透射电镜样品制备技术改良研究

透射电镜样品制备技术改良研究摘要透射电镜样品制备技术改良研究结果表明，通过延长锇酸固定时间和包埋剂梯度渗透时间，避免了细胞器的降解，有利于细胞组织保存和超微结构的观察，并且减少了包埋块切割过程中的破损现象和刻痕，提高了切割质量，此方法能提高生物样品制备质量。

关键词透射电子显微镜；样品制备；超微结构；超薄切片；技术改良近年来，电子显微镜广泛应用于材料科学、生命科学和临床病理诊断等领域，是科学研究的一个重要手段。

但由于生物材料电镜样品制备过程繁琐和样品质量不高，影响了样品结构的观察研究，耗费了研究者许多时间和精力，制约了科研的发展[1-2]。

针对不同细胞的生物学特征，需调整不同的样品制作过程，如选择合适的固定液和操作时间[3]。

笔者通过长期摸索，总结出一套简便高效的样品制作方法，提高了电镜超薄切片的观察和分辨率，为获得高质量透射电子显微镜切片提供一条新途径。

植物细胞生物学特征比其他细胞复杂，本文以红枫为例，介绍改良后的电镜样品制备技术。

1 材料与方法1.1 供试材料与设备植物样品：红枫（Acer palmatum Atropurpureum），安庆师范学院植物园提供；设备：Leica EM UC6超薄切片机、日本电子JEM 1400透射电子显微镜。

1.2 试验方法一是取材。

采摘红枫叶片后，立即切成1～2 mm3，投入2.5%戊二醛固定液中。

取样时所用器具必须干净，刀、剪等必须锋利，在操作时尽量避免拉、锯、压等动作对组织细胞造成的机械损伤。

二是前固定。

2.5%戊二醛固定液先于4 ℃放置2～3 h，后在冰箱过夜（戊二醛中最多放置7 d）。

三是冲洗。

于4 ℃，用0.1 moL/L PBS Buffer （pH值7.2）冲洗3次，每次10～15 min（0.1 moL/L PBS 配制方法：50 mL的0.2 moL/L PBS Buffer+50 ddH2O）。

四是后固定。

室温下，用1%锇酸浸没样品，不超过4 h，一般2 h。

江西林业科技２００８年第１期植物电镜样品的制备有多种方法，由于植物细胞的生物学特征的特殊性，因此采用怎样的方法制备电镜样品，将得到效果不同的结果。

为了使电镜样品尽可能地保存较多的微细结构而不被破坏，并保持其原有的形态，本文对已有的植物电镜样品制备技术进行了改进，取得了较好的效果。

１实验材料与仪器在实验过程中，选择双子叶植物、单子叶植物的嫩茎、叶作为实验材料，并且在叶的质地上分别选择表面具毛的纸质叶和表面无毛的革质叶进行实验（表１）；取样时间是２００６年４月；取样植物中双子叶植物是：刺毛杜鹃ＲｈｏｄｏｄｅｎｄｒｏｎｃｈａｍｐｉｏｎａｅＨｏｏｋ，华丽杜鹃［１］Ｒｈ．ｆａｒｒｅｒａｅＴａｔｅｅｔＳｗｅｅｔ，满山红Ｒｈ．ｍａｒｉｅｓｉｉＨｅｍｓｌ．ｅｔＷｉｌｓ，马银花Ｒｈ．ｏｖａｔｕｍ（Ｌｉｎｄｌ．）Ｐｌａｎｃｈ．ｅｘＭａｘｉｍ．，滇白珠ＧａｕｌｔｈｅｒｉａｌｅｕｃｏｃａｒｐａＢｌ．ｖａｒ．ｃｒｅｎｕｌａｔａ（Ｋｕｒｚ）Ｔ．Ｚ．Ｈｓｕ，构树Ｂｒｏｕｓｓｏｎｅｔｉａｐａｐｙｒｉｆｅｒａ（Ｌ．）Ｖｅｎｔ．；单子叶植物是广东石豆兰茎ＢｕｌｂｏｐｈｙｌｌｕｍｋｗａｎｇｔｕｎｇｅｎｓｉｓＳｃｈｌｔｒ．。

