脾脏流式细胞术

T细胞表面标志及其亚群
CD3+CD4+CD8-辅助性T细胞（help T cell,Th）
CD3+CD4-CD8+细胞毒性T细胞 细胞毒性 （cytotoxic T cell,Tc or CTL）
CD4+CD25+调节性T细胞（regulatory T cell,Tr or Treg）
B细胞表面标志
胸腺功能： （1）产生T淋巴细胞 （2）产生和分泌胸腺素和激素类物质
免疫细胞分离方法
1. 根据不同免疫细胞表面标志:FACS、 MACS
2. 根据细胞理化性质 ： 1）根据细胞比重差异：自然沉降法、密度梯 度离心法、改变细胞密度法 2）根据细胞黏附特性：B细胞黏附于尼龙棉 3）根据细胞对渗透压变化的敏感度：红细胞 对低渗敏感
部分 SmIg、Fc受体、补体受体、EB病毒受体，部分 CD分子是B细胞的重要表面标志，其中以SmIg 分子 为B细胞所特有，是鉴定B细胞可靠的指标。
CD19/CD5分子：可将B细胞区分为B1细胞和B2细胞 ， B1 细 胞 为 CD19 和 CD5 双 阳 性 ， 而 B2 细 胞 仅 为 CD19阳性，B2细胞为通常所指的B细胞。
脾
脾（spleen ）位于腹腔的左上方，是机体内最大的淋 巴器官，呈扁椭圆形，暗红色、质软而脆。
脾脏功能
脾在正常情况下，只产生淋巴细胞及单核细胞，但在病 态及大失血后可产生各种血细胞。脾主要功能是参与免 疫反应，脾内的巨噬细胞能吞噬和清除衰老的红细胞， 细菌和异物，产生淋巴细胞，及单核细胞，贮存血液。 胚胎时期可造血。脾脏在胚胎时期是一个重要的造血器 官，出生后能产生淋巴细胞和单核细胞。
MACS
磁性微珠是20世纪80年代初以高分子材料和金属离子（如Fe3O4 ）为原料聚合而成的一种以金属离子为核心、外层均匀地包裹高 分子聚合体的固相微粒。

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710321625.1(22)申请日 2017.05.09(71)申请人 成都扬克斯生物科技有限公司地址 610094 四川省成都市高新区益州大道中段722号4栋14楼1404号(72)发明人 彭西　于正强　胡东　李林蔚　(74)专利代理机构 北京科亿知识产权代理事务所(普通合伙) 11350代理人 汤东凤(51)Int.Cl.G01N 15/14(2006.01)(54)发明名称小鼠胸腺或脾脏T淋巴细胞亚群的流式细胞术检测方法(57)摘要本发明公开了一种小鼠胸腺或脾脏T淋巴细胞亚群的流式细胞术检测方法，包括以下步骤：获取试验小鼠的胸腺或脾脏组织，制备单细胞悬液；分别吸取所述胸腺或脾脏单细胞悬液，分别加入抗小鼠的CD3、CD4、CD8单克隆抗体各一头份，旋涡混匀，于4℃避光染色；染色后，用PBS液洗涤并重悬细胞，使用流式细胞仪进行检测；分析检测结果，获得小鼠胸腺或脾脏各亚群T淋巴细胞的百分比。

本发明成功建立了稳定规范的流式细胞术检测小鼠胸腺或脾脏T淋巴细胞亚群的方法，通过对样品前处理、检测和分析过程中的目标细胞选取、补偿调节及参数选择的问题进行改进，避免了试验过程中人为因素造成的误差，提高了结果判断的真实性和客观性。

权利要求书1页 说明书6页 附图3页CN 107132177 A 2017.09.05C N 107132177A1.一种小鼠胸腺或脾脏T淋巴细胞亚群的流式细胞术检测方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，获取试验小鼠的胸腺或脾脏组织，制备单细胞悬液；步骤2，吸取所述胸腺或脾脏单细胞悬液，分别加入两支流式上机管中一支管中加入抗小鼠的CD3、CD4、CD8单克隆抗体，旋涡混匀，于4℃避光染色，用作检测管；另一支用作阴性设置管；步骤3，染色后，用PBS液洗涤并重悬细胞，使用流式细胞仪进行检测；步骤4，分析检测结果，获得小鼠胸腺或脾脏各亚群T淋巴细胞的百分比。

