人乳腺癌全套抗体可变区基因的扩增与克隆
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人教版高中生物选修二练习：3.3生物技术药物与疫苗课时作业 含解析
[课时作业]·达标一、选择题1.下列不属于生物技术药物的是()A.基因工程药物B.细胞工程药物C.中草药D.酶工程药物解析A、B、D三项都是利用生物技术获得的药物。
中草药来自植物体本身。
答案C2.基因工程药物生产中最关键的环节是()A.构建工程菌B.构建基因表达载体C.获取目的基因D.工程菌的大规模培养答案A3.利用基因工程生产药物利用的原理是()A.基因突变B.染色体变异C.细胞的全能性D.基因重组答案D4.抗癌药物紫杉醇的生产利用的技术是()A.基因工程技术B.细胞工程技术C.酶工程技术D.发酵工程技术答案B5.下列关于疫苗的叙述，正确的是()A.所有的疫苗都是安全的B.一次使用疫苗可以预防一生C.疫苗能迅速激发机体免疫反应D.疫苗既可预防疾病，也可治疗疾病解析疫苗是一种特殊的药物，它不是用于治疗疾病，而是用于预防疾病的。
疫苗能够同时启动机体的体液免疫和细胞免疫，产生抵抗抗原的免疫物质和免疫细胞。
但是不能保证所有的疫苗都是安全的，有的疫苗能使机体终生产生免疫力，不需要再次接种疫苗，有的疫苗几个月后免疫力丧失，还需再次接种。
答案C6.关于单克隆抗体，下列叙述中不正确的是()A.可以制成诊断盒，用于疾病的诊断B.可以在生物体内生产，不能在体外生产C.可以利用基因工程技术生产D.可以与药物结合，用于病变细胞的定向治疗解析目前，制备单克隆抗体的方法是将经过免疫的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞，在体内或体外进行培养，最后经提取获得单克隆抗体。
由于单克隆抗体具有较强的特异性，所以可以制成单抗诊断盒，用于疾病诊断，也可以与药物结合，用于病变细胞的定向治疗，还可以利用基因工程技术生产。
答案B7.灭活疫苗是指()A.病原微生物经培养、杀灭后只保留免疫原性而制成的疫苗B.用毒力减弱或基本无毒的病原微生物制成的疫苗C.利用DNA重组技术生产的疫苗D.经处理只保留病原微生物中具有有效免疫原性的生物活性物质制成的疫苗答案A8.植物组织培养技术可以培养或生产()A.无病毒植株B.人工种子C.人参皂苷粉D.A、B、C均是解析无病毒植株、人工种子属于植物繁殖的新途径，人参皂苷粉属于细胞产物，这些都是植物组织培养的应用。
HER-2基因扩增检测(原位杂交法)
HER-2基因扩增检测（荧光原位杂交法）一．目的：乳腺癌组织细胞中的HER-2基因扩增指导临床用药。
二．检验原理：临床上常用病理学检查确诊为乳腺癌患者组织石蜡包埋切片，经处理后用荧光原位杂交方法进行分析。
乳腺癌细胞核中脱氧核糖核酸与HER-2位点及17号染色体着丝粒特异性荧光原位探针分别在高温下变性成单链脱氧核糖核酸，37℃环境中，这些已变性成单链的样本及探针核糖根据碱基互补的原则进行特异性结合，形成可补检测的杂交双链核酸，洗涤非特异性结合物后探针上标记的荧光信号可在显微镜下检测。
正常细胞显示2个HER-2位点及2个绿色17号染色体位点信号。
三．试剂配制四．标本准备1.从福尔马林固定石蜡包埋的乳腺癌组织中获取4微米切片，放置在经过防脱处理过的载玻片上。
2.将组织切片置于72℃下烤片1小时以上。
3.(趁热)将组织切片浸于二甲苯中室温脱蜡2次，每次2-5min，随后浸入100%乙醇中2-5分钟。
4.将组织切片依次置于100%乙醇、85%乙醇、70%乙醇中各1分钟复水。
将组织切片浸入去离子水3分钟，用绒纸巾吸取多余的水分。
5.蒸馏水微波加热至90℃ 30分钟。
6.取适量胃酶滴在组织上，37℃下孵育3分钟（视组织厚度而定），马上放入2X SSC（PH 7.0）清洗两次，5分钟。
7.将组织切片依次置于75%乙醇、90%乙醇、100%乙醇中各3分钟脱水。
8.自然干燥玻片。
9.探针配置前离心以免浪费。
10.将10微升探针混合物滴加于玻片杂交区域，立即盖上盖玻片，用橡皮胶封片。
（可加滴在盖玻片上）11.准备杂交仪器变性：95℃，5分钟，杂交条件37℃，18小时（过夜）。
