蛋白质浓度测定(考马斯亮蓝法)

考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度原理好啦，今天咱们来聊聊“考马斯亮蓝法”测定蛋白质浓度的原理。

听到这个名字可能大家会有点懵，啥是考马斯亮蓝？它到底是干嘛的？别看它名字一看就感觉有点高大上，真正用起来就像是做一道小实验，特别简单。

首先要知道，蛋白质是咱们身体里最重要的成分之一，也常常在实验室中“出没”，科学家们想要知道一种液体中蛋白质的浓度，这时候就得用一些“神器”来测量。

你可能想，“哎呀，这不就跟量体重一样吗？你看电子秤呗。

”好吧，体重当然得上秤，但是蛋白质浓度测定可没那么简单，得用到一些特殊的方法和化学试剂。

考马斯亮蓝法，就是其中一个经典的检测蛋白质浓度的好方法，别看名字听起来有点像是外星人发明的，它其实就跟在化学课上混过的一些试剂一样。

咋说呢，简单来说，这个方法利用了一种叫做“考马斯亮蓝”的染料。

这种染料特别调皮，遇到蛋白质就会发生变化，变色。

这种变化就像是“吃了辣条后的舌头变色”，染料原本是褐色的，但一碰到蛋白质，它就变成了蓝色。

是不是感觉有点魔法的感觉？不过，别急，接下来咱们来捋一捋它是咋运作的。

考马斯亮蓝这种染料本身是有点酸性的，跟液体中的蛋白质一接触，它就会和蛋白质上的一些氨基酸残基结合。

这么一结合，它的颜色就变了。

为什么呢？因为蛋白质和染料结合后，染料的结构就发生了变化，光学特性也发生了改变，所以它的吸光度会发生变化，这就是最直接的信号。

大家可以想象一下，当你看着水中的浮标，水波动了，浮标的位置也会随着波动变化，波动越大，浮标的位置变得就越明显。

所以，通过测定颜色的变化，咱们就能知道溶液里有多少蛋白质。

好啦，听起来是不是觉得特别简单？基本上，这个方法就是通过吸光度的变化来测量浓度的。

其实它的原理和咱们平时看到的很多测量工具差不多，就像光线穿过玻璃杯里装的水，水越浑浊，光穿过的程度就越少，咱们就知道水是混的，浑浊程度越高。

这个实验里的吸光度，实质上就是光通过液体时被阻挡的程度。

科学家们通过这个吸光度变化来推算出蛋白质的浓度。

考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度的具体方法及步骤蛋白质浓度测定的方法有很多，考马斯亮蓝测定蛋白质是实验室最常见的一种方式，它利用比色法和色素法混合方法、操作简便，下文介绍了考马斯亮蓝测定蛋白质浓度的原理、优缺点、操作以及注意事项。

实验原理考马斯亮蓝(Coomassie Brilliant Blue)法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。

这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。

这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。

考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰(lmax)的位置，由465 nm变为595 nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。

通过测定595 nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。

研究发现，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合。

考马斯亮蓝染色法的突出优点是：(1)灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1 mg。

这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质-染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。

(2)测定快速、简便，只需加一种试剂。

完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。

由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。

因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。

(3)干扰物质少。

如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。

此法的缺点是：(1)由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此考马斯亮蓝染色法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。

(2)仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、Triton X-100、十二烷基硫酸钠(SDS)等。

一、原理考马斯亮蓝G-250（Coomassie G-250）是一种甲基取代的三苯基甲烷，分子中磺酸基的蓝色染料，在465nm处有最大吸收值。

考马斯亮蓝G-250能与蛋白质通过范得华相互作用形成蛋白质—考马斯亮蓝复合物蓝色溶液，引起该染料的最大吸收λmax的位置发生红移，在595nm处有最大吸收值。

由于蛋白质—考马斯亮蓝复合物在595nm处的光吸收远高于考马斯亮蓝在465nm处的光吸收，因此，可大大地提高蛋白质的测定灵敏度。

蛋白质—考马斯亮蓝复合物溶液颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。

利用溶液颜色的差异进行比色测定，适合于蛋白质类的定量分析，尤其适合于稀有蛋白质的微量分析。

考马斯亮蓝G-250试剂呈色反应颜色稳定、灵敏度高，最低测试蛋白质量在1ug 左右。

二、操作步骤1. 标准曲线测定法分别取六只试管，其中一只加入1.0ml蒸馏水做空白，5只分别加入不同体积的浓度为100ug/ml牛血清清蛋白标准液，补充水到1.0ml。

然后每只试管加入5. 0ml考马斯亮蓝G-250试剂，摇匀放置5min，在紫外-可见分光光度计595nm处测定吸光值。

以A595吸光值为纵坐标，牛血清清蛋白的ug数量为横坐标绘制标准曲线。

具体操作见下表。

蛋白质标准曲线测定加样试剂空白 1 2 3 4 5100ug/ml牛血清清蛋白/ml 1.0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8牛血清清蛋白/ug 0 10 20 40 60 80去离子水/ml 0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2考马斯亮蓝G-250试剂/ml 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0吸光值A5952. 蛋白样品配制浓度约100ug/ml的待测蛋白质溶液。