1 2 3
9
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可重复滤过
超净台下操作全过程 4
5
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7
实验步骤
（二）制备单个核细胞悬液：
塑料漏皿
1. 将脾脏置于盛有5mLPBS缓冲液的平皿中，然后再置于尼龙指套 中。用针芯轻轻碾磨使单个核细胞通过尼龙指套悬浮于平皿中；
2. 吸取平皿中细胞悬液（再次用尼龙指套过滤）置于刻度离心管中， 加PBS缓冲液（可冲洗培养皿）至10mL，以1500rpm离心5min。 弃去上清，弹散细胞沉淀，加ACK2ml，轻轻吹打混匀并放置34min，以破坏红细胞。然后加PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离 心5min；
实验步骤
（一）取小鼠脾脏（3人1组） • 小鼠颈椎脱位处死
用拇指和食指往下按住鼠头，另一只手抓住鼠尾，用力稍 向后上方一拉，使之颈椎脱臼，造成脊髓与脑髓断离
• 取其后右侧卧位，消毒左侧背腹交界 处皮肤，剪取脾脏并尽量将去除脂肪 及筋膜组织。
取脾脏
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可重复滤过
10
（四）计算细胞活力
1. 50μl细胞悬液+ 50μl的0.2% 苔盼兰溶液并混匀；
2. 取一滴显微镜下观察：
如果细胞被染成蓝色，旋转显 微镜微调节钮，细胞无反光， 则为死细胞；而细胞不被染色， 晶莹透亮，旋转显微镜调节钮， 细胞明显反光而且有立体感， 为活细胞；
3. 计算细胞活力：计数100个 细胞中活细胞的百分率，一般 活力应在95%以上。
实验步骤
（三）计算细胞浓度
1.将上述细胞悬液做一定倍数的稀释；（建议5倍稀释） 2.混匀稀释后，取1滴加至细胞计数板中，计数细胞计数板中4大方格细胞总数； 3.计算细胞总数：

NK细胞表面标志
人类细胞表面标志主要以 CD16、CD56来 认定，临床上将CD3-CD56+CD16+淋巴 细胞认定为NK细胞。
流式细胞术(FCM)
流式细胞术(FCM)是一种对处在液流中的单个细胞或其它生物微 粒（如细菌）等进行快速定量分析和分选的技术，它将免疫荧光 与细胞生物学、流体力学、光学和电子计算机等多种学科的高新 技术结合，进行细胞和分子水平的基础理论与临床应用研究。
MACS
磁性微珠是20世纪80年代初以高分子材料和金属离子（如Fe3O4 ）为原料聚合而成的一种以金属离子为核心、外层均匀地包裹高 分子聚合体的固相微粒。
以磁性微珠为载体，包被上针对某种细胞表面抗原的特异性抗体 即可制成免疫磁性微珠。
通常有二种分离方式：阳性分离和阴性分离。 基本原理及步骤：首先将抗特异细胞表面抗原的抗体致敏到磁珠
胸腺功能： （1）产生T淋巴细胞 （2）产生和分泌胸腺素和激素类物质
免疫细胞分离方法
1. 根据不同免疫细胞表面标志:FAC： 1）根据细胞比重差异：自然沉降法、密度梯 度离心法、改变细胞密度法 2）根据细胞黏附特性：B细胞黏附于尼龙棉 3）根据细胞对渗透压变化的敏感度：红细胞 对低渗敏感
（二）制备单个核细胞悬液：
1. 将取出的脾脏置于盛有PBS缓冲液(10ml)的平皿中，然后再 置于尼龙指套中。用针芯轻轻碾磨使单个核细胞通过尼龙指 套悬浮于平皿中；
2. 吸取平皿中细胞悬液置于15ml离心管中，再取5mlPBS冲 洗培养皿后移入15ml离心管。以1500rpm离心5min。弃 去上清，轻轻弹散细胞沉淀,加红细胞裂解液ACK至2-3ml ，轻轻吹打混匀并放置3-4min，以破坏红细胞。然后加 PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离心5min；

