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![半数致死量的测定-Reed-Muench法[参考内容]](https://img.taocdn.com/s1/m/2b7d0350a55177232f60ddccda38376baf1fe0de.png)
半数致死量的测定-Reed-Muench法[参考内容]Reed-Muench法是一种中和试验，通过测定病毒的感染力和免疫血清中和病毒的能力来判断中和抗体的存在。
中和试验有两种常用方法，一种是固定病毒量与等量系列倍比稀释的血清混合，另一种是固定血清用量与等量系列对数稀释的病毒混合。
中和试验不仅可以定性而且可以定量，可应用于病毒株的种型鉴定、测定血清抗体效价和分析病毒的抗原性。
毒素和抗毒素也可进行中和试验，其方法与病毒中和试验基本相同。
用组织细胞进行中和试验，有常量法和微量法两种，近年来微量法得到了广泛的应用。
在定血清－稀释病毒法(病毒中和试验)中，病毒毒价的测定单位一般使用半数致死量(LD50)。
LD50是经规定的途径，以不同的剂量接种试验动物，在一定时间内能致半数试验动物死亡的剂量。
在测定疫苗的免疫性能时，则使用半数免疫量(IMD50)或半数保护量(PD50)。
用鸡胚测定时，毒价单位为鸡胚半数致死量(ELD50)或鸡胚半数感染量(EID50)，用细胞培养测定时，使用组织细胞半数感染量(TCID50)。
测定方法：以流行性乙型脑炎病毒为例，先接种病毒并让小鼠发病濒死，然后采用无菌法取脑组织，称重并加入稀释液充分研磨，最终制成10-1悬液。
接着，将悬液离心20分钟，取上清液后逐步进行10倍递次稀释，分别制成10-1、10-2、10-3……10-9的稀释液。
每个稀释度分别接种5只小鼠，每只注射0.03ml的悬液到脑内，然后逐日观察和记录各组的死亡数。
表2-24LD50的计算（接种剂量为0.03ml）如下：病毒稀释度活鼠数死鼠数活鼠死亡死亡比鼠数(%)10-4 5 5 0 10010-5 5 10 50 66.710-6 5 15 75 5010-7 5 11 55 45.810-8 5 1 5 1010-9 5 0 0 0LD50的计算：按照Reed和Muench氏法计算，距离比例为0.5，高于50%的死亡分数为83%，低于50%的死亡分数为17%。
Reed-Muench法物受到病毒感染后，体内产生特异性中和抗体，并与相应的病毒粒子呈现特异性结合，因而阻止病毒对敏感细胞的吸附，或抑制其侵入，使病毒失去感染能力。
中和试验 (Neutralization Test)是以测定病毒的感染力为基础，以比较病毒受免疫血清中和后的残存感染力为依据，来判定免疫血清中和病毒的能力。
中和试验常用的有两种方法：一种是固定病毒量与等量系列倍比稀释的血清混合，另一种是固定血清用量与等量系列对数稀释(即十倍递次稀释)的病毒混合；然后把血清－病毒混合物置适当的条件下感作一定时间后，接种于敏感细胞、鸡胚或动物，测定血清阻止病毒感染宿主的能力及其效价。
如果接种血清病毒混合物的宿主与对照(指仅接种病毒的宿主)一样地出现病变或死亡，说明血清中没有相应的中和抗体。
中和反应不仅能定性而且能定量，故中和试验可应用于：1.病毒株的种型鉴定：中和试验具有较高的特异性，利用同一病毒的不同型的毒株或不同型标准血清，即可测知相应血清或病毒的型，所以，中和试验不但可以定属而且可以定型。
2.测定血清抗体效价：中和抗体出现于病毒感染的较早期，在体内的维持时间较长。
动物体内中和抗体水平的高低，可显示动物抵抗病毒的能力。
3.分析病毒的抗原性。
毒素和抗毒素亦可进行中和试验，其方法与病毒中和试验基本相同。
用组织细胞进行中和试验，有常量法和微量法两种，因微量法简便，结果易于判定，适于作大批量试验，所以近来得到了广泛的应用。
(一) 定血清－稀释病毒法(病毒中和试验)1.病毒毒价的测定毒价单位：衡量病毒毒价(毒力)的单位过去多用最小致死量(MLD)，即经规定的途径，以不同的剂量接种试验动物，在一定时间内能致全组试验动物死亡的最小剂量。