12.快速洗涤：2X SSC溶液中37℃，振荡1-3秒，漂洗10min；0.3% NP-40/2X SSC溶液中37℃，振荡1-3秒，漂洗5min。
13.室温下将玻片置于70℃乙醇中，漂洗3分钟。
14.暗处自然干燥玻片，将DAPI复染剂加在杂交区域，立即盖上盖玻片。
560例乳腺癌患者全基因组测序的体细胞突变图谱
Landscape of somatic mutations in 560 breast cancer wholegenome sequencesNature. 2016 Jun 2;534(7605):47-54. doi: 10.1038/nature17676IF: 38.138背景1.癌症的基因突变理论指出“司机”（driver）突变使肿瘤细胞获得增殖优势，随之发生的“乘客”（passenger）也与肿瘤发生相关。
这些突变主要来自于内源性或外源性诱变剂暴露、异常DNA 编辑、复制错误和DNA修复缺陷；2.DNA测序技术可系统的分析肿瘤基因的各类突变，包括单碱基替换、小的插入/缺失、重排及拷贝数变异；3.目前大多乳腺癌基因组研究集中在蛋白编码的外显子区域，对非翻译区、内含子和基因间区研究有限，对揭示乳腺癌分子致病机制具有局限性。
研究方法1. 样本收集●560例乳腺癌患者外周血淋巴细胞样品DNA●560例病灶相邻正常乳腺组织或皮肤样品DNA●268乳腺癌患者totalRNA2. 测序及比对●测序平台：Illumina GAIIx, Hiseq 2000 或Hiseq 2500●肿瘤样品平均测序深度40.4X，正常对照样品平均测序深度30.2X3. 基因组数据处理4. 鉴定新的乳腺癌基因5. 非编码区域常见变异分析6. 变异特征分析7. Kataegis突变分析8. 重排突变分析●分类：聚簇类重排，非聚簇类重排●亚分类：缺失、倒位、串联重复, 1-10kb、10kb-100kb、100kb-1Mb、1Mb-10Mb、>10Mb（染色体间易位）研究结果——肿瘤基因及driver突变560例乳腺癌患者亚型分类●共检测到3,479,652个体细胞单碱基变异、371,993 个小的插入/缺失变异、77,695 个重排突变；●结合其他研究，共分析了1,332个乳腺癌患者的测序数据，完成了包含727个肿瘤基因的清单（包括MED23、FOXP1、MLLT4、XBP1和ZFP36L1共5个之前罕有研究或不明确的基因）。
TCR Vβ基因在乳腺癌免疫监测中的作用及临床应用
TCR Vβ基因在乳腺癌免疫监测中的作用及临床应用乳腺癌是一种常见的恶性肿瘤，虽然现今医学技术的发展，治疗手段和方法不断提升，但乳腺癌的术后复发率仍然很高。
因此，如何有效的监测病情变化是目前医学界面临的重大难题之一。
随着免疫学研究的不断深入，肿瘤免疫监测已经成为临床中一个很重要的诊断和治疗方法之一。
其中TCR Vβ基因在乳腺癌免疫监测中的作用尤为重要。
TCR Vβ基因是T细胞受体中β链的可变区域，其编码的蛋白质在外周血中有一定的表达，因此可以作为一种监测肿瘤特异性T细胞克隆扩增的指标。
在肿瘤的形成和发展过程中，由于肿瘤细胞的异质性，一些特定的TCR Vβ基因会被选择性地扩增，在外周血中的表达水平也相应地增高。
因此，通过检测外周血中特定的TCR Vβ基因的表达水平，可以较为准确地反应出肿瘤特异性T细胞的活性和扩增情况，从而判断肿瘤的免疫监测状态。
目前研究表明，外周血中特定的TCR Vβ基因的表达水平与乳腺癌患者的预后和治疗效果密切相关。
一些研究发现，术后外周血中特定TCR Vβ基因的表达水平与病人的无瘤生存期呈正相关，表明这些基因的高表达水平可以对疾病的局部复发和远处转移起到有效的监测作用。
同时，外周血中特定TCR Vβ基因的表达水平还可以作为肿瘤免疫治疗的效果监测工具。
乳腺癌免疫治疗通常包括免疫检查点抑制剂和CAR-T细胞治疗等，这些治疗方法都需要通过刺激T细胞的免疫反应来发挥治疗效果。
而外周血中特定的TCR Vβ基因的表达水平可以反映出肿瘤特异性T细胞的活性和扩增情况，从而较为准确地反映出免疫治疗的效果。
除此之外，外周血中特定TCR Vβ基因的表达水平还可以作为肿瘤诊断和预测转移风险的指标。
研究表明，术前外周血中特定的TCR Vβ基因的表达水平与乳腺癌患者的肿瘤组织中T细胞浸润程度呈正相关，表明这些基因的高表达水平可以反映出肿瘤组织中的T细胞免疫浸润情况，从而帮助判断肿瘤的分子亚型和预测转移风险。