• 2．空气栓塞法：主要用于大动物的处死，用注射器将空气急速注入静脉，可 使动物致死。当空气注入静脉后，可在右心随着心脏的跳动使空气与血液相 混致血液呈泡沫状，随血液循环到全身。如进入肺动脉，可阻塞其分支，进 入心脏冠状动脉，造成冠状动脉阻塞，发生严重的血液循环障碍，动物很快 致死。
• 3．急性大失血法：用粗针头一次采取大量心脏血液，可使动物致死。 • 4．吸入麻醉致死法：应用乙醚吸入麻醉的方法处死。大、小鼠在20～30秒
3.清洗：加500ulPBS,吹打混匀后， 5000rpm， 4℃，5min
4.检测：小心用枪去除上清，再加入500ul PBS吹打混匀，置于冰上， 流式细胞仪检测
CD3： T cell CD4+ T cell； CD8+ T cell
补充知识
通常分离细胞是为了下一步实验。有些实验如需要对细 胞作进一步培养，则在分离细胞时一定要严格无菌操作。
在用ACK破坏红细胞时，不要时间过长，以免破坏其他 细胞。
计数完毕后请立即清洗细胞计数板！
思考题
1.实验过程中注意问题有哪些？
实验小鼠处死方法
• 1．颈椎脱臼法：是大、小鼠最常用的处死方法。用拇指和食指用力往下按住 鼠头，另一只手抓住鼠尾，用力稍向后上方一拉，使之颈椎脱日，造成脊髓 与脑髓断离，动物立即死亡。
实验四
小鼠脾脏单个核细胞分离及 流式细胞术染色
钱国军 邹本坤 2016-03-31
解剖图
小鼠脾脏位于上腹部左后侧， 体积较大，长条形，属于外 周免疫器官。外周血中淋巴 细胞可经再循环驻入脾脏等 外周免疫器官的特定区域， 所以富含各类免疫细胞。
实验原理
细胞计数
3mm
W1
W2
W3

lived dead
实验材料：
小鼠 手术器械（剪刀、镊子）、酒精喷壶 平皿，尼龙膜指套、研磨棒
PBS缓冲液、红细胞裂解液（ACK）
细胞计数板 0.2%台盼蓝染液 显微镜（关掉之前，请把光度调到最小！！）
实验步骤
（一）取小鼠脾脏：
小鼠颈椎脱位处死（注意安全）； 用75%酒精喷小鼠腹部，使其皮毛沾湿。用剪刀，剪开皮肤 暴露腹腔，再找到脾脏，劲量剪除脾脏周围组织；
• • • •
实验小鼠处死方法
• 1．颈椎脱臼法：是大、小鼠最常用的处死方法。用拇指和食指用力往下按住 鼠头，另一只手抓住鼠尾，用力稍向后上方一拉，使之颈椎脱日，造成脊髓 与脑髓断离，动物立即死亡。
注意： 细胞总数和细胞活力可以一起做 细胞总数=视野内活细胞数+死细胞数 细胞活力=活细胞数/总数x100%
1.颈椎脱臼处死小鼠：用拇指和食指用力往下按住鼠头，另一只手抓住 鼠尾，用力稍向后上方一拉，使之颈椎脱臼，造成脊髓与脑髓断离 2.摘取脾脏：用75%酒精喷小鼠腹部，使其皮毛沾湿。用剪刀，剪开皮 肤暴露腹腔，再找到脾脏，尽量剪除脾脏周围组织 3.研磨脾脏：在培养皿中加入3mlPBS，将脾脏放入过滤网制成的指套中， 再放入培养皿中，用注射器的活塞棒或研棒将脾脏研碎。将含有脾脏细 胞的PBS移入15ml离心管。再取3mlPBS冲洗培养皿后移入15ml离心管。
（三）计算细胞浓度
将上述细胞悬液做一定倍数（10倍左右）的稀释（小鼠脾 脏细胞一般为1x107-2x108）； 混匀稀释后，取10uL加至细胞计数板中(不要有气泡），计 数细胞计数板中4大方格细胞总数； 计算细胞总数：
细胞浓度=4个大方格细胞总数/4*104*稀释倍数。
细胞总数=细胞浓度x细胞悬液的体积

《医疗器械免疫原性评价方法第6部分：用流式细胞术测定动物脾脏淋巴细胞亚群》标准编制说明一、工作简况1.任务来源根据2018年医疗器械标准制修订工作安排，由全国医疗器械生物学评价标准化技术委员会归口，山东省医疗器械产品质量检验中心、北京市医疗器械检验所负责制订YY1465.6《医疗器械免疫原性评价方法第6部分：用流式细胞术测定动物脾脏淋巴细胞亚群》。

