实验七骨髓细胞染色体的制备与观察
[实验目的]
1.小白鼠等骨髓细胞染色体的制备，初步掌握低渗法制备动物骨髓细胞染色体的方法。
2. 熟悉染色体的形态、种类及青蛙、小白鼠等动物染色体的数目或类别。
[实验原理]
骨髓细胞是具有旺盛分裂能力的细胞，从这些分裂细胞中，可观察到处于分裂中期的染色体，能对一种动物染色体的形态特征、数目进行准确的观察和分析。
由于骨髓直接涂片观察到的分裂相少，效果差，因此要对骨髓细胞进行必要的处理。
这个处理方法称为低渗法，其基本要求首先是要获得较多的中期分裂相。
秋水仙素对分裂期纺锤丝的形成具有破坏作用，当动物被注射适量的秋水仙素后，处于分裂增殖中的骨髓细胞由于纺锤丝不能形成，中期染色体不能正常趋向两极，到达后期、末期，因而大量的细胞处于观察染色体形态最佳的分裂中期。
其次是要能够清楚的观察染色体的形态。
为了达到此目的，取出的骨髓细胞要经过低渗（kcl溶液）使细胞膨胀、染色体适当的分散。
固定（甲醇、冰醋酸）使染色体保持完好的形态。
染色（giemsa液）使染色体易分辨、观察。
制备优良的标本可获得满意的观察效果。
利用动物骨髓制作染色体观察标本取材容易，不需培养，不需无菌操作，比较简便，是生物学实验教学中常用的方法。
一般选用的动物有青蛙、蟾蜍、小白鼠、大白鼠等。
[实验用品]
1. 动物：青蛙或小白鼠、大白鼠、蟾蜍，雌雄均可。
2. 试剂：0.02﹪秋水仙素、0.075mol/l氯化钾 (kcl)、3:1甲醇、冰醋酸固定液、吉姆萨（giemsa）染液、香柏油或液体石蜡、二甲苯。
3. 器材：解剖盘、小镊子、剪刀、注射器（2ml、5ml各一支）、刻度离心管、玻璃吸管、预冷载玻片、染色缸、玻片盒、量筒（10ml、50ml、100ml各一支），恒温水浴箱，盘架天平（配备等大的小烧杯两个）、电吹风、显微镜、吸水纸、擦镜纸、酒精灯、火柴。
[实验内容与方法]
一、试剂配制
1. 0.02﹪秋水仙素溶液：秋水仙素2mg，灭活生理盐水（蛙类0.65﹪、哺乳类0.85﹪的nacl）10ml溶解，避光保存。
2. 0.075mol/l kc1溶液：
原液： kcl 11.8g双蒸水100ml溶解。
使用液：原液1份，双蒸馏水19份混合，
3. 吉姆萨 (giemsa)染液：
原液：吉姆萨染粉0.5g，甘油33ml，甲醇33ml，配制时先将giemsa粉置于研体中，加入少量甘油，研磨至无颗粒，再加入余下的甘油，拌匀后放入56℃温箱中保温2小时，然后取出加入甲醇，充分拌匀，滤纸过滤用棕色瓶密封，避光保存，一般要放置2周后才能使用。
使用液：原液1份，ph6.8磷酸缓冲液9份稀释。
使用液不宜长期保存，一般现配现用。
4. ph6.8磷酸缓冲液：该液可先配成甲液和乙液，然后混合使用。
甲液：kh2po4 0.907g蒸馏水100ml溶解。
乙液：na2hpo4·2h20 1.18g（或na2hpo4·12h20 2.38g）加蒸馏水100ml溶解。
使用液 (ph6.8)：甲液50.8ml，乙液49.2ml混合，该使用液也不易久放，一般也是现配现用。
二、染色体制备
各种动物骨髓细胞染色体的制备方法基本都采用低渗法，现以青蛙为例，说明其制备的过程。
1. 取健康小鼠一只，按每10g体重由腹腔注入含量为0.02% 的秋水仙素0.3ml（此步在实验前12～24小时完成，哺乳动物在实验前2～4小时完成）。
2. 将青蛙处死，迅速取出后腿长骨，包括股骨和胫骨，为了获得较多的骨髓细胞，前肢亦可使用。
3. 用剪刀、镊子剥离肌肉及结缔组织，剪去两头的骨结，迅速用5ml注射器抽取0.075mol/l 的kcl溶液，从一头插入骨髓腔冲洗，冲洗液接入刻度离心管内，反复多次，直至骨髓腔变白。
此时不要让组织块掉进离心管，如掉入，一定要用镊子或吸管取出。
