脾脏流式细胞术

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710321625.1(22)申请日 2017.05.09(71)申请人 成都扬克斯生物科技有限公司地址 610094 四川省成都市高新区益州大道中段722号4栋14楼1404号(72)发明人 彭西　于正强　胡东　李林蔚　(74)专利代理机构 北京科亿知识产权代理事务所(普通合伙) 11350代理人 汤东凤(51)Int.Cl.G01N 15/14(2006.01)(54)发明名称小鼠胸腺或脾脏T淋巴细胞亚群的流式细胞术检测方法(57)摘要本发明公开了一种小鼠胸腺或脾脏T淋巴细胞亚群的流式细胞术检测方法，包括以下步骤：获取试验小鼠的胸腺或脾脏组织，制备单细胞悬液；分别吸取所述胸腺或脾脏单细胞悬液，分别加入抗小鼠的CD3、CD4、CD8单克隆抗体各一头份，旋涡混匀，于4℃避光染色；染色后，用PBS液洗涤并重悬细胞，使用流式细胞仪进行检测；分析检测结果，获得小鼠胸腺或脾脏各亚群T淋巴细胞的百分比。

本发明成功建立了稳定规范的流式细胞术检测小鼠胸腺或脾脏T淋巴细胞亚群的方法，通过对样品前处理、检测和分析过程中的目标细胞选取、补偿调节及参数选择的问题进行改进，避免了试验过程中人为因素造成的误差，提高了结果判断的真实性和客观性。

权利要求书1页 说明书6页 附图3页CN 107132177 A 2017.09.05C N 107132177A1.一种小鼠胸腺或脾脏T淋巴细胞亚群的流式细胞术检测方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，获取试验小鼠的胸腺或脾脏组织，制备单细胞悬液；步骤2，吸取所述胸腺或脾脏单细胞悬液，分别加入两支流式上机管中一支管中加入抗小鼠的CD3、CD4、CD8单克隆抗体，旋涡混匀，于4℃避光染色，用作检测管；另一支用作阴性设置管；步骤3，染色后，用PBS液洗涤并重悬细胞，使用流式细胞仪进行检测；步骤4，分析检测结果，获得小鼠胸腺或脾脏各亚群T淋巴细胞的百分比。

《医疗器械免疫原性评价方法第6部分：用流式细胞术测定动物脾脏淋巴细胞亚群》标准编制说明一、工作简况1.任务来源根据2018年医疗器械标准制修订工作安排，由全国医疗器械生物学评价标准化技术委员会归口，山东省医疗器械产品质量检验中心、北京市医疗器械检验所负责制订YY1465.6《医疗器械免疫原性评价方法第6部分：用流式细胞术测定动物脾脏淋巴细胞亚群》。

2.标准体系YY/T1465的总标题是医疗器械免疫原性评价方法，包括以下部分：—第1部分：体外T淋巴细胞转化试验；—第2部分：血清免疫球蛋白和补体成分测定ELISA法；—第3部分：空斑形成细胞测定琼脂固相法；—第4部分：小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验半体内法；—第5部分：用M86单克隆抗体测定动物源性医疗器械中α-Gal抗原清除率；—第6部分：用流式细胞术测定动物脾脏淋巴细胞亚群。