2.标准体系YY/T1465的总标题是医疗器械免疫原性评价方法，包括以下部分：—第1部分：体外T淋巴细胞转化试验；—第2部分：血清免疫球蛋白和补体成分测定ELISA法；—第3部分：空斑形成细胞测定琼脂固相法；—第4部分：小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验半体内法；—第5部分：用M86单克隆抗体测定动物源性医疗器械中α-Gal抗原清除率；—第6部分：用流式细胞术测定动物脾脏淋巴细胞亚群。

有关其他方面的免疫原性试验将有其他部分的标准。

3.工作过程在接到标准制定任务后，标准起草工作组认真研究，于2018年3月召开首次视频工作组会议，召集共同验证单位确定工作组讨论稿和标准验证方案。

在分析验证结果和对标准内容进行充分讨论后,工作组于7月底完成并发出征求意见稿。

二、标准编制原则和确定标准主要内容的论据。

标准修订工作组按照GB/T1.1—2009的规则制定本部分。

1、医疗器械中免疫原的来源免疫原即医疗器械中所含有的，可以刺激机体发生免疫应答的异源性物质。

蛋白质作为免疫原性物质的可能性最大，其次是多糖，核酸和脂质等。

小分子量的物质通常没有免疫原性，然而，它们可以通过与宿主蛋白结合并改变蛋白的构象来获得免疫原性。

对于医疗器械而言，聚合材料、陶瓷制品及金属材料可能具有的溶出物、磨损或可降解部分能够与宿主蛋白结合。

生物源性的材料，如胶原，天然乳胶蛋白，白蛋白和动物组织等都可以刺激机体发生免疫应答。

2、国际上对医疗器械免疫毒性评价的要求医疗器械中所含的免疫原性物质是导致其免疫毒性的原因。

小鼠脾细胞流式实验步骤概述说明以及解释引言部分的内容应包括概述、文章结构和目的。

1. 引言1.1 概述：本文旨在介绍小鼠脾组织中的细胞流式实验步骤。

流式细胞术是一种广泛应用于生物医学研究领域的技术，它能够对单个细胞进行高通量分析，并且在分析多个参数时提供了准确性和高度灵活性。

通过对小鼠脾细胞进行流式实验，我们可以深入了解该组织内不同类型细胞的数量、表型和功能，从而为进一步的研究提供重要依据。

1.2 文章结构：本文分为四个主要部分：引言、小鼠脾细胞流式实验步骤概述、正文和结论。

在引言部分，我们将简要概述本文要讨论的主题，并介绍文章结构；然后，在小鼠脾细胞流式实验步骤概述部分，我们将详细介绍研究对象的相关信息，并解释流式细胞术的基本概念；接下来，在正文部分，我们将重点讨论关于细胞处理和标记方法、流式细胞仪操作步骤以及数据分析与统计方法的内容；最后，在结论部分，我们将总结实验结果和发现，并对其意义、局限性以及下一步研究提出展望和建议。

1.3 目的：本文的目的是向读者全面介绍小鼠脾细胞流式实验步骤。

通过详细阐述实验设计、样本制备、细胞处理和标记方法、流式细胞仪操作步骤以及数据分析与统计方法，我们希望读者能够理解并掌握小鼠脾细胞流式实验的基本原理和操作技巧。

同时，通过讨论实验结果与发现的总结、结果意义与局限性的讨论以及对下一步研究的展望和建议，我们希望启发读者思考关于小鼠脾组织中特定类型细胞功能和相互作用机制方面的问题，为相关领域的深入研究提供思路和指导。

2. 小鼠脾细胞流式实验步骤概述：2.1 研究对象介绍：小鼠脾细胞是指从小鼠脾脏中分离出的细胞群体。

小鼠脾脏是淋巴系统的重要器官之一，其中包含各种免疫细胞，如B细胞、T细胞、巨噬细胞等。

小鼠脾细胞流式实验通过对这些免疫细胞进行标记和分析，可以帮助我们了解免疫反应的机制以及疾病发生过程中免疫系统的变化。

2.2 流式细胞术概念解释：流式细胞术（flow cytometry）是一种用于分析和计数单个活动或已死亡的细胞的技术。

流式细胞分析和混合淋巴细胞反应实验中小鼠脾脏的摘取最近老婆要提取脾脏细胞做流式，我就做个简单的解说，也顺便传到网上供菜鸟理解，如果有大神看到这篇文章，也欢迎指导。

