬液和其他生物颗粒。
一、细胞表面染色步骤1. 样本准备①采集全血或组织（脾，淋巴结，胸腺和骨髓）用细胞染色buffer(或含0.1%BSA的PBS)制成单细胞悬液。
对于体外刺激的细胞，直接将刺激后的细胞悬浮在细胞染色buffer(或含0.1%BSA的PBS)中，然后进行第2步。
②加满细胞染色buffer(或含0.1%BSA的PBS), 300g离心细胞悬液5分钟，弃掉上清。
2. 红细胞裂解①需裂解红细胞（如脾脏），将10x红细胞裂解液(ACK buffer)用去离子水稀释到1x，放置到室温。
将细胞重悬于3mL的1x ACK buffer中，室温孵育3-5分钟；如不需要裂解红细胞，直接进入第3步。
②加入10mL细胞染色buffer(或含0.1%BSA的PBS)终止红细胞裂解，300g离心细胞悬液5分钟，弃掉上清。
③重复洗涤一次，加满细胞染色buffer(或含0.1%BSA的PBS)至15mL, 300g离心细胞悬液5分钟，弃掉上清。
④细胞计数，用细胞染色buffer(或含0.1%BSA的PBS)将细胞制成1x107/mL悬液。
将100μL细胞悬液加入流式管中备用。
3. 封闭Fc受体封闭Fc受体能减少染色过程中的非特异性染色。
①小鼠中，纯化的CD16/CD32单抗能和FcγRⅢ/Ⅱ结合，封闭非特异性染色，使阴性细胞的背景荧光降至未标记细胞的水平。
加入0.5-1μg纯的抗小鼠CD16/32单克隆抗体，室温孵育10分钟。
②对于人和大鼠，可直接使用过量的与荧光抗体相同来源和亚型的纯化Ig或者相同来源血清进行阻断，或者用商业化的Fc受体阻断剂。
流式细胞仪验证安全操作及保养规程1.安全操作注意事项在使用流式细胞仪前，需要了解一些重要的安全操作注意事项。
1.1.操作前准备在开始使用流式细胞仪进行实验前，需要进行以下几项准备：•检查仪器是否处于正常工作状态，确认仪器所有部件处于正确位置且完好无损。
•验证仪器是否与正确的电源相连，且电压是否符合要求。
•在使用前请仔细阅读仪器使用手册和操控手册，了解仪器的使用方法和注意事项。
1.2.操作时的注意事项在使用流式细胞仪时，需要注意以下事项：•在操作中，请戴手套、口罩、护目镜等防护用品以保障实验安全。
•在操作过程中请谨慎处理所有实验物品，包括悬浮细胞、试剂、化学物质等，以防止潜在的危险性。
•在使用前，请认真了解所有细胞、细胞培养液和试剂的性质。
针对化学品，需要了解其化学性质和可能的安全危险。
•如果产生任何实验安全问题，请立即向实验室负责人汇报。
1.3.操作后的处理在完成实验后，需要及时清理和处理实验设备和试剂。
需要注意以下事项：•仔细处理所有试剂和化学物品残余，以避免造成污染和安全隐患。
•在使用后，请及时将实验设备清洗并消毒，以便下一次使用。
•对于所有的样品和试剂，在使用完毕后，需要按照规定的方法和处置方式进行处理。
2.保养规程为了保证流式细胞仪的稳定性和可靠性，需要定期对仪器进行保养和维护。
2.1.日常维护•定期清洗所有外部器具以保证外观清洁。
•在使用后请直接关闭流量阀门。
•室温下运输仪器时，需要等待至少4小时后才能进行使用。
2.2.周期保养•在使用过程中，请避免不当使用和暴力操作。
•每隔3个月，需要对仪器进行一次全面保养，检查每个器具的精确度以及指示符和测量系统的正常性能。
2.3.异常处理•如果在实验中出现任何异常或者问题，请立即联系厂家或者技术支持人员。
•如果需要维修，请按照说明书上的流程进行步骤。
任何私自处理都可能会导致更大的损害。
结论通过对流式细胞仪的安全操作和保养规程的详细说明，可以让我们更加清晰地了解如何安全、高效地进行实验操作。
流式细胞仪的使用方法及相关资料
仪器名称：流式细胞仪
生产厂家：美国贝克曼库尔特有限公司
使用方法：
一．开机程序
1．检查稳压器电源，打开电源，稳定5分钟。
2．打开储液箱，倒掉废液, 并在废液桶中加入400ml漂白水原液。
打开压力阀，取出鞘液桶，将鞘液桶加至4/5满（一般可用三蒸水，做分选必须用PBS或FACSFlow），合上压力阀。