有关其他方面的免疫原性试验将有其他部分的标准。

3.工作过程在接到标准制定任务后，标准起草工作组认真研究，于2018年3月召开首次视频工作组会议，召集共同验证单位确定工作组讨论稿和标准验证方案。

在分析验证结果和对标准内容进行充分讨论后,工作组于7月底完成并发出征求意见稿。

二、标准编制原则和确定标准主要内容的论据。

标准修订工作组按照GB/T1.1—2009的规则制定本部分。

1、医疗器械中免疫原的来源免疫原即医疗器械中所含有的，可以刺激机体发生免疫应答的异源性物质。

蛋白质作为免疫原性物质的可能性最大，其次是多糖，核酸和脂质等。

小分子量的物质通常没有免疫原性，然而，它们可以通过与宿主蛋白结合并改变蛋白的构象来获得免疫原性。

对于医疗器械而言，聚合材料、陶瓷制品及金属材料可能具有的溶出物、磨损或可降解部分能够与宿主蛋白结合。

生物源性的材料，如胶原，天然乳胶蛋白，白蛋白和动物组织等都可以刺激机体发生免疫应答。

2、国际上对医疗器械免疫毒性评价的要求医疗器械中所含的免疫原性物质是导致其免疫毒性的原因。

小鼠脾细胞流式实验步骤概述说明以及解释引言部分的内容应包括概述、文章结构和目的。

1. 引言1.1 概述：本文旨在介绍小鼠脾组织中的细胞流式实验步骤。

流式细胞术是一种广泛应用于生物医学研究领域的技术，它能够对单个细胞进行高通量分析，并且在分析多个参数时提供了准确性和高度灵活性。

通过对小鼠脾细胞进行流式实验，我们可以深入了解该组织内不同类型细胞的数量、表型和功能，从而为进一步的研究提供重要依据。

1.2 文章结构：本文分为四个主要部分：引言、小鼠脾细胞流式实验步骤概述、正文和结论。

在引言部分，我们将简要概述本文要讨论的主题，并介绍文章结构；然后，在小鼠脾细胞流式实验步骤概述部分，我们将详细介绍研究对象的相关信息，并解释流式细胞术的基本概念；接下来，在正文部分，我们将重点讨论关于细胞处理和标记方法、流式细胞仪操作步骤以及数据分析与统计方法的内容；最后，在结论部分，我们将总结实验结果和发现，并对其意义、局限性以及下一步研究提出展望和建议。

1.3 目的：本文的目的是向读者全面介绍小鼠脾细胞流式实验步骤。

通过详细阐述实验设计、样本制备、细胞处理和标记方法、流式细胞仪操作步骤以及数据分析与统计方法，我们希望读者能够理解并掌握小鼠脾细胞流式实验的基本原理和操作技巧。

同时，通过讨论实验结果与发现的总结、结果意义与局限性的讨论以及对下一步研究的展望和建议，我们希望启发读者思考关于小鼠脾组织中特定类型细胞功能和相互作用机制方面的问题，为相关领域的深入研究提供思路和指导。

2. 小鼠脾细胞流式实验步骤概述：2.1 研究对象介绍：小鼠脾细胞是指从小鼠脾脏中分离出的细胞群体。

小鼠脾脏是淋巴系统的重要器官之一，其中包含各种免疫细胞，如B细胞、T细胞、巨噬细胞等。

小鼠脾细胞流式实验通过对这些免疫细胞进行标记和分析，可以帮助我们了解免疫反应的机制以及疾病发生过程中免疫系统的变化。

2.2 流式细胞术概念解释：流式细胞术（flow cytometry）是一种用于分析和计数单个活动或已死亡的细胞的技术。

流式细胞分析和混合淋巴细胞反应实验中小鼠脾脏的摘取最近老婆要提取脾脏细胞做流式，我就做个简单的解说，也顺便传到网上供菜鸟理解，如果有大神看到这篇文章，也欢迎指导。

大家一起讨论，把实验做得更好。

无论是做混合淋巴细胞反应或者流式细胞分析都要用到脾脏。

小鼠的脾脏摘取颇为简单，但有很多同学是第一次接触，所以在此做一个简单的图文讲解。

在此讲解不甚详细，具体步骤请同学参照网上已有各种protocol,本文重点在于图文解说，让大家对照图片和其他protocol更好的理解脾脏的摘取。

一，小鼠处死后泡酒精2-3分钟，泡久了细胞会缩水，泡的时间短了起不到消毒杀菌的作用二，摆好小鼠体位，取右侧卧位。

三，沿着小鼠左侧肋骨走行方向做切口。

准备眼科镊和眼科剪若干（文中笔者使用眼科直镊3把，眼科剪2把）四，向小鼠左后背方探查，在皮下很浅的地方可见深红色脾脏。

脾脏走行向与肋骨方向近似平行五，用镊子轻轻提起脾脏。

脾脏下会连着许多结缔组织，轻轻把它们撕掉。

六，完整摘下脾脏，放于培养皿中【事先在培养皿中放入PBS（混淋）或红裂（流式）和200目的铁丝网】如下右图所示，银色的为本步骤中使用的铁丝网，白色的为后面要用到的过滤膜七，一把新的眼科剪和一把新的眼科镊（新消毒过的。