大家一起讨论，把实验做得更好。

无论是做混合淋巴细胞反应或者流式细胞分析都要用到脾脏。

小鼠的脾脏摘取颇为简单，但有很多同学是第一次接触，所以在此做一个简单的图文讲解。

在此讲解不甚详细，具体步骤请同学参照网上已有各种protocol,本文重点在于图文解说，让大家对照图片和其他protocol更好的理解脾脏的摘取。

一，小鼠处死后泡酒精2-3分钟，泡久了细胞会缩水，泡的时间短了起不到消毒杀菌的作用二，摆好小鼠体位，取右侧卧位。

三，沿着小鼠左侧肋骨走行方向做切口。

准备眼科镊和眼科剪若干（文中笔者使用眼科直镊3把，眼科剪2把）四，向小鼠左后背方探查，在皮下很浅的地方可见深红色脾脏。

脾脏走行向与肋骨方向近似平行五，用镊子轻轻提起脾脏。

脾脏下会连着许多结缔组织，轻轻把它们撕掉。

六，完整摘下脾脏，放于培养皿中【事先在培养皿中放入PBS（混淋）或红裂（流式）和200目的铁丝网】如下右图所示，银色的为本步骤中使用的铁丝网，白色的为后面要用到的过滤膜七，一把新的眼科剪和一把新的眼科镊（新消毒过的。

本文所用的为新高压的），把脾脏在培养皿里剪成小块。

然后用2.5ml或5ml注射器柄，把脾脏研磨成细胞。

研磨过程要轻柔，否则会损伤脾脏中的细胞。

八，研磨至培养皿中不见整块脾脏，只剩一些不能磨碎的结缔组织为止。

九，再加入4ml红细胞裂解液，冲洗铁丝网，注射器内芯，并用枪头吹打混匀，裂解5min 十，将液体一并转入15ml离心管中，400g,5min,离心十一，弃去上清，加入5ml含10%FBS的1640 ,重悬, 用装有200目的尼龙滤膜过滤(可过滤两次); 尼龙滤膜就是第六步中右图的白色滤膜。

十二，滤液离心400g,5min,弃上清，加入1ml含10%FBS的1640,重悬混匀，稀释50(20+980)倍计数，；至此，脾脏细胞就算提取完成了。

小鼠脾脏细胞免疫细胞流式画门策略小鼠脾脏细胞免疫细胞流式细胞术是一种用来鉴定和定量特定类型的免疫细胞的技术。

该技术基于荧光标记抗体的使用，可以同时检测多种表面免疫分子的表达，并用流式细胞仪进行高通量检测和分析。

本文将介绍小鼠脾脏细胞免疫细胞流式细胞术的基本原理、实验步骤和注意事项。

1.原理：小鼠脾脏细胞免疫细胞流式细胞术基于激光光束对细胞进行扫描和检测的原理。

通过单光子激光器激发细胞中的荧光染料，检测和分析荧光信号的特性，从而确定细胞的类型。

荧光标记的抗体可以与细胞表面特定的免疫分子结合，并通过流式细胞仪的检测器测量这些标记染料的荧光信号，从而确定不同细胞类型的比例和表达水平。

2.实验步骤：（1）小鼠准备：选择合适的小鼠品系，按照实验室动物使用和伦理规定进行操作。

在实验开始前，对小鼠进行标记、编号和分组，确保实验的准确性。

（2）小鼠处理：根据实验设计，给小鼠注射适当的抗原或药物，使其产生免疫反应。

通常采用皮下、腹腔或静脉注射的方式进行。

（3）脾脏细胞制备：将小鼠处死，进行脾脏摘除并置于组织培养液中，用细胞培养器对脾脏进行细胞溶解，得到脾细胞悬浮液。

（4）细胞染色：将获得的脾细胞悬浮液分装于管式离心管中，进行细胞染色。

通常采用多重抗体染色的方式，通过选择特异性抗体和适当的荧光染料，对不同免疫细胞进行鉴定。

（5）流式细胞仪分析：将染色后的细胞悬浮液注入流式细胞仪中，通过激光和光学系统对细胞进行激发和检测。

通过设置参数和门控策略，可以识别和定量不同类型的免疫细胞，并获得相关数据。

3.注意事项：（1）实验条件：流式细胞仪的操作需要在严密的无菌条件下进行，以防止样品的污染。

此外，注意控制温度、湿度和激光功率等实验条件的稳定性。

（2）抗体选择：在选择抗体时，应根据实验的目的和免疫细胞的特异性结合选择合适的抗体。

同时，要确保抗体的亲和性和免疫反应的稳定性。

（3）染色控制：为了保证实验的准确性，应设置染色控制组，并对染色反应进行必要的对比和校正。

流式细胞术详解加入时间：2004-12-27 来源：编辑：科泰生物一. 流式细胞术概述流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)是七十年代发展起来的高科学技术,•它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体, 同时具有分析和分选细胞功能。

