血清碱性磷酸酶的活性测定

碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP/ALP）活性测定试剂盒说明书分光光度法50管/24样注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：AKP/ALP是一种含锌的糖蛋白酶，在碱性环境中可水解各种天然及人工合成的磷脂单酯化合物。

AKP/ALP 广泛分布于人体各脏器中，以肝脏为主。

测定原理：在碱性环境中，AKP/ALP催化磷酸苯二钠生成游离酚；酚与4-氨基安替比林和铁氰化钾反应红色亚醌衍生物，在510nm有特征光吸收；通过测定510 nm吸光度增加速率，来计算AKP活性。

自备仪器和用品：可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿和蒸馏水。

试剂组成和配制：试剂一：液体×1瓶，4℃保存。

试剂二：液体×1瓶，4℃避光保存。

试剂三：液体×1瓶，4℃避光保存。

试剂四：液体×1瓶，4℃避光保存，未变成蓝绿色之前均可使用。

标准品：液体×1支（EP管中），2 μ mol/mL酚标准液，4℃保存。

粗酶液提取：1. 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆，4℃、8000g离心10min，取上清液待测。

2. 细菌或细胞：按照细菌或细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。

3. 血液可直接测定，或者适当稀释后测定。

测定步骤：1. 分光光度计预热30min，调节波长到510 nm，蒸馏水调零。

2. 试剂三置于37℃水浴中预热30 min。

3. 空白管：取EP管，加入20μL蒸馏水，200μL试剂二，200μL试剂三，混匀后置于37℃水浴中保温15min；加入试剂四600μL，混匀后于510 nm测定吸光度，记为A空白管。

实验日期：2023年10月25日实验地点：生化实验室实验目的：1. 了解碱性磷酸酶（AKP）的分离纯化原理和方法。

2. 掌握碱性磷酸酶活性测定的原理和方法。

3. 通过实验验证碱性磷酸酶的动力学特性，计算其米氏常数（Km）和最大反应速度（Vmax）。

实验原理：碱性磷酸酶（AKP）是一种非特异性磷酸单酯酶，主要存在于动物和微生物体内，具有磷酸基团转移活性。

在碱性条件下，AKP能水解多种磷酸单酯化合物，生成相应的醇和磷酸盐。

本实验采用有机溶剂沉淀法从兔肝匀浆液中提取分离AKP，并通过比色法测定其活性。

实验材料：1. 兔肝匀浆液2. 丙酮3. 0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）4. 磷酸苯二钠5. 4-氨基安替比林6. 铁氰化钾7. 移液管、移液枪、试管、试管架、恒温水浴箱、分光光度计实验步骤：1. 碱性磷酸酶提取：- 将兔肝匀浆液与丙酮以体积比1:1混合，室温下静置过夜。

- 4,000 rpm离心10分钟，弃去上清液。

- 将沉淀用0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）溶解，得到碱性磷酸酶粗提液。

2. 碱性磷酸酶活性测定：- 取6支试管，分别加入0.02 mol/L磷酸苯二钠溶液、0.1 mol/L Tris-HCl 缓冲液（pH 8.0）、4-氨基安替比林溶液和铁氰化钾溶液。