本文所用的为新高压的），把脾脏在培养皿里剪成小块。

然后用2.5ml或5ml注射器柄，把脾脏研磨成细胞。

研磨过程要轻柔，否则会损伤脾脏中的细胞。

八，研磨至培养皿中不见整块脾脏，只剩一些不能磨碎的结缔组织为止。

九，再加入4ml红细胞裂解液，冲洗铁丝网，注射器内芯，并用枪头吹打混匀，裂解5min 十，将液体一并转入15ml离心管中，400g,5min,离心十一，弃去上清，加入5ml含10%FBS的1640 ,重悬, 用装有200目的尼龙滤膜过滤(可过滤两次); 尼龙滤膜就是第六步中右图的白色滤膜。

十二，滤液离心400g,5min,弃上清，加入1ml含10%FBS的1640,重悬混匀，稀释50(20+980)倍计数，；至此，脾脏细胞就算提取完成了。

小鼠脾脏细胞免疫细胞流式画门策略小鼠脾脏细胞免疫细胞流式细胞术是一种用来鉴定和定量特定类型的免疫细胞的技术。

该技术基于荧光标记抗体的使用，可以同时检测多种表面免疫分子的表达，并用流式细胞仪进行高通量检测和分析。

本文将介绍小鼠脾脏细胞免疫细胞流式细胞术的基本原理、实验步骤和注意事项。

1.原理：小鼠脾脏细胞免疫细胞流式细胞术基于激光光束对细胞进行扫描和检测的原理。

通过单光子激光器激发细胞中的荧光染料，检测和分析荧光信号的特性，从而确定细胞的类型。

荧光标记的抗体可以与细胞表面特定的免疫分子结合，并通过流式细胞仪的检测器测量这些标记染料的荧光信号，从而确定不同细胞类型的比例和表达水平。

2.实验步骤：（1）小鼠准备：选择合适的小鼠品系，按照实验室动物使用和伦理规定进行操作。

在实验开始前，对小鼠进行标记、编号和分组，确保实验的准确性。

（2）小鼠处理：根据实验设计，给小鼠注射适当的抗原或药物，使其产生免疫反应。

通常采用皮下、腹腔或静脉注射的方式进行。

（3）脾脏细胞制备：将小鼠处死，进行脾脏摘除并置于组织培养液中，用细胞培养器对脾脏进行细胞溶解，得到脾细胞悬浮液。

（4）细胞染色：将获得的脾细胞悬浮液分装于管式离心管中，进行细胞染色。

通常采用多重抗体染色的方式，通过选择特异性抗体和适当的荧光染料，对不同免疫细胞进行鉴定。

（5）流式细胞仪分析：将染色后的细胞悬浮液注入流式细胞仪中，通过激光和光学系统对细胞进行激发和检测。

通过设置参数和门控策略，可以识别和定量不同类型的免疫细胞，并获得相关数据。

3.注意事项：（1）实验条件：流式细胞仪的操作需要在严密的无菌条件下进行，以防止样品的污染。

此外，注意控制温度、湿度和激光功率等实验条件的稳定性。

（2）抗体选择：在选择抗体时，应根据实验的目的和免疫细胞的特异性结合选择合适的抗体。

同时，要确保抗体的亲和性和免疫反应的稳定性。

（3）染色控制：为了保证实验的准确性，应设置染色控制组，并对染色反应进行必要的对比和校正。