瘦素(Leptin)对小鼠细胞因子分泌及脾淋巴细胞增殖状况的影响

瘦素（Ｌｅｐｔｉｎ）对小鼠细胞因子分泌及脾淋巴细胞增殖状况的影响1 材料与方法1.1 动物及其分组处理选用8周龄重20g的雄性清洁级BALB/c小鼠40只，应用抽签法，随机分成五组，每组8只。

A组：(B、C组的对照组)注射PBS（磷酸盐缓冲液）；B组：注射小鼠Leptin (2.0 mg/kg/d )；C组：注射小鼠Leptin抗体(0.2 mg/kg/d )；D组：(E组的对照组)注射CsA（环孢素）(2.0mg/kg/d )；E组：注射CsA+Leptin (CsA为2.0mg/kg/d, Leptin为2.0mg/kg/d )。

7d后处死。

所有小鼠作腹腔注射, 1 d分2次。

1.2 主要试剂IL-2、IL-4、IFN-γ的ELISA试剂盒(R&D Systems公司)、重组小鼠Leptin (R&D Systems公司)，使用前稀盐酸激活溶解后，再用NaOH中和至pH为5.2。

1.3 细胞分离1.3.1 外周血淋巴细胞分离取A、B、C三组小鼠全血(EDTA抗凝)部份分离血浆待测细胞因子；另外，按常规用淋巴细胞分离液分离制备单个核细胞悬液，并调整细胞浓度为1×106/ml供检测。

1.3.2 脾淋巴细胞悬液制备取A、B、C、D、E五组小鼠脾脏按常规制备细胞悬液并调整细胞浓度为1×106/ml待测。

1.4 脾淋巴细胞增殖试验采用常规的3H-TdR掺入法(细胞终浓度为5×105/ml)，所用刺激剂(ConA的终浓度2.5μg/ml)，用液闪测定仪测定细胞增殖cpm值，最终数值取3个复本的中位数。

1.5 细胞因子的测定待测样品为A、B、C组小鼠血浆，D、E组小鼠血清，测定项目包括IL-2、IL-4、IFN-γ，均用相应的ELISA试剂盒，检测步骤均按相应的说明书。

1.6 统计学方法用独立样本均数t检验，配对样本t检验，以及单因子方差分析one way ANOV A，并SNK(Student-Neuman-Keul)、LSD (Least-significant difference )在均值间作成对比较。

统计函数计算用SPSS11.5统计软件运算。

2 结果2.1 脾淋巴细胞增殖五组的脾淋巴细胞增殖情况见表1。

A、B、C三组单独脾细胞增殖数据经统计学处理存在显著性差异；其中A组与B组未见显著差异；而A组与C组比较有极显著差异, C组增殖反应弱于A组；D组与E组有极显著差异，E组(用Leptin+CsA)增殖反应强于D组(单用CsA)。

各组加Leptin 与未加Leptin比较,除了在体内已经注射过Leptin的B、E两组没有显著性差异外,其余均有显著差异，脾细胞增殖反应均增强。

2.2 细胞因子测定2.2.1 外周血细胞因子测定结果见表2。

A、B、C三组外周血IFN-γ测定值统计结果是：此三组存在显著性差异，P= 0.008 ，其中A组与B组比较P =0.006，有显著差异，B组IFN-γ水平高于A组；而A组与C组比较P =0.976，无显著差异。

D组和E组血清IFN-γ统计比较，P =0.034,有显著性差异, E组的IFN-γ水平高于D组。

A、B、C三组外周血IL-4经统计此三组无显著性差异，P =0.450；D组和E 组比较,P =0.024，有显著性差异, E组的IL-4水平低于D组。

A、B、C三组外周血IL-2经统计此三组无显著性差异，P =0.487，D组和E 组比较，P=0.003,有显著性差异, E组的IL-2水平高于D组。

2.2.2 脾细胞培养液中测得的细胞因子水平结果见表3 。

脾细胞培养液与体外加Leptin的IFN-γ浓度经成对样本t检验后显示: A组P =0.007, B组P =0.480, C组P =0.029, D组P =0.002, E组P =0.025，除B组外，其余均有显著性差异，提示在体外加入Leptin会升高IFN-γ浓度。

在体外加入Leptin的各组脾细胞培养液中测得IL-4浓度与未加Leptin的各组经检验后显示: A组P =0.001, B组P =0.000, C组P =0.014,D组P =0.001, E组P=0.001，均有显著性差异，提示在体外加入Leptin会降低IL-4浓度。

体外加入Leptin的各组脾细胞培养液中测得的IL-2浓度与未加Leptin的各组经成对样本t检验后显示: A组P =0.030, B组P =0.021, C组P =0.095, D组P =0.010, E组P =0.001，除C组外，其余均有显著性差异，提示在体外加入Leptin 会增加IL-2浓度。

3 讨论Leptin对数种免疫细胞有刺激和抗凋亡作用。

在体外试验有人发现Leptin可以提高人类血液中T淋巴细胞的应激性并能促进其增殖［2］。

Th细胞可发展成功能不同的两个亚群，即:Th1和Th2，其中，Thl又称为自然T细胞，为CD 4CD 45 RA + T细胞，Th2又称为记忆T细胞，为CD 4CD 45 RO + T细胞。