它不仅可测量细胞大小、内部颗粒的性状,还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等,可对群体细胞在单细胞水平上进行分析, 在短时间内检测分析大量细胞,并收集、储存和处理数据,进行多参数定量分析; 能够分类收集(分选)某一亚群细胞,分选纯度＞95%。

在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。

国内使用的流式细胞仪主要由美国的两个厂家生产:BECKMAN- COULTER公司和Becton-Dickinson公司(简称B-D公司)。

流式细胞仪主要有两型:临床型（又称小型机、台式机）和综合型（又称大型机、分析型）。

BECKMAN-COULTER公司最新产品为EPICS ALTRA和EPICS XL/XL-MCL, B-D•公司最新产品为FACS Vantage和FACS Calibur。

EPICS XL/XL-MCL和FACS Calibur是临床型;EPICS ALTRA和 FACS Vantage是综合型，除具备检测分析功能外,还具有细胞分选功能,•多用于科学研究。

二.流式细胞仪主要技术指标1．流式细胞仪的分析速度：一般流式细胞仪每秒检测1000～ 5000个细胞,大型机可达每秒上万个细胞。

2．流式细胞仪的荧光检测灵敏度：一般能测出单个细胞上<600个荧光分子,两个细胞间的荧光差＞5%即可区分。

3．前向角散射（FSC）光检测灵敏度：前向角散射（FSC）反映被测细胞的大小,一般流式细胞仪能够测量到0.2μm～０.5μm。

4．流式细胞仪的分辨率：通常用变异系数CV值来表示，,一般流式细胞仪能够达到<2.0%,这也是测量标本前用荧光微球调整仪器时要求必须达到的。

流式细胞术检测脾脏CD4+、CD8+
一、准备实验：
1640、PBS缓冲液、铜网、小平皿、剪刀、镊子、离心管、红细胞裂解液、枪头、抗体、细胞计数板、杀鸡用大剪刀、1ml注射器
二、实验操作步骤：
1、取一小块雏鸡脾脏，放入装有1ml 1640的1.5ml离心管中
2、铜网+平皿中加入1ml 1640
3、将脾放入铜网中，磨脾
4、吸取磨好的脾汁放入1.5ml离心管中，离心2000r,5min
5、弃去上清，向脾汁沉淀中加入500µl红细胞裂解液，混匀作
用3min,离心2000r 5min
6、若离心后得到沉淀不变白可重复上述操作
7、裂解完成，离心完成，弃去上清，向试管中加入1ml PBS混匀
8、向1.5ml离心管中加入490µLPBS，再加入10µL步骤7脾汁，
计数
9、取106个细胞加PBS定容至100µL，此处用1.5ml离心管
10、向细胞悬液内加入抗体，每只鸡两管细胞悬液，每管10µL
11、4℃避光保存45min
12、向细胞悬液中加入1mlPBS 2000r 5min
13、弃上清，向管中加入200µL PBS 上机。

光谱重叠（Spectral overlap）
补偿模型图
FL2
补偿调节前后对比
FL1
数据收集和分析
1 画图（直方图，散点图） 2 寻找目标细胞 3 调整仪器设置到合适的状态 4 我们可以得到怎样的结果？
它们意味着什么？
数据分析
• 设门 • 设定阴性与阳性群体的界限 • 确定阳性与阴性细胞群体 • 统计阳性或阴性细胞群体的百分率，
流式细胞仪的临床应用
HIV免疫分型，CD4绝对计数 白血病和淋巴瘤的免疫分型 肿瘤的细胞周期和倍体分析 网织红细胞计数 细胞移植的交叉配型和免疫状态监测 干细胞计数 残量白血病细胞检查 HLA-B27检查 血小板功能及相关疾病
Part IV
流式细胞术实验操作 流程及数据分析
流式细胞术操作流程
流式细胞术
✓ 调整仪器设置 ✓ 收集数据 ✓ 分析结果
课堂目标
• 了解流式细胞仪的构造、原理及应用，掌 握“门”，“补偿”两个基本概念。
• 学会简单分析流式数据：小鼠脾脏分离的 单个核细胞中CD3+、CD4+ 、CD8+细胞 的比例。
Content
✓流式细胞仪的简介 ✓流式细胞仪的组成及原理 ✓流式细胞术的应用 ✓流式细胞术实验操作流程
不同于其他细胞分析仪器的主要特点，可以每秒钟上万个细胞的速率进行测量。
可检测的样本种类多样各种细胞（如外周血，骨髓，实体组织，悬浮或
贴壁培养的细胞），微生物，人工合成微球。
样本类型
可检测颗粒大小
0.2μm
50μm
流式细胞仪能检测哪些信息?
➢ 相对大小: Forward Scatter (FSC)
• 2.染色：小心用枪去除上清，再加入50ul预混抗体的PBS（由助 教准备），将细胞吹打混匀，避光， 4℃或冰上，染色1520min