确实盖紧桶盖，检查所有管路是否妥善安置。
3．将FACSCalibur开关打开，此时仪器功能控制钮的显示应是STANDBY，预热5－10分钟。
排出过滤器内的气泡。
4．如果需要打印，打开打印机电源。
5．打开电脑,等待屏幕显示出标准的苹果标志。
6．执行仪器PRIME功能一次，以排除Flow cell中的气泡。
7．分析样品时，先用FACAFlow 或PBS进行HIGH RUN约2分钟。
做过分选后，每次开机后需冲洗管道：向分选装置上装上两个50ml离心管，不接通浓缩系统，摁下右下角白色按钮开始冲洗。
待自动停止后接通浓缩装置，同上法冲洗一次。
二．预设获取模式文件(Acquisition Template Files)
1．从苹果标志中选择CELLQuest见一个新视窗，可利用此视窗编辑一个获取模式文件。
2．选取屏幕左列绘图工具中的Dot plot，绘出一个或多个Dot Plots（点图）。
从Dot Plot对话框中选取Acquisition作为图形资料来源，并确定适当的x轴和y轴参数。
3．选取屏幕左列绘图工具中的Histogram，同上法可绘出Histogram（直方图）。
4．将此视窗命名后储存于FACStation G3\BD Applications \CELLQuest Folder \EXP文件夹中，下次进行相同实验时可直接调用。
本计算机中已设定两个模式文件：ACQ和EXP，储存于FACStation G3\BD Applications \CELLQuest \EXP文件夹中，ACQ用于细胞DNA检测，EXP用于细胞表面标志分析。
三．用CELLQuest进行仪器的设定和调整
1．从苹果画面中选取CELLQuest，进入CELLQuest后在File指令栏中打开合适的获取模式文件。
2．从屏幕上方Acquire指令栏中，选取Connect to Cytometer（快捷键：＋B）进行电脑和仪器的连机。
将出现的Acquisiton Control对话框移至合适位置。
3．从Cytometer指令栏中，开启Detectors/Amps、Threshold、Compensation、Status 等四个对话框，并将它们移至屏幕右方，以便获取数据时随时调整获取条件。
也可以用+1，2，3，4获得此四个对话框。
4．在Detectors/Amps对话框中，先为每个参数选择适当的倍增模式(amplifier mode)：线性模式Lin或对数模式Log。
一般进行细胞表面抗原分析如分析外周
血的淋巴细胞亚群时，FSC和SSC多以线性模式Lin测量，且DDM Param选择FL2，而FL1, FL2与FL3则以对数模式Log测量；分析细胞DNA含量时，FSC，SSC，FL1，FL2，FL3皆以Lin进行测量，且DDM Param选择FL2；分析血小板表型时，FSC，SSC，FL1，FL2，FL3等均以Log进行测量。
5．放上待检测的样品，将流式细胞仪设定于RUN，流速可在HIGH 或LOW上。
6．在Acquisiton ”。
3Control对话框中，选取Acquire，开始获取细胞。
在以下的仪器调整过程中随时选取Pause，Restart以观察调整效果。
未完全调整好之前不要去掉SETUP前的“
7．在Detectors/Amps对话框中，调整FSC和SSC探测器中的信号倍增度：PMT voltages（粗调）与Amp Gains（细调），使样品信号出现在FSC-SSC点图内,且三群细胞合理分布。
8．在Threshold 对话框中选择适当的参数设定Threshold，并调整Threshold的高低，以减少噪音信号（细胞碎片）。
一般做细胞表型时用FSC－H而做DNA 时用FL2－H。
Threshold并不影响检测器对信号的获取，但可改善画面质量。
9．从屏幕左列绘图工具中选取Region（区域），并在靶细胞周围设定区域线，即通常所说的门。
圈定合适的细胞群可使仪器调整更为容易。