但由于剂量的递增与死亡率递增不呈线性关系，在越接近100％死亡时，对剂量的递增越不敏感。
而一般在死亡率越接近50％时，对剂量的变化越敏感，故现多改用半数致死量(LD50)作为毒价测定单位，即经规定的途径，以不同的剂量接种试验动物，在一定时间内能致半数试验动物死亡的剂量。
验一半数致死量的测定
半数致死量（LD 50 ）是药物、毒物及病原微生物等毒力水平的一个标志。
它表示能使全部实验对象死亡半数的剂量或浓度。
由于生物间存在个体差异性，因此LD 50 需用一批相当数量的实验对象进行实验方能测得，并且每种药物不同实验对象的LD 50 值不相同。
测定LD 50 的方法很多，如目测机率单位法、直线回归法、累计法及序贯法等。
由于寇氏法较常用，
并有计算简便，结果较准确等特点，故专门介绍之。
[ 目的] 用寇氏法测定敌百虫对小白鼠的经腹腔注射的LD 50 和95 ％可信限。
[ 方法] 寇氏法（K ?rbar氏法）
[ 条件]
1 剂量必须按等比级数（剂量对数按等级数）分组。
2 各组动物数应相等。
3 “反应”应大致呈正态分布。
最小剂量组的死亡率（P n ）应为0% ，最大剂量组的死亡率（P m ）应为100% ；
如果P n <20% 或P m >80% 需用校正公式计算；如P n >20% 或P m <80%
则不能用此法计算。
[ 步骤]
1 预备实验
（ 1 ）摸索上下限：即用少量动物逐步摸索出使全部动物死亡的最小剂量（D m ）和一个动物也不死亡的最大剂量（D n ）。
方法是据经验或文献定出一个估计量，观察2~3 只动物的死亡情况。
如全死，则降低剂量；如全不死，则加大剂量再行摸索，
直到找出P m =100% 和P n =0% 的剂量，此两量分别为上下限。
（ 2 ）确定组数，组距及各组剂量
①组数：一般 5 ～8 组，可根据适宜的组距确定组数，如先确定5 组，若组距过大，可再增加组数以缩小组距。
有时也可根据动物死亡情况来决定增减组数。
②组距：指相邻两组剂量对数之差，常用“ d ”来表示。
D 不宜过大，因过大可使标准误增大；也不宜过小，因过小则组数增多，
各组间死亡率重叠造成实验动物的浪费。
组距大小主要取决于实验动物对被试因素的敏感性。
敏感性大者，死亡率随剂量增加（或减少）
而增加（或减少）的幅度大，组距可小些；反之，敏感性小者，死亡率随剂量变化的幅度小，则组距应大些。
上下限之间的距离可作为
敏感性大小的标志。
距离大，说明敏感性小；距离小，则说明敏感性大。
一般要求d 应小于0.155 ，多在0.08 ～0.1 之间。
③确定组距方法：把上下限的剂量换算成对数值，设上限剂量的对数值为X k ，下限剂量的对数值为X 1 ，组数为G ，则：
d ＝（X k -X 1 ）/ （G-1 ）
④确定各组剂量：由X 1 逐次加 d （或由X k 逐次减 d ），得出各组剂量的对数值，再分别查反对数，
即得出各组剂量（呈等比级数排列）。
（ 3 ）配制等比药液，并使每只动物在给药容量上相等（如0.5ml/20g ）。
⒉正式实验
（ 1 ）实验动物的选择与分组
①选择原则：可根据不同实验而选取动物，应选择对被试因素敏感的动物。
同时也应考虑动物来源，经济价值及操作简便等条件。
LD 50 常用小白鼠进行实验来测得。
②分组原则：每组动物数必须多于组数。
因为每组动物数如少于组数，就不能充分反映各组死亡率的差别。
（如共8 组，
每组10 只动物，高剂量三个组的死亡数分别为6 、9 、10 ，但如果每组只用6 只动物，则高剂量三个组的死亡数可能都是6 。
）
③分组方法：见附录，实验对象分组法。
首先，按性别将动物雌雄分开或各半混合编组，然后按体重分群，再随机分组，
为求使各组平均体重相等。
（ 2 ）给药、观察死亡数、求出死亡率
①给药途径：可据不同药物及动物而定，小白鼠多用腹腔注射或灌胃法；也可静脉注射。
②给药顺序：宜采取间隔跳组方法。
如共7 组，先按2 、 4 、 6 组顺序给药，然后逆行按7 、 5 、 3 、 1 组的顺序给药。