实验所使用的透射电镜是日立Ｈ—６００型，工作电压为７５ｋｖ。

植物透射电镜样品制备技术的改进刘仁林１，虞功清２，邹伟民２，杜天真３（１．赣南师范学院生命科学系，江西赣州３４１０００；２．南昌大学医学院电镜室，江西南昌３３０００６；３．江西农业大学园林与艺术学院，江西南昌３３００４５）摘要：应用植物透射电镜样品制备技术的改进方法对双子叶植物、单子叶植物营养器官进行电子显微镜超薄切片制备效果的实验研究，目的是找到一种比常规制备方法更简便、更经济、效果更好的制备技术。

实验结果表明：通过对常规制备技术两个方面的改良，可以保存较多的微细结构而不被破坏，清晰度较高，并能保持其原有的形态；制备方法也简便、经济。

关键词：植物；电镜超薄切片；技术改进分类号：Ｑ９４文献标识码：Ａ文章编号：１００６－２５０５（２００８）０１－００４１－０３分类群取样地点海拔ｍ生境取样部位及特征凭证标本构树Ｂｒｏｕｓｓｏｎｅｔｉａｐａｐｙｒｉｆｅｒａ江西南昌５０荒坡嫩茎尖，具毛Ｌ０６００４４滇白珠ＧａｕｌｔｈｅｒｉａｌｅｕｃｏｃａｒｐａＢｌ．ｖａｒ．ｃｒｅｎｕｌａｔａ井冈山９４０疏林下嫩叶，无毛，近革质Ｌ０６００４７刺毛杜鹃Ｒｈｏｄｏｄｅｎｄｒｏｎｃｈａｍｐｉｏｎａｅ广东南岭９１８路边林下嫩茎尖，具腺毛Ｌ０６００８华丽杜鹃Ｒｈ．ｆａｒｒｅｒａｅ江西寻邬３１０荒山灌丛嫩叶，具毛，展叶１０天Ｌ０６００２满山红Ｒｈ．ｍａｒｉｅｓｉｉ江西安远２２０荒山灌丛嫩茎，具毛，刚展叶Ｌ０６００３马银花Ｒｈ．ｏｖａｔｕｍ上犹营盘山１４００山脊嫩茎，无毛，叶革质Ｌ０６００２４广东石豆兰茎Ｂｕｌｂｏｐｈｙｌｌｕｍｋｗａｎｇｔｕｎｇｅｎｓｉｓ广东南岭１３６０山谷岩石嫩茎，无毛，叶革质Ｌ０６００６１电镜样品制备取样表１２制备技术研究２．１取样与固定取当年生叶片（展叶后７￣２０天），无病虫危害，无其他污染。