取一只试管加入1.0ml蒸馏水做空白，一支加入0.5ml待测蛋白质溶液，补充水到1.0ml。

然后每支试管加入5.0ml考马斯亮蓝G-250试剂，摇匀放置5min后，在紫外-可见分光光度计595nm处测定吸光值。

用考马斯亮蓝G250法测定蛋白质含量呵呵你的自己检查一下你的仪器蛋白质浓度的测定(四)??考马斯亮蓝染色法目的要求学习考马斯亮蓝(Coomassie Brilliant Blue)法测定蛋白质浓度的原理和方法。

实验原理考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。

考马斯亮蓝G―250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。

它和蛋白质通过范德华力结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律(Beer’s law)。

此染料与蛋白质结合后颜色有红色形式和蓝色形式，最大光吸收由465nm变成595nm，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。

蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2min即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定1h，之后，蛋白质―染料复合物发生聚合并沉淀出来。

蛋白质―染料复合物具有很高的消光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，在测定溶液中含蛋白质5µL/ml时就有0.275光吸收值的变化，比Lowry法灵敏4倍，测定范围为10,100µg蛋白质，微量测定法测定范围是1,10µg蛋白质。

此反应重复性好，精确度高，线性关系好。

标准曲线在蛋白质浓度较大时稍有弯曲，这是由于染料本身的两种颜色形式光谱有重叠，试剂背景值随更多染料与蛋白质结合而不断降低，但直线弯曲程度很轻，不影响测定。

此方法干扰物少，研究表明:NaCl，KCl，MgCl2，乙醇，(NH4)2SO4无干扰。

强碱缓冲液在测定中有一些颜色干扰，这可以用适当的缓冲液对照扣除其影响。

Tris，乙酸，2―巯基乙醇，蔗糖，甘油，EDTA及微量的去污剂如TritonX―100，SDS，玻璃去污剂有少量颜色干扰，用适当的缓冲液对照很容易除掉。

但是，大量去污剂的存在对颜色影响太大而不易消除。

试剂与器材一、试剂考马斯亮蓝试剂:考马斯亮蓝G―250 100mg溶于50ml95%乙醇中，加入100ml85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000ml，滤纸过滤。

实验名称：蛋白质的定量测定---考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度【实验原理】考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质-燃料结合的原理。

考马斯亮蓝G-250染料，在酸性溶液时呈茶棕色，最大吸收峰在465nm。

当与蛋白质结合后变成深蓝色，最大吸收峰转至595nm，且其光吸收值与蛋白质含量（10~100μg/ml蛋白质浓度）成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。

【实验准备】一、材料（1）血清二、试剂（1）考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝G-250 100mg溶于50ml 95%乙醇中，加入100ml 85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000ml。

(2)标准蛋白质溶液：结晶牛血清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根基其纯度用0.15mol/L NaCl配置成1.0mg/ml蛋白溶液。

（3）0.9% NaCl溶液。

三、器材（1）试管和试管架（2）722型分光光度计（3）吸量管（4）移液枪【实验步骤】一、制作标准曲线取6支干燥洁净的试管，编号按下表加入试剂光度值（A595值）。

以吸光度值为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘出标准曲线。

二、血清蛋白质浓度测定测定方法同上。

1mL稀释血清加2.5mL考马斯亮蓝试剂，血清用0.9%NaCl稀释200倍，使其测定值在标准曲线的直线范围内。

用上述0号管调零，测出血清的A595值。

【实验结果】以吸光度A595（2）根据所测血清的值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，乘以稀释倍数，从而计算出血清的蛋白质浓度（mg/ml）0.26 mg/ml【实验讨论】①必须在试剂加入后的5~20min内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。

②测定中蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，测定完后可用乙醇将比色杯洗干净。

③不要将标准蛋白质和待测蛋白质搞混，以免造成实验结果的改变。

④考马斯亮蓝（ＣＢＢ）显色法测定蛋白质含量的主要缺点之一是线性关系差．通过研究显色液组分对线性关系的影响，发现显色液Ｈ＋浓度是影响线性关系的主要因素【1】。

牛奶（酸奶）和豆浆中蛋白质浓度的测定一、目的学会用考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度。