- 在上述溶液中加入不同浓度的碱性磷酸酶粗提液，混匀后置于恒温水浴箱中反应10分钟。

- 在510 nm波长下测定吸光度，以酶活力单位（U）表示。

3. 米氏常数（Km）和最大反应速度（Vmax）计算：- 以酶活力单位（U）为纵坐标，底物浓度（mol/L）为横坐标，绘制酶活力曲线。

- 利用双倒数法（Lineweaver-Burk plot）计算米氏常数（Km）和最大反应速度（Vmax）。

实验结果：1. 碱性磷酸酶活性曲线：- 随着底物浓度的增加，酶活力逐渐增加，但在一定浓度后趋于稳定。

2. 米氏常数（Km）和最大反应速度（Vmax）：- 米氏常数（Km）为0.05 mol/L，最大反应速度（Vmax）为150 U/min。

血清碱性磷酸酶测定标准操作规程1.检验原理：(对硝基酚磷酸盐连续监测法)以磷酸对硝基酚二钠(PNPP)为底物，2—氨基-2-甲基丙醇(AMP)为磷酸酰基的受体。

在碱性环境，碱性磷酸酶催化PNPP水解产生的游离对硝基酚，对硝基酚在碱性溶液中转变成黄色。

根据在405nm 处吸光度增高速率来计算碱性磷酸酶的活性单位。

PNPP+H2O9阻'->对硝基酚+无机磷-20°C保存7天，样本不可反复冻融！4.检验方法；仪器法(详见DF-603/DI-600标准操作规程)5.参考范围6.检验结果的解释：6.1样本含量超出线性范围时，建议用0.9%(W∕V)的氯化钠溶液稀释样本。

7.2.单位换算：ukat∕L=U∕L*16.67*IO-38.检验方法的局限性8.1结果的准确性依赖于仪器的校正和测定温度、时间的控制。

7.2若试剂浑浊或以水空白在405nm处吸光度大于1.000时不能使用。

8.试剂性能指标8.1试剂外观：R1：无色透明液体，无悬浮物及沉淀；R2无色或淡黄色透明液体，无悬浮物及沉淀。

8.2装量：不低于标识值。

8.3空白吸光度：在37℃、405rπn处，光径IenI时，空白吸光度A≤1.0008.4空白吸光度变化率：在37C、405nm处，光径ICm时，用生理盐水作为样品加入试剂测试时，Z∖A∕minW0.005.1.15分析灵敏度：在405nm处,光径Icm时，测量120U/L的碱性磷酸酶时，吸光度变化4A∕min20.015.8.6线性范围：试剂的线性区间为[25-750]U∕L,在此线性区间内：a)线性相关系数r应不小于0.9900；b)[25-100]U/L区间内，线性绝对偏差不超过土10U/L；(100-750)U/L区间内,线性相对偏差不超过±10%。

8.7重复性:CV≤5%8.8批间精密度:R≤10%8.9准确度：相对偏差应不大于±10%。

8.10稳定性：(2-8)C下，原包装存放的试剂有效期为12个月,取到期后一个月的试剂进行测试，应满足1-7、9的要求。

碱性磷酸酶的提取分离和比活力的测定碱性磷酸酶是一种广泛存在于生物体内的酶，能够催化酸性环境下的磷酸酯水解反应，在多种生理过程中发挥重要作用。

其提取分离和比活力的测定具有重要的科学研究价值和应用前景。

一、碱性磷酸酶的提取分离1、组织样品制备将待提取的组织放入离心管中，加入磷酸盐缓冲液（pH 7.4），用高速离心离心3-5分钟，去除上清液并加入1mL磷酸盐缓冲液，在实验台上加入玻璃珠或石英砂，放入冰箱冷冻器中。

2、细胞裂解将组织经过粉碎的样品加入磷酸盐缓冲液（pH 7.4），放入研钵中，加入冰冷甲醇，研磨5-10分钟。

将打磨液离心分离，上清液用分液漏斗收集，加入等量的0.1mol/L四乙基铵溶液，静置20分钟，收集上清液并加入2.5%聚乙烯醇。

3、沉淀和提取将沉淀后的样品中加入氯仿等有机溶剂，轻微摇动，分离出沉淀，将上清液倒入烧瓶中，并用氯仿洗涤，收集洗涤液后将其合并，加入甲醇进行沉淀，离心分离，去除上清液，加入2-3倍体积的丙酮，静置反复冲洗多次。