Thl分泌抗炎性细胞因子:IL-2 ,IL-12，IFN-γ,不分泌IL-4，主要辅佐T细胞介导产生的迟发性过敏反应。

Th2分泌免疫调节功能细胞因子:IL-4、5、6、9、10、13，不分泌Il-2，IFN-γ，主要辅佐抗体产生，介导体液免疫。

Leptin对天然T细胞(CD 45 RA)和记忆细胞(CD 45 RO)有促进增殖作用，但作用程度不同，对前者的刺激作用远大于后者［3-4］。

有关Leptin对免疫系统作用的研究大多采用先天性Leptin缺陷的ob/ob或db/db小鼠模型上。

本研究选用无Leptin缺陷小鼠的外周血淋巴细胞、脾细胞经T细胞特异的有丝分裂原诱导测定其增殖能力以及与免疫应答有关的细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4,从而能较好反映外周T淋巴细胞的功能。

鉴于脾脏是外周最大的免疫器官，其中富含T细胞，经ConA刺激后能很好反映外周T淋巴细胞的增殖状况。

实验结果提示，在正常状态下(指正常免疫状态和正常Leptin水平状态)，提高Leptin水平不能刺激细胞增殖，可能的解释一是所补充的外源性Leptin剂量没有达到足够引起细胞增殖变化的水平；二是在正常状态下的Leptin水平已经饱和，进一步提高其浓度已不能引起细胞的明显变化。

但从本次体外实验情况来看，除了两组注射过Leptin的小鼠外，其余各组在体外加入Leptin后，细胞增殖均得到加强，这表明, Leptin本身能直接增加细胞增殖；据报道在体外Leptin对细胞增殖存在剂量—效应关系［5］，推想上述第一种解释似更合理。

两组注射过Leptin的小鼠在体外加入Leptin后,脾淋巴细胞增殖上没有显示差异，可能原因是：脾淋巴细胞在体内已经受到较高Leptin 水平的刺激，细胞处于一种对Leptin低敏感状态，而本实验体外加入的Leptin 浓度没有达到使这类细胞引起明显变化的水平；还有可能是较高Leptin水平在体内已经使细胞受体处于饱和状态,从而在体外对Leptin根本不能产生反应。

然而，体内情况远较体外复杂,究竟什么原因尚待进一步的研究。

在用环孢素引起低免疫状态的两组小鼠(D组和E组)中，体内和体外试验都明确显示：Leptin水平增高会促进T淋巴细胞的增殖，亦即在细胞增殖上, Leptin 至少可部分抵消环孢素的免疫抑制作用，从细胞因子的测定水平情况来看,也证实了这点。

本次细胞因子实验发现,当机体处于免疫抑制状态时(D组和E组),提高Leptin水平,可以升高IFN-γ、IL-2的浓度,而IL-4的浓度下降。

体外加入Leptin 的对比试验结果也出现与之相同的现象。

这与文献报道在ob/ob小鼠模型上发现的细胞因子的变化基本一致［6］。

但A、B、C三组体内试验结果中,仅B组有IFN-γ浓度的升高,其他因子和各组均未表现出有差异性的结果,其原因不明,可能同细胞增殖的情况相似。

Kokot ［7］等发现，成功肾移植2.5年后多数长期存活的肾移植受者在肾功能正常的情况下又会出现Leptin水平显著升高，其机理不清，至今也没有一个较为满意的解释，但Leptin升高必然会引起机体免疫代谢的改变。

Kagnn等［8］进一步研究发现肾移植成功后血清Leptin的增加与肌酐清除率呈显著正相关，与血清肌酐浓度呈负相关，并认为这可能与移植后的营养状态及肾功能改善有关。

已证明，Leptin在体内、外均可刺激肾小球内皮细胞增生，引起大鼠蛋白尿和肾小球系膜基质肿胀，认为Leptin可对肾小球细胞产生慢性刺激，导致肾小球病变和肾功能损害。

Tauchmanova等［9］研究表明造血干细胞移植术后的高Leptin血症可能通过T细胞活化途径促使了慢性移植物抗宿主病( cGVHD)的的进展。

这些研究似乎提示我们，远期移植肾患者血Leptin水平升高，抵消了CsA抑制Th1细胞分泌Il-2作用，可能造成肾移植长期生存患者已经建立起来的免疫均衡状态的失衡，从而影响移植肾的长期生存。

总之,实验表明在体外试验中Leptin水平增高会促进T淋巴细胞的增殖,可以引起IFN-γ、IL-2分泌的增加,抑制IL-4的产生；而Leptin缺陷使T淋巴细胞的增殖活动降低。

在活体动物试验中，提高Leptin 水平,对正常小鼠的T淋巴细胞的增殖没有明显影响,虽能使IFN-γ浓度上升,但IL-2、IL-4没有显著变化；而对环孢素引起的低免疫状态小鼠,升高Leptin水平则可以获得与体外试验相同的结论。

这个现象的存在为长期存活肾移植病人免疫状态的评估提供了一个新的视角。

目前, Leptin的免疫作用对临床疾病影响日益受到关注。

长期存活的肾移植受者体内高Leptin水平是否和移植肾慢性排斥相关有待进一步的临床和基础研究。