这样可避免药物放置过久或动物饥饿造成的偏向性误差。
而且当第3 组给药后，如第2 组动物已经全死，则可省下第1 组动物及
1 号药液。
如第7 组已死亡，可补做第8 组，争取做出0 ﹪死亡率的组来。
每只动物的给药容量可按个体体重或平均体重确定。
③观察时间：直到动物不再因药物作用而死亡为止。
在观察期间应注意保证食、水、温度等生活条件，严防非被试因素引起的死亡。
最后将死亡情况及各种数据填入下表中。
3. 计算公式
①基本公式㏒LD 50 ＝X K －d( ∑ P-0.5)
式中：X K 死亡率为100 ﹪组的对数剂量
d 对数组距
∑ P 各组死亡率之和
②校正公式
当Pm>0.8 或Pn<0.2 时可用下公式计算
3-Pm-Pn
㏒LD 50 ＝X K －d( ∑ P - ───── )
4
③LD 50 ＝㏒-1 ㏒LD 50 ，单位应换算成mg ∕ kg 或g ∕ kg 表示。
④95 ％可信限：
LD 50 ± 4.5S ㏒LD50 .LD 50
S ㏒LD50 ＝d√∑p（1-p）/（n-1）
式中：S ㏒LD50 ㏒LD 50 的标准误
P 各组死亡率
n 每组动物数
[ 测定LD 50 的原理及公式来源]
为了解LD 50 测定原理，首先需了解剂量与反应的关系。
某被试因素对动物的毒性也是一种反应，
其大小往往以其使动物致死的量表示。
致死量小说明毒性大，反之说明毒性小。
根据剂量与反应的关系，
可绘出剂量反应曲线（量效曲线）。
图中表示的是以死亡频数和死亡率为反应指标的质反应量效曲线，它们具有如下特点：
1. 剂量与死亡频数的关系：是一条中间高，两侧低，右侧延长较远的曲线（图5-a ）
2. 对数剂量与死亡频数的关系：是正态分布曲线（图5-b ）
3. 剂量与死亡率的关系：是一条长尾“ S ”形曲线（图5-d ）
4. 对数剂量与死亡率的关系：是一正“ S ”形曲线（图5-c ）
从对数剂量与死亡频率的正态分布中（5-b ）可见，㏒LD 50 恰在正态曲线中点所对应的横轴上，按此剂量给药动物恰好死亡一半。
因在正态曲线中，其中点恰是均数所在处，所以㏒LD 50 就是全部实验动物最小致死剂量对数的算术平均值（也是真数剂量的几何平均值）。
从对数剂量与死亡率关系的正S 形曲线（图5-c ）中可见，㏒LD 50 恰为正S 形曲线中点所对应的横轴上的对数值，
因此正S 形曲线中点对应的纵轴（死亡率）恰为50 ％。
这条曲线的特点是：①死亡率为50 ％（即LD 50 ）时的斜率最大，
由于其位于曲线中央，故灵敏度最高。
②曲线两端平坦，接近0 ％或100 ％附近灵敏度最差，剂量不易确定，而且即使确定了也常不可靠。
所以采用半数致死量做为判定某因素毒性大小的指标是恰当的。
总之，如果求出正态曲线中点所对应的横轴上的对数值或正S 形曲线
中点所对应的横轴上的对数值，即可求出㏒LD 50 及LD 50 。
公式推导：根据对数剂量与死亡率关系的量数曲线，通过面积法可得出公式：
LogLD 50 =X K –d ∑（p i – p i+1 ）/2
图中横坐标为对数剂量X ，纵坐标为死亡率P ，G 为正S 形曲线中点，它对应
的纵坐标H 点P ＝50 ％，
横坐标 F 点X ＝㏒LD 50 ，A 点P ＝0 ％＝0 ，D 点P ＝100 ％＝ 1 ，B 点X K 为P ＝100 ％的对数剂量。
由图可知：矩形AFED ＝AF×AD ＝㏒LD 50 ×1 ＝㏒LD 50
又：曲边△X 1 FG ≌曲边△GCE （二边一角相等）
∴矩形AFED ＝曲边形AX 1 CD ＝㏒LD 50
则㏒LD 50 ＝矩形AX K CD －曲边形X 1 X K C 。
∵曲边形X 1 X K C 相当于多个梯形面积之总合。
∴曲边形X 1 X K C ＝d× ∑ (P i +P i+1 )
又矩形AX K CD ＝AX K ×CD ＝X K ×1 ＝X K
∴㏒LD 50 ＝X K - d ∑ (P i +P i+1 )
上述推导过程用直观图表示
：。