将沉淀中加入适量的溶解液，摇混均匀，转移至离心管中，并用离心机转速2800r/min/5 min。

二、碱性磷酸酶的比活力测定1、酶活性试验体系将提取分离后的活性酶样品用注射器加入已配制好的酶活性试验体系中，包括10mM Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）、1 mM EDTA缓冲液、2 mM酚酞液、0.1M NaCl等，总体积为2ml。

2、样品处理制备所需要的各种试剂和标准品，并制备好标准品不同浓度的稀释液。

将稀释后的酶样品取1ml，加入酶活性试验体系中，并在无酶样品控制下，以相同的温度下逐渐加入不同的底物溶液，如α-萘酚磷酸钠。

注意不要影响反应溶液 pH 值和终点的颜色产生，以免误诊。

3、反应终止在反应末期，可以加入固定量的0.1N NaOH终止反应，并使用p-酚酸作为对照品和标准品进行比较或质控，并测定比活力。

综上所述，选择合适的方法提取分离和测定碱性磷酸酶的比活力对于进一步探究其在生理过程中的作用机制以及相关疾病的诊断和治疗等方面具有重要的意义。

碱性磷酸酶值测定实验报告一、实验目的碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase，简称 ALP）是一种广泛分布于人体肝脏、骨骼、肠、肾和胎盘等组织经肝脏向胆外排出的一种酶。

本次实验的目的是测定样本中碱性磷酸酶的活性，以评估相关生理或病理状态。

二、实验原理碱性磷酸酶在碱性环境下能够催化磷酸酯的水解反应，生成无机磷和醇。

通过测定生成的无机磷的量，可以间接反映碱性磷酸酶的活性。

本实验采用磷酸苯二钠法，磷酸苯二钠在碱性条件下被碱性磷酸酶水解生成苯酚和磷酸氢二钠。

苯酚与 4-氨基安替比林反应生成红色醌亚胺衍生物，在 510nm 波长处有最大吸收峰。

通过测定吸光度值，并与标准曲线对照，即可计算出碱性磷酸酶的活性。

三、实验材料与设备1、材料血清样本磷酸苯二钠溶液碳酸盐缓冲液（pH 100）4-氨基安替比林溶液铁氰化钾溶液酚标准液2、设备分光光度计恒温水浴锅移液器试管、刻度吸管等四、实验步骤1、标准曲线的绘制取 6 支干净试管，分别编号为 0、1、2、3、4、5。

按表 1 向各试管中加入试剂，混匀。

置于 37℃水浴中保温 15 分钟。

加入铁氰化钾溶液 30ml，立即混匀。

用分光光度计在 510nm 波长处，以 0 号管调零，读取各管的吸光度值。

以酚含量（μg）为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。

表 1 标准曲线绘制的试剂加入量｜试管编号|0|1|2|3|4|5|｜｜｜｜｜｜｜｜｜酚标准液（ml）｜0|005|010|020|030|040|｜蒸馏水（ml）｜10|095|090|080|070|060|｜碳酸盐缓冲液（ml）｜30|30|30|30|30|30|｜4-氨基安替比林溶液（ml）｜10|10|10|10|10|10|｜铁氰化钾溶液（ml）｜30|30|30|30|30|30|2、样本测定取 3 支干净试管，分别编号为测定管、对照管和空白管。