以反向PCR扩增抗人宫颈癌单克隆抗体重链可变区基因
成及 序列 测定 ，由 大连宝 生 物工 程有 限 公 司完成 。
１ ２ 方 法 ．
共 ２ ５个循环 ：Ｐ Ｒ产 物经 ２ ／ Ｃ ０ ｇ Ｌ琼脂 糖凝 胶 电 泳 ．并 以胶
【 收 纯 化 ： ＤＮ 序 列 测 定 ：同 前 述 ： 旦 】 Ａ
１２ １ ３端 未 知 序 列 的 扩 增 ． ．
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Ｏｌ ｏ （ ，以 常 规 方 法 提 取 的 Ｃ Ｄ 细 胞 的 总 Ｒ Ａ 为 模 板 ， ｉ （Ｉ ｇ Ｔ） ｓＡ Ｎ 反 转 录 为 ｅ ＮＡ，再 扩 增 出 Ｄ Ｄ ＮＡ 双 链 。 因 扩 增 产 物 的 特 异
ＮＡ：在 １ Ｌ 的 体 系 中 ， 总 Ｒ Ａ １ ５Ｉ １ Ｔ缓 冲 液 ５ 加 Ｎ ． Ｌ、０ ｘＲ ｘ
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反 应 条 件 为 ： ０ １ ｌ ， ０ ６ ｌ ．８ ￣ ｌ ， 环 １ ３ ℃ ０ ｎ ｎ ５ ℃ ０ｎｉ ０Ｃ ２ｎ ｎ 循 ｉ ｎ ｉ
ｄ Ｔ Ｌ 引 物 Ｓ Ｎ Ｐ８Ｉ 、 ｚ 和 Ａ ！各 ０ ５ Ｉ Ｌ ａ ． Ｌ、Ａ Ｔ ｑ聚 合 酶 ０ ５ Ｌ ｚ ． 。 反 应 条 件 为 ： ４ ３ｎｉ ， ４ ３ ， ５ ３ ， ２ ５ ｒ ｎ ９ ℃ ｌ ９ ℃ ０ｓ ５ ℃ ０ ｓ ７ ｉ ， ｎ ａ
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文 章 编 号 ：１ ０ ８ ３ （ ０ ２ ０ ４ ９—０ ０ ７— ７ ８ ２ ０ ） ５— ８ ３
LncRNASNHG8对乳腺癌细胞MDA-MB-231的细胞生物学功能的影响
LncRNA SNHG8对乳腺癌细胞MDA-MB-231的细胞生物学功能的影响通信作者：李杰华,1978年5月，男，博士学位，主任医师，普通外科*******************基金项目：Rab25通过转录因子Snail调控三阴性乳腺癌上皮间充质转化的研究（2018GXNSFAA281255）摘要目的：探讨长链非编码RNA（LncRNA）SNHG8对乳腺癌细胞MDA-MB-231的细胞生物学功能的影响。
方法：收集乳腺癌患者的癌及癌旁标本，提取组织中的总RNA，实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）技术检测乳腺癌组织和癌旁组织中SNHG8的相对表达量；体外培养乳腺癌细胞株MDA-MB-231，设置三组对照组，分别是不转入任何载体的正常对照组，转入空载慢病毒的阴性对照组，以及转入过表达慢病毒的SNHG8过表达组；CCK-8检测细胞增殖情况；划痕实验检测细胞迁移情况，transwell实验检测细胞侵袭情况，使用IBM SPSSStatitics25进行统计学分析。
结果：SNHG8在乳腺癌组织中表达量低于癌旁组织，差异具有统计学意义（P<0.05）；正常对照组和阴性对照组的细胞在OD 值，细胞迁移率和穿膜细胞数无明显差异（P>0.05），正常组的凋亡率要低于阴性对照组（P<0.05）；SNHG8过表达组的细胞OD值，细胞迁移率和穿膜细胞数明显低于空白对照组和阴性对照组（P<0.05）。
结论： LncRNA SNHG8抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231的增值，迁移和侵袭。
关键词乳腺癌;长链非编码RNA;SNHG8背景据2021年GLOBOCAN全球癌症统计数据显示，全球乳腺癌每年新发病例高达226万例，乳腺癌已取代肺癌成为全球第一大癌症[1]。
在我国，乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤,发病率位居中国女性恶性肿瘤首位[2]。
乳腺在各种内外因素的作用和影响下，比如：激素[3]、遗传因素[4]、机体免疫功能下降[5]；病毒[6]、放射线[7]等发生发展为乳腺癌。
利用噬菌体表面展示技术克隆抗人DR5抗体可变区基因