实验目的：通过流式细胞仪对小鼠脾脏T细胞进行分选，以探究T细胞在免疫应答中的作用及机制。

一、实验前准备1.1 实验材料准备1.1.1 小鼠脾脏组织1.1.2 10mL注射用生理盐水1.1.3 0.25胰酶液1.1.4 洗涤缓冲液（PBS）1.1.5 红细胞裂解液1.1.6 表面标记抗体：CD3-FITC、CD4-PE、CD8-APC1.1.7 流式细胞仪1.1.8 离心管、移液枪、吸头、培养皿等实验器材1.2 实验环境准备1.2.1 无菌操作台1.2.2 常温恒温器1.2.3 培养箱1.2.4 流式细胞仪操作间二、实验步骤2.1 小鼠脾脏细胞分离2.1.1 将小鼠处死并取出脾脏组织，放入含有10mL生理盐水的培养皿中，剪碎均匀。

2.1.2 加入0.25胰酶液，放入37摄氏度恒温器中消化30分钟。

2.1.3 将组织碎片过滤，用PBS洗涤，避免红细胞污染。

2.1.4 使用红细胞裂解液裂解红细胞，离心沉淀，得到细胞悬液。

2.2 细胞表面标记2.2.1 取得细胞悬液，计数并调整浓度至合适水平。

2.2.2 分别加入CD3-FITC、CD4-PE、CD8-APC表面标记抗体，进行表面标记反应，避免光照。

2.2.3 进行表面标记抗体的洗涤和离心，得到标记的细胞悬液。

2.3 流式细胞仪分选2.3.1 将标记的细胞悬液输入流式细胞仪，设置合适的参数。

2.3.2 进行T细胞的流式细胞仪分选，并收集目标T细胞子集。

2.3.3 对收集的目标T细胞子集进行进一步的分析或培养。

三、实验注意事项3.1 实验过程中要保持无菌操作，避免细胞污染。

3.2 实验中避免表面标记抗体受光照。

3.3 实验材料和仪器的准备和操作要符合实验要求，确保实验结果的准确性和可靠性。

通过上述步骤，可以对小鼠脾脏T细胞进行流式分选实验，进一步探究T细胞在免疫调节中的作用及机制，为相关研究提供重要的实验数据支持。

在实验过程中，对于小鼠脾脏T细胞的流式分选需要严格控制各个步骤，确保实验结果的可靠性和准确性。

分离脾脏组织细胞及胞内流式的protocol1.准备六孔板，1xPBS溶液，50ml离心管，15ml离心管, 1.5ml管子，70um滤器,把淋巴细胞分离液拿到室温放着2.杀小鼠，分离脾脏和肺组织，肺用OCT包埋，至于-80度保存，脾脏放入六孔板3.用10ml注射器的头将其研碎，匀浆4.将其转移到装有70um滤器的50ml离心管中5.在15ml离心管底部铺上一份淋巴细胞分离液，与细胞悬液之比为1:26.500g, 15度，升降速为0，分离15分钟7.吸取乳白色细胞层，至于1.5ml离心管中8.加入PBS重悬，500g离心15分钟，重复两次9.配置10%培养基，将细胞悬浮其中待用10.500g, 离心10分钟，弃上清11.加入2ml 1xPBS重悬，离心，重复洗2次，并转移至2ml离心管中12.在离心过程中，配置穿孔液，还有固定液，表面抗体的稀释液13.从重悬细胞中吸取部分细胞作为Blank，吸取部分做表面抗体单染：比如CD4、IFN-γ、IL-414.表面染色标记各流式样品和CD4单染样品，4度避光孵育20-30分钟15.加入1ml 1xPBS中和抗体，离心，CD4单染样品加入流式染色液避光放置16.流式样品和IFN-γ、IL-4单染在避光条件下，各加入100ul IC Fixationbuffer，轻轻弹一弹，室温避光孵育20分钟17.每管加入2ml 1xpermeabilization buffer,300g 室温离心5min，弃上清18.2ml 1xpermeabilization buffer 重悬，300g 室温离心5min, 弃上清19.用1xpermeabilization buffer配IFN-γ、IL-4抗体，分别加入到每管中，单染只加一种抗体即可，室温避光孵育20-30分钟20.每管加入2ml 1xpermeabilization buffer,300g 室温离心5min，弃上清21.每管加入2ml 1xPBS,300g 室温离心5min，弃上清22.加适量1xPBS（300-500ul）重悬，避光放置等待上机检测23.软件分析结果。