按表 2 向各试管中加入试剂，混匀。

置于 37℃水浴中保温 15 分钟。

血清碱性磷酸酶ALP测定1 检验目的指导本室工作人员规范操作本检测项目，确保检测结果的准确。

2 实验原理本试剂以国际临床化学会（IFCC）推荐方法为基础，所采用的反应原理与反应式如下。

ALP对-硝基苯磷酸盐 + H2O ----------- 对硝基酚 + 磷酸在上述反应中，对-硝基苯酚的生成速率与样本中碱性磷酸酶的活力成正比。

通过在405 nm处监测吸光度的上升速率，即可测得样本中碱性磷酸酶的活性。

3 标本采集与处理：3.1 病人准备：无特殊要求。

3.2 标本类型：标本最好是无溶血的血清。

3.3 血清分离：应在收集后两小时内分离出来。

避免使用含EDTA或草酸盐的血浆。

3.4 标本存放：2～3天内的活性损失：15～25℃保存：<10%；标本稳定性：4～8℃保存稳定7天；-20℃保存至少可稳定2个月标本。

如果分析延迟8小时以上，最好把血清冷藏。

冷冻的血清在融解后会表现出血清值的显著降低。

3.5 标本运输：常温条件下运输3.6 标本拒收标准：细菌污染的不能做测定。

4 实验材料：4.1 试剂：上海复星长征医学科学有限公司ALP试剂盒（沪食药监械（准）字2014第2400166号 YZB/沪 1546-40-2014）4.1.1 试剂组成试剂1（R1）：乙酸镁3.0mmol/L硫酸锌 1.5mmol/LHEDTA 3.0mmol/LAMP缓冲液420mmol/L试剂2（R2）：对-硝基苯磷酸盐81.5mmol/LAMP缓冲液420mmol/LHEDTA5.0mmol/L4.1.2 试剂准备：试剂为即用式。

4.1.3 试剂稳定性与贮存：在2～8℃避光、密封的储存条件下，试剂（盒）自生产之日起有效期为12个月。

试剂启用后，在2～10℃避光的条件下可稳定14天。

4.1.4 变质指示：当试剂有浊度时，表明有细菌污染，不能继续使用。

4.1.5 注意事项：试剂中含有稳定剂，可能存在一定的刺激作用或毒性，请勿直接接触皮肤、眼睛。

碱性磷酸酶km测定实验报告碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，简称ALP）是一种存在于人体组织和体液中的酶类，其活性的测定对于临床诊断和疾病监测具有重要意义。

本文将对碱性磷酸酶的KM测定实验进行详细介绍和分析。

一、实验目的本实验旨在测定碱性磷酸酶的KM值，以了解其底物浓度对酶活性的影响，并探讨酶底物的亲和力。

二、实验原理碱性磷酸酶是一种催化磷酸酯水解的酶，其底物为磷酸酯类物质。

当底物浓度较低时，酶活性会受到限制，因此，通过测定不同底物浓度下的酶活性，可以得到碱性磷酸酶的KM值。

KM值是酶与底物结合的亲和力指标，数值越小表示酶对底物的结合越紧密。

三、实验步骤1. 准备实验所需材料和试剂，包括碱性磷酸酶酶液、磷酸酯底物、缓冲液等。

2. 制备一系列不同浓度的磷酸酯底物溶液，如0.1 mM、0.2 mM、0.3 mM等。

3. 将不同浓度的磷酸酯底物溶液分别与碱性磷酸酶酶液混合，使其反应一定时间。

4. 停止反应，并加入一定量的酶抑制剂，以停止碱性磷酸酶的活性。

5. 使用特定的检测方法，如比色法或荧光法，测定反应液中产生的产物浓度。

6. 根据不同底物浓度下产物浓度的变化，绘制酶活性与底物浓度的曲线。

7. 通过曲线拟合，计算出碱性磷酸酶的KM值。

四、实验结果与分析根据实验数据绘制的酶活性与底物浓度曲线，可以观察到酶活性随着底物浓度的增加而逐渐增加，但增加速率逐渐减缓。

这是因为底物浓度增加，酶与底物的结合也增加，但当底物浓度达到一定程度时，酶的活性已经接近饱和状态，进一步增加底物浓度对酶活性的影响较小。

通过对曲线的拟合，可以计算出碱性磷酸酶的KM值。

KM值表示酶与底物结合的亲和力，数值越小表示酶对底物的结合越紧密。

在实验中，我们可以通过计算得到不同底物浓度下的KM值，从而了解碱性磷酸酶与底物之间的亲和力变化情况。

五、实验误差与改进在实验过程中，可能存在一些误差，如底物溶液的制备误差、酶活性的测定误差等。