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抗人Clq轻链可变区基因在E．coli中的表达
抗人Clq轻链可变区基因在E．coli中的表达
陈克敏;朱锡华
【期刊名称】《免疫学杂志》
【年(卷),期】1995(11)3
【摘要】应用基因工程技术，将抗人Ｃｌｑ轻链可变区基因（ＣｌｑＶ＿Ｌ）由重组质粒ｐＧＥＭ－ＣｌｑＶ＿Ｌ中分离，克隆进表达载体ｐＪＬＡ５０２。
该表达载体含ＣＩＴｓ８５７抑制子基因，通过开温诱导法，重组表达子在宿主菌ＨＢ１０１中表达，获得抗人Ｃｌｑ轻链可变区片段，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ表明其分子量范围为１２～１３ＫＤ。
这为进一步抗人Ｃｌｑ小抗体的表达积累了经验，有利于用于抗原－抗体结构功能的研究。
【总页数】4页(P147-149)
【关键词】轻链可变区;基因表达;单克隆抗体;大肠杆菌
【作者】陈克敏;朱锡华
【作者单位】第三军医大学免疫学教研室
【正文语种】中文
【中图分类】R392.11;R392.2
【相关文献】
1.抗人纤维蛋白单克隆抗体重链和轻链可变区基因克隆和表达 [J], 宋增璇;蔡英林
2.抗人膀胱癌单克隆抗体轻链可变区基因的克隆及其原核表达载体的构建 [J], 陈家存;张俊杰;温儒民;薛松;胡书群;孙亚峰;裴冬生
3.抗人Clq单克隆抗体轻链可变区基因的克隆及序列测定 [J], 陈克敏;朱锡华
4.抗人C(1-INH) McAb轻、重链可变区基因的克隆及其在E.coli中表达的研究[J], 高宁;朱锡华
5.抗人C_1q轻链可变区基因在DH_（5α）中的表达及序列同源性分析 [J], 陈克敏;朱锡华
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(选考)2021版新高考生物一轮复习第十单元生物技术与工程第34讲基因工程高效作业知能提升新人教版
第34讲基因工程1．(2020·江苏徐州考前模拟)下列有关基因工程技术的叙述，正确的是( )A．不同的限制酶切割形成的黏性末端一定不同B．PCR中周期性的温度设置是特定的，与扩增的目的基因和引物无关C．在构建基因表达载体时通常需要大量的目的基因和载体D．质粒上的目的基因都必须整合到受体细胞的DNA上并表达解析：选C。
不同的限制酶切割形成的黏性末端可能相同，也可能不同，A错误；PCR 中周期性的温度可在一定范围内设置，不是特定的，B错误；在构建基因表达载体时通常需要大量的目的基因和载体，这样获得基因表达载体的概率更高，C正确；质粒本身也是DNA，也能自我复制，所以进入受体细胞以后，既可以自己进行表达，也可以整合到体细胞的DNA 上并表达，D错误。
2．实验室常用PCR技术对DNA进行体外扩增，下列相关叙述正确的是( )A．95 ℃时DNA的磷酸二酯键断开B．引物与模板结合后向5′方向延伸C．反应过程包括变性→复性→延伸D．需要解旋酶和耐高温的DNA聚合酶解析：选C。
95 ℃时DNA的氢键断开，A错误；引物与模板结合后向3′方向延伸，B 错误；反应过程包括变性→复性→延伸，C正确；PCR技术通过高温解旋，不需要解旋酶，D 错误。
3．在应用农杆菌侵染植物叶片获得转基因植株的常规实验步骤中，不需要的是( ) A．用携带目的基因的农杆菌侵染植物细胞B．用选择培养基筛法导入目的基因的细胞C．用聚乙二醇诱导转基因细胞的原生质体融合D．用适当比例的生长素和细胞分裂素诱导愈伤组织生芽解析：选C。
农杆菌侵染细菌是基因工程中常常用到的把目的基因导入植物细胞的方法，A正确；目的基因是否导入了细胞，需要在选择培养基上进行筛选，B正确；在植物细胞组织培养的过程中，需要调整培养基中生长素和细胞分裂素的比例，来达到对其脱分化和再分化的控制，D正确；在农杆菌侵染植物细胞的过程中并没有涉及原生质体的融合，C错误。
4．下列关于核酸分子杂交和抗原—抗体杂交的叙述，正确的是( )A．核酸分子杂交是指两条脱氧核苷酸链的杂交B．抗原—抗体杂交的原理为碱基互补配对原则C．核酸分子杂交可检测目的基因的存在和转录D．抗原—抗体杂交常以目的基因产物作为抗体解析：选C。
抗人肿瘤内皮标志物1 ( TEM1)抗体的表达及活性鉴定