透射电镜生物样品制备方法我折腾了好久透射电镜生物样品制备方法，总算找到点门道。

一开始的时候，我真是瞎摸索，走了不少弯路。

就说取材这一步吧。

我最开始取材，根本就没有考虑到样本的新鲜度有多重要。

有一次我取了一块组织，因为中间耽搁了点时间，结果后面在电镜下看的时候，细胞结构那叫一个模糊，好多细节都没了。

我这才恍然大悟，取材就得要快，尽可能减少样本暴露在外界的时间。

好比咱摘个苹果，要是在手里捏半天再去观察它的表皮细胞，肯定和刚摘下来就看是不一样的。

而且取材的时候大小也要合适，不能太大，大了后续处理不容易，像大房子打扫起来总是比小房子费劲。

固定也特别关键。

我试过用戊二醛固定，这个浓度可得小心。

浓度高了呢，可能会对样品有损伤；浓度低了嘛，又固定不好。

我一开始没经验，浓度没调好，整个样品固定下来乌七八糟的。

后来我就严格按照标准来配比，慢慢就好了很多。

就像做菜放盐，咸了淡了都不行。

清洗这一步我也没少摔跤。

清洗不彻底的话，残留的固定液还在样本上，也会影响后面的成像。

我之前总是洗得马马虎虎的，直到得到很糟糕的结果后才知道要多用心。

这就好比洗衣服，得把洗涤剂都漂洗干净。

脱水这一环节是个精细活儿。

我打算用一系列不同浓度的乙醇来脱水。

乙醇浓度要逐渐升高，得一步一步来，不能跳着来。

我就试过急着快点完成这一步，跳了个浓度，结果样本皱巴巴的，在电镜下看完全不是正常的形态了。

这就像盖房子，基础没打好，上层肯定不稳。

包埋的时候也是，要选择合适的包埋剂。

我用过环氧树脂包埋，这个过程中要按照正确的比例混合包埋剂，就像调鸡尾酒，比例不对就调不出那个味道。

关于切片，我最大的教训就是切片的厚度。

切得太厚，图像叠影重重，看不清楚；切得太薄又容易弄碎。

这得靠多练习，掌握自己设备的脾气，就跟炒菜掌握火候似的，多试几次就有感觉了。

最后就是染色了，染色剂的选择和染色的时间都需要好好琢磨。

用错了染色剂或者染色时间不对，呈现出来的图像颜色就不对，对比度不行，很多结构就显示不出来。

5.2.3.1 金属薄膜样品的制备
目前较普遍地被采用的金属薄膜制备过程大体是： 线切割----机械研磨（或化学抛光）----化学抛光---电解抛光。具体方法如下：
1.线切割：用线切割机床从大块样品上切下0.2-0.3mm厚的机械研磨预减薄 ：机械研磨方法与金相试样抛光过程基本

碳一级复型示意图
二级复型






（1）用常规方法将试样表面抛光、腐蚀，其腐蚀深度较一般金相 腐蚀略深。 （2）配制好0.5%、1%、2%、5%几种不同浓度的火棉胶醋酸异 戊脂溶液。 （3）取0.5%的火棉胶溶液均匀地涂于试样表面，用红外灯烤干， 依次用同样的方法将1%、2%或5%的火棉胶溶液涂于试样表面， 并烤干。 （4）用透明胶带紧贴火棉胶面，不能有气泡，小心地将胶带与复 型膜一同揭下来，让复型膜面朝上，将胶带固定在载玻片上，做 好标记。 （5）用真空镀膜仪在复型膜面上蒸发上10~20nm厚的碳膜。 （6）用尖刀将想要观察部分剪成略小于φ3mm铜网的小方块，放 入二甲苯溶液中，浸泡1小时使胶带与复型膜分离。 （7）用铜网将与胶带分离的复型膜捞到醋酸异戊脂溶液中溶掉火 棉胶。 （8）待火棉胶完全溶解后，用φ3mm铜网捞出，晾干。
制作载网的材料大多是铜，因此习惯上将载网 称为铜网，不过制作载网的材料还可以是金、 银、镍、铝、铂及尼龙。载网的大小随电镜的 需要而不同，一般直径为3mm。网孔的形状有 圆形、方形、单孔形等，网孔有50、100、200、 300及400目等多种规格。常用一般普通组织超 薄切片选用200-300目的载网，对于过小的和过 碎的样品，可选用400目的载网；对于不易查 找的样品，可选用带字母标记的载网。
Formvar支持膜的制备
在使用之前，新网和旧网都需要进行清洗，清洗 的目的除了使载网清洁之外，还有除去载网的静 电以便捞片的作用。对于新的载网，直接用95％ 的乙醇浸泡一下，再用重蒸水冲洗后自然晾干即 可。旧载网的清洗方法有以下两种：