10．在Detectors/Amps对话框中，调整荧光检测器（FL1, FL2, FL3, FL4等）的倍增程度。
根据所用的荧光阴性对照样品调整细胞群，使之分布在正确的区域内。
11．在Compensation对话框中，根据所用的调补偿用标准荧光样品调整双色（或多色）荧光染色所需的荧光补偿。
比如应该为FL1+ FL2- 的细胞群却分布在FL1＋FL2＋区域内，则需调大FL2－？％FL1中的“？”，并从FL1-FL2点图中观察新的调整是否恰当
12．在Status对话框中可见：Laser Power:正常值—Run/Ready为14.7mW，Standby 为5mW；Laser current:正常值为6Amps左右。
13．调整好的仪器设定可在Instrument Settings对话框中储存，下次进行相同实验时可调出使用，届时只需微调即可。
本计算机中已有三个名叫储存于FACStation G3 \BDΞ Applications \CELLQuest Folder \IMM-InstrSettings及FACStation G3 \BD Files \Instrument Settings Files \CalibFile和Mast-Cell-Set的参数文件，前二者可用于分析人白细胞，后者用于分析小鼠肥大细胞。
四．通过预设的获取模式文件进行样品分析
1．从苹果标志中选择CELLQUEST，新视窗出现后从File指令栏中选择Open，打开预设的获取模式文件。
2．从屏幕上方Acquire指令栏中，选取Connect to Cytometer进行电脑和仪器的连机。
将出现的Acquisiton Control对话框移至合适位置。
3．从Cytometer指令栏中选取Instrument Settings，在其对话框中选择Open以调出以前存储的相同实验的仪器设定，按Set 确定。
4．在Acquire指令栏中，选择Acquisition&Storage决定储存的细胞数，参数，信号道数。
其中Resolution在做细胞表面标志时选择256，做DNA时选择1024。
Parameter Saved…则根据不同的检测对象选择不同的参数。
5．在Acquire指令栏中，选择Parameter Description，以决定文件存储位置(folder)，文件名称(file)，样品代号以及各种参数的标记(panel)，即安排tube1，2，3…的检测参数。
一般本仪器获取的数据按照检测对象的不同分别储存于FACStation
G3\BD Applications \CELLQuest \IMM 和DNA 文件夹中。
文件根据日期命名。
6．在Cytometer指令栏中，选择Counters，将此对话框移至合适位置，以便于随时观察events计数。
7．将样品试管放至检测区，在Acquire Control对话框中选取Acquire以启动样品分析测定。
8．微调仪器设定，待细胞群分布合适后选择Acquire Control对话框中Pause, Abort, ”，开始正式获取信号，存储数据。
3去除Setup前的“
9．当一定数目的细胞被测定后，获取会自动停止，并会自动存储数据。
重复步骤7，继续分析下一个样品，直到所有的样品数据分析完毕。
Ξ当所有样品分析分析完毕，即换上三蒸水，并将流式细胞仪置于“STANDBY”状态，以保护激光管。
五．关机程序：
1．从File中选择Quit, 退出软件，选择Don’t Save至苹果屏幕。
2．用4ml 1：10稀释的漂白水作样品，将样品置于旁位（vacuum is on），以外管吸去约2ml，在将样品架置于中位（vacuum is off），再HIGH RUN 5分钟（内管吸去2ml）。
3．改用三蒸水4ml作样品,同上处理。
4．按Prime三次。
5．此时仪器自动转为STANDBY状态，换2ml三蒸水。
必须在仪器处于“STANDBY”状态10分钟后再依次关掉计算机、打印机、主机、稳压电源，以延长激光管寿命，并确保应用软件的正常运行。
6．填写使用登记表。