细胞与分子免疫学杂志(Chin J Cell Mol Immunol)2020,36(12)1129•论著•文章编号：1007-8738(2020)12-1129-05抗人肿瘤内皮标志物1(TEM1)抗体的表达及活性鉴定张玲玲'，吴介恒S韩东晖'，杨发S郑国旭S席文锦-郭张燕-杨安钢2,秦卫军顼，温伟红仆(空军军医大学：I西京医院输血科J基础医学院免疫学教研室，彳西京医院泌尿外科，陕西西安710032;°西北工业大学医学研究院，陕西西安710072)［摘要］目的构建抗人肿瘤内皮标志物1(TEM1)全抗体IgG78的真核表达载体，进行表达纯化后鉴定其生物学活性。
方法利用PCR分别从单链抗体ScFv78中扩增TEM1抗体的轻、重链可变区基因，并克隆入带有小鼠抗体恒定区的真核表达载体Bichim-L,瞬时转染HEK293F细胞，表达产物用蛋白G亲和层析柱进行纯化，所得蛋白用SDS-PAGE和Western blot法进行鉴定，采用流式细胞术和活细胞ELISA检测该抗体与TEM1阳性细胞的结合特异性及亲和力。
结果成功构建了TEM1全抗体IgG78的真核表达载体，并在HEK293F细胞中表达。
SDS-PAGE和Western blot法证实目的蛋白符合预期大小，流式细胞术及细胞ELISA结果显示该抗体可特异性结合TEM1阳性肿瘤细胞，且有较高的亲和力。
结论成功获得了一株具有良好结合特异性和较高亲和力的TEM1抗体。
［关键词］肿瘤内皮标志物1(TEM1)；CD248；抗体；HEK293F细胞；真核表达［中图分类号］R392.ll,R730.51,R392-33［文献标志码］A肿瘤内皮标志物1(tumor endothelial marker1, TEM1),又称内皮唾液酸蛋白或CD248,人TEM1基因定位于染色体Hql3,其编码的TEM1蛋白相对分子质量(他)为165000,是一种单链跨膜糖蛋白⑷。
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人乳腺癌全套抗体可变区基因的扩增与克隆吕勇刚1,窦科峰1,吴昱彤2,赵爱志1,刘 杰4,陈 刚5,陶开山1,药立波3(1.第四军医大学西京医院肝胆外科,陕西西安 710033;2.唐都医院信息科,陕西西安 710038;3.基础部生物化学教研室;4.基础部药理学教研室,陕西西安 710032;5.西安交通大学第一医院血液科,陕西西安 710061)摘要:目的 扩增人乳腺癌抗体全套可变区基因,将其克隆到T 载体来构建T 载体文库。
方法 收集乳腺癌患者外周转移淋巴结30例,TRIzol 法提取总RNA 、纯化mRNA ,行RT 2PCR 扩增,制备T 载体,用于PCR 产物的克隆。
结果 总RNA 纯度高,完整性好,mRNA 获得率为1%。
经RT 2PCR ,V H 、V λ、V κ的每一条5’端引物均与其相应的3’端引物成功地扩增出了可变区基因片段,轻、重链T 载体库分别为1.7×108和3.5×108。
结论 所采用的引物能够100%扩增目的片段,T 载体过渡能显著提高克隆效率,为噬菌体抗体库的构建和筛选奠定了基础。
关键词:聚合酶链式反应;乳腺癌;抗体基因;T 载体中图分类号:R737.9 文献标识码:A 文章编号:167128259(2004)0620558204Amplif ication of all human V genes of breast carcinomafrom peripheral lymphadensL üY onggang ,Dou Kefeng ,Wu Yutong ,Zhao Aizhi ,Liu Jie ,Chen G ang ,Tao Kaishan ,Yao Libo(Department of Hepatobiliary Surgery ,Xijing Hospital ,Fourth Military Medical University ,Xi πan 710033,China )ABSTRACT :Objective To amplif y all human V genes of breast carcinoma by R T 2PC R.The p roducts of PC R were cloned int o