流式细胞术检测脾脏CD4+、CD8+
一、准备实验：
1640、PBS缓冲液、铜网、小平皿、剪刀、镊子、离心管、红细胞裂解液、枪头、抗体、细胞计数板、杀鸡用大剪刀、1ml注射器
二、实验操作步骤：
1、取一小块雏鸡脾脏，放入装有1ml 1640的1.5ml离心管中
2、铜网+平皿中加入1ml 1640
3、将脾放入铜网中，磨脾
4、吸取磨好的脾汁放入1.5ml离心管中，离心2000r,5min
5、弃去上清，向脾汁沉淀中加入500µl红细胞裂解液，混匀作
用3min,离心2000r 5min
6、若离心后得到沉淀不变白可重复上述操作
7、裂解完成，离心完成，弃去上清，向试管中加入1ml PBS混匀
8、向1.5ml离心管中加入490µLPBS，再加入10µL步骤7脾汁，
计数
9、取106个细胞加PBS定容至100µL，此处用1.5ml离心管
10、向细胞悬液内加入抗体，每只鸡两管细胞悬液，每管10µL
11、4℃避光保存45min
12、向细胞悬液中加入1mlPBS 2000r 5min
13、弃上清，向管中加入200µL PBS 上机。

6 在冰上孵育 00:15:00 。
7 加入 100 μl PBSA/ az，然后以 1300 rpm 离心 00:05:00 。 8 吸出或轻弹介质。 9 用 10 μl 抗体混合物重悬/染色： CD11b PerCP-Cy5.5、CD11c PE-Cy7、CD19 APCCy7 和 CD3 APC（PBSA/az 中 1：100Ab）至刺激的脾细胞样品。
刺激脾细胞 1 准备一份含有布雷菲德菌素 A 的 RPMI 培养基，使之浓度达到 10 μg/ml。 2 涡旋并旋转所有 LPS 储备液，然后每个超声处理 00:10:00 。超声处理后，再次涡旋 并旋转。 3 使用含有布雷菲德菌素 A 的培养基将每种刺激物（EC LPS，PA，YP，脂质 IVa）制备 成其所需最终浓度的两倍（2x）。 4 将 100 μl 的每种刺激物加入到 96 孔板 2.2mL 的适当孔中，包括未刺激的孔作为对 照。 5 将 100 μl 脾细胞铺板到适当的孔中（平板另外一组脾细胞用作单一染色对照）。
使用流式细胞仪 1 在 BD FACS Canto I 软件上，选择设置“新实验”按钮。 2 选择 FSC 和 SSC 的面积、高度、宽度; 选择日志和区域颜色作为“FITC”、“PE”、 “PerCP/Cy5.5”、“PE/Cy7”、“APC/Cy7“和“APC“（在 Inspector 框下）。 3 创建补偿控制并调整未染色脾细胞的门控（根据需要调整 FSC 和 SSC 电压）。
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7 在 4 ℃ 下以 1300 rpm 离心 00:05:00 。
8 弃去上清液，将沉淀重悬于 3 ml 培养基中。
9 通过 50 ml 离心管过滤 70 μM 过滤器 10 按 1：100 稀释细胞，然后计数。 11 在 RPMI 培养基中，将单细胞悬浮液稀释至 1×107 个细胞/ml（对于流动测定，不需要 计数和计算细胞）。 12 将脾细胞置于冰上直至进入 96 孔板。