加低渗液至5ml或8ml刻度，放入37℃恒温水浴箱内低渗处理25分钟。
4. 低渗完毕，取出离心管，向离心管中加入1ml左右3﹕1甲醇、冰醋酸固定液进行预固定。
1～2分钟后，每两支离心管成对放在天平上配平，使两支管的重量相等，然后将这两支管对应的放入离心机内的孔中，以1 500r/min 离心5～8分钟。
5. 取出离心管，弃去上清液，再加固定液至6～8ml，用玻璃吸管沿离心管壁吹打，使沉淀的细胞团块在固定液中充分均匀，然后放入37℃水浴箱中固定15～20分钟。
6. 再取出离心管，配平后离心5～8分钟，转速同样为1 500r/min。
离心完毕，去掉上清液，再加入1ml左右的固定液，用吸管吹打，制成细胞悬液。
7. 取预冷湿玻片一张，用吸管吸取细胞悬液，从30cm左右的高度滴到载玻片上，再用口吹散滴液，置于酒精灯上微微火烤，最后放玻片架或玻片盒中晾干。
8. 将晾干的玻片放入吉姆萨应用液染色缸中，或将玻片平放于桌上，将染液滴在片上染色。
染色10分钟后，用蒸馏水或自来水小心冲去染液，电吹风吹干后镜检。
三、染色体观察
将制好的玻片置于显微镜下，首先观察标本的制备效果，检验操作过程是否正确。
一般来说，制得好的标本应是细胞多、颜色为紫红色。
此时间期细胞由于低渗和固定处理，细胞膜和质已被去掉，镜下看到的仅为膨胀后呈圆形的细胞核。
分裂期细胞染色体集中在一起，其外也无细胞膜包裹，染色体之间无重叠，易分辨，臂的长度适中。
但最重要的是分裂相要多。
分裂相的多
少主要取决于秋水仙素的用量和时间。
秋水仙素还影响染色体的形态，如用量过大，常使染色体过于缩短，不利于观察。
青蛙体细胞的染色体数目(2n)为26条，性染色体机制为xx - xy，即雌性为xx，雄性为xy。
染色体的形态随青蛙种类不同略有差异，主要表现为亚中着丝粒染色体的序号和数目不同，如黑斑蛙的亚中着丝粒染色体为3、7、8、11、12等5对染色体，金线蛙为3、7、11、12等4对染色体，虎纹蛙为3、6两对染色体。
小白鼠的染色体数目（2n）为40条，但全部为端着丝粒染色体，大小区别不明显，较难分组编号。
图 6-1 小鼠染色体核型
大白鼠的染色体（2n）为42条，家兔的染色体（2n）是44条。
观察染色体时，不需加盖玻片，镜下先用低倍镜调好焦距，找到无离散，无重叠，形态好，可记数的一个分裂相，然后转高倍镜或油镜观察、记数，观察完毕后也不需擦试玻片，这样的玻片可保存数月。
表6-1 几种动物染色体形态特征
动物名称染色体数染色体类型x染色体形态y染色体形态
青蛙26中央、亚中央着丝粒染色中央着丝粒染色中央着丝粒染色
体体，介于6～7号体，介于8～9号小白鼠40全部为近端着丝粒染色体大小介于5～6号大小介于19～20
号
大白鼠42中央、亚中央近端着丝粒
染色体近端着丝粒染色
体，介于4～5号
近端着丝粒染色
体，介于18～19号
家兔44中央、亚中央近端着丝粒
染色体亚中央着丝粒染色
体，介于5～6号
近端着丝粒染色
体，介于19～20号
[注意事项]
1. 腹腔注射秋水仙素溶液时，注意不要使针头损伤动物内脏。
2. 制片所用离心管、吸管等勿必洗涤干净，否则细胞会滞留于管壁收集不到细胞导致实验失败。
3. 离心时，离心管一定要先平衡，然后在离心机中对应放置。
4. 使用药品时要注意药名标签，注意使用正确浓度。
5. 观察计数染色体数目时，观察的分裂相一般要在10个以上，这样计数才比较准确。
[实验报告与思考题]
绘图
绘制一个你所观察到的动物骨髓细胞染色体分裂相。
思考题
1. 简述青蛙骨髓细胞染色体的制备过程。
2. 制片过程中为什么要进行低渗处理？低渗的时间长短对染色体制片效果有何影响？
3. 在取骨髓前为什么要给动物注射秋水仙素?。