T 2vect or t o const ruct clone library.Methods Perip heral lymp hadens of 30p atients wit h breastcarcinoma were collected ,f rom w hich t otal RNA was ext racted by TRIzol Reagent ,and m RNA was p urified wit h Oligotex m RNA kit.Then cDNA was derived t hrough reverse t ranscrip tion.PC R p roducts were amplified and cloned int o T 2vect or t o const ruct clone libraries.Re sults Total RNA was ext racted p urely and intactly ,so wasm RNA w hich accounts f or 1%of t he f or mer.By R T 2PC R ,every p air of p rimers amplified t he V gene efficiently.Rep ert oires of V H and VL were 3.5×108and 1.7×108resp ectively.Conclusion The set of p rimers adop ted areable t o recognize 100%of f unctional V genes wit h high efficiency.T 2vect or will f acilitate t he digestion ,w hich laysa f oundation f or const ruction and selection of p hage library.KE Y WOR DS :p olymerase chain reaction ;breast carcinoma ;antibody gene ;T 2vect or收稿日期:2004204214 修回日期:2004205211基金项目:国家自然科学基金资助(No.30371399)通讯作者:药立波,T el :83374547211;E 2mail :bioyao @ 作者简介:吕勇刚(19742),男(汉族),医师,在读博士. 噬菌体抗体库技术是90年代抗体工程领域的重大进展,能够绕开免疫途径,直接制备全人源化的抗体片段。
它将选择能力和扩增能力偶联起来,较好地模拟了体内B 细胞产生特异性抗体的过程。
传统的单克隆杂交瘤技术与之相比,已经显得“迟缓和笨拙”,有被逐渐取代的趋势1。
PCR 技术的发展,使得人们可以用一组引物扩增全套抗体的可变区基因,是抗体库技术出现的先决条件之一2。
我们采用一组高效引物,以乳腺癌患者的外周淋巴结为原料,扩增抗体的全套可变区基因,并将其首先克隆入T 载体,构建各自的T 载体文库,有助于提高PCR 产物的酶切和高效克隆,为抗体库的构建打下基础,并在方法学上进行了探讨。
1 材料与方法1.1 酶和化学试剂 TRIzol 提取液购自Invitrogen公司;DEPC 为Sigma 产品;r Taq DNA 聚合酶、dN TP 购自大连宝生物制品公司;mRNA 纯化试剂盒为Q IA GEN 产品;反转录试剂盒为Promega 产品;DNA 凝胶纯化试剂盒、大提质粒试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司。
1.2 组织总RNA 的提取 术中剥离乳腺癌患者外周淋巴结30例(标本均经病理证实),迅速冻于液氮,第25卷第6期2004年12月西安交通大学学报(医学版)J our nal of Xi πan J iaot ong U niversity (Medical Sciences )V ol.25N o.6Dec.2004置研磨器研成粉末,移入匀浆器加入TRIzol研至透亮,按照说明书(Invitrogen)操作得到总RNA,紫外分光光度仪定量并检测其完整性,质量较差者弃用,重新提取,最后30例所得总RNA各取等量混合, -80℃冻存备用。
1.3 mRNA纯化 按照试剂盒(Qiagen)进行,部分改良。
按说明加入OEB(第8步)后,仔细吹打完毕, 70℃保温5min,迅速于26℃、16000×g离心2min,取小份定量,测定A260nm/A280nm值。
1.4 反转录 按照试剂盒说明书进行(Promega),部分改良。
取mRNA约0.5μg,70℃保温20min打开二级结构,迅速置冰上。
按说明书依次加入各成分,置室温20min,42℃3min后再加入抑制剂和AMV反转录酶,总体系20μL。
42℃90min,95℃5min。
1.5 引物设计与合成 引物设计参见文献3,适当改动和取舍,由赛百盛公司合成,PAGE纯化。
我们在所有引物的5’端延长一段保护序列:①VH Back primers:TT A TCA TCG AG C CCG CTC G AG—;②VH Forward primers:G AT TGG TTT G CC CT A G CT AG C—;③Vλand VκBack primers:AG C AAG CGG CG C TTG G CG CG C—;④Vλand VκForward primers: GTT ATG GTC G AA CG C GTC G AC—。
下划线依次引入XhoⅠ、N heⅠ、Bss HⅡ、S alⅠ酶切位点,第二轮PCR的引物同保护序列。
1.6 PCR反应 共进行两轮。
第一轮以0.5～1μL 反转录产物cDNA作为模板,3′端引物等摩尔混合,分别与5′端各引物反应。
反应条件为:94℃5min 热启动,94℃1min变性,55℃1min退火,72℃1min延伸,共30循环。
最后进一步延伸7min,反应体系为25μL,将得到的PCR产物按比例混合(V H 混合,VL和V K以1∶2混合),胶回收纯化后100倍稀释,作为第二轮PCR的模板。
反应体系同上。
最后每管加入0.3μL dA TP继续延伸30min,目的是下一步连入T载体。
经胶回收纯化后得到可变区抗体基因。
1.7 T载体的制备 T载体的前身是pSP73,我们实验组赵爱志博士去除相应的酶切位点后命名为pSP732T,转入大肠杆菌TG1,用于制备T载体。
挑取TG1菌落转接于500mL培养液,摇过夜后大提质粒,平端酶Eco RⅤ使pSP732T线性化,酚/氯仿、氯仿抽提纯化后在r2Taq酶,d TTP作用下于72℃加温2h,琼脂糖电泳纯化后定量备用。
1.8 轻、重链T载体库的构建 V H、VL经胶回收定量后各取1.5μg和2μg T载体连接,体系20μL。
16h后70℃30min灭活T4DNA连接酶。
取1μL 连接产物与50～100μL感受态细胞进行规模电转化(TG1感受态的制备见文献4,电转参数:0.1mm～1.8kV;0.2mm～2.5kV;电阻、电容均分别为200Ω;25μV),每次电转后用1mL37℃预热的SOC洗出并快摇1h复苏,取小份倍比稀释,铺抗生素琼脂板计算菌量,随机挑克隆双酶切验证阳性率。
其余铺氨苄琼脂板,过夜后收获细菌提质粒,即为V H、VL 的T载体库。
2 结 果2.1 总RNA及mRNA的提取和纯化 总RNA经1 g・L-1甲醛变性琼脂糖凝胶电泳,90V4h,0.1 mol・L-1NH4AC浸泡凝胶20min后,在含有0.4 mg・L-1E B的0.1mol・L-1NH4AC中染色30min,紫外透射读胶仪上观察RNA电泳条带并照像。
28S带的亮度为18S带的两倍,说明总RNA完整性好,未被降解(图1)。
总RNA的量为1mg,mRNA的量为10μg,获得率为:10μg/1000μg=1%,A260nm/A280nm= 2.0。
表明mRNA纯度高,没有污染。
图1 淋巴结总RNA甲醛变性琼脂糖凝胶电泳Fig.1Total RNA from human lymphadens analyzed by formalde2 hyde denaturing agarose electrophoresis2.2 cDNA的同位素示踪 反转录后取少量行碱性琼脂糖凝胶电泳,经放射自显影,结果表明,cDNA合成为连续拖影,片段大小相似,分布范围较宽,从0.3kb到9.4kb,主要集中在2kb左右,结果证实了模板mRNA的完整性(图2)。