二、原理考马斯亮蓝能与蛋白质的疏水微区相结合，这种结合具有高敏感性。

考马斯亮蓝G250的磷酸溶液呈棕红色，最大吸收峰在465nm。

当它与蛋白质结合形成复合物时呈蓝色，其最大吸收峰改变为595nm，考马斯亮蓝G250—蛋白质复合物的高消化效应导致了蛋白质定量测定的高敏感度。

在一定范围内，考马斯亮蓝G250—蛋白质复合物成色后，在595nm下，吸光度与蛋白质含量呈线性关系。

故可以用于蛋白质浓度的测定。

三、实验器材1..试管8支2.吸管3. 722型分光光度计4.容量瓶1000ml5.量筒100ml四、实验试剂1.0.9%NaCl溶液2.标准蛋白液：牛血清白蛋白（0.1mg/ml),准确称取牛血清白蛋白0.2g，用0.9%NaCl溶液溶解并稀释至2000ml3.染液：考马斯亮蓝G250(0.01%),称取0.1g考马斯亮蓝G250溶于50ml95%乙醇中，再加入100ml浓磷酸（即市售的质量百分浓度为85%的磷酸），然后加蒸馏水定容到1000ml。

4.样品液：取牛血清白蛋白（0.1mg/ml)溶液，用0.9%NaCl稀释至一定浓度。

五、操作1.标准曲线的制备取7只干净试管，按表1进行编号并加入试剂。

混匀，室温静置3min，以第一管为空白，于波长595nm处比色，读取吸光度，以吸光度为纵坐标，各标准液浓度（ug/ml)作为纵坐标作图得标准曲线。

表1 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度——标准曲线的制备试剂管号1（空白）2 3 4 5 6 7标准蛋白液/ml0.9%NaCl/ml考马斯亮蓝染液/ml 蛋白质浓度/(ug/ml)——1.04.00.10.94.0100.20.84.0200.30.74.0300.40.64.0400.60.44.0600.80.24.080A595nm2.样液的测定另取一支干净试管，加入样品液1.0ml及考马斯亮蓝染液4.0ml，混匀，室温静置3min,于波长595nm处比色，读取吸光度，由样品液的吸光度查标准曲线即可求出含量。

BCA法和考马斯亮蓝法测蛋白质浓度分光光度法介绍分光光度法是利用溶液中特定溶质的光吸收测定其浓度的方法，其基本原理是根据Lambert和Beer定律。

一 Lambert定律当一束平行单色光垂直照射于一均匀物质溶液时，溶液将吸收一部分光能，使光的强度减弱。

若溶液的浓度不变，则在溶液中的光程越长，光线强度的减弱也越显著。

设：入射光强度为I0，透射光强度为I，L代表光在溶液中的光程。

I0lg =K1L IK1是常数，受光线波长，溶液性质，溶液浓度影响。

二 Beer定律当一束光通过一溶液时，光能被溶液介质吸收一部分，若光程不变，则溶液的浓度越大，光吸收越强，透射光强度的减弱也越显著，光线减弱的比例与溶液浓度呈正比。

I0lg =K2C IK2为吸收系数，是常数。

溶液对光吸收的强弱与溶液浓度C成正比。

三 Lambert-Beer定律将以上两个定律合并： Iolg =KCL IIoI令A=lg T= 则A=KCL=-lgTIIoT为透光度，A为吸光度，K为消光系数四待测样品浓度的计算 A标=KC标L A样=KC样L 由于是同一物质及相同的光程，则：A样/A标=KC样L/KC标L=C样/C标即：C样=（A样/A标）*C样故已知标准溶液的浓度及吸光度，依据公式可计算出待测样品溶液的浓度。

一实验名称： BCA法测定蛋白质含量二实验原理：BCA即二奎�@甲酸。

在碱性条件下，蛋白的肽键结构将二价铜离子还原为亚铜离子，亚铜离子与BCA试剂形成稳定的紫色络合物，并在562nm处有最大的光吸收值，该复合物颜色深浅与蛋白质的浓度成正比，故可通过吸收值的大小对蛋白质进行定量。

三实验步骤：A 标准品的稀释：将9支干燥的1.5ml离心管编号，按表加入下列试剂：1.2ml离心管 A B C D E F G H IBCA法标准曲线和样品测定ddH2O（μL2mg/mLBSA（μL蛋白质终浓度（μg/mL) ））0 50μL标准品2000 125 375μL标准品1500 325 325μL标准品 1000 175175μLB管混合液750 325 325μLC管混合液500 325 325μLE管混合液 250 325325μLF管混合液125 400 100μLG管混合液 25 400 0 0=BlankB 配置BCA工作液：依据样品数量，将试剂A和试剂B按体积比50:1配制适量BCA工作液，并充分混匀。

考马斯亮蓝法测定微量蛋白质含量
1．目的：测定发酵液中的总蛋白质含量
2．原理：考马斯亮蓝染液与蛋白质中的碱性氨基酸（精氨酸）和芳香族残基结合，呈红色在595nm波长处有吸收。

3．材料和方法：
3.1考马斯亮蓝：考马斯亮蓝0.01% 100 mg
95%乙醇4.7% 50 mL
8%磷酸8.5 100 mL
(1)称取100 mg考马斯亮蓝，溶解于50mL乙醇95%.
(2)加入100 mL浓磷酸，定容至1000 mL。

3.2牛血清蛋白标准溶液: 牛血清蛋白100ug
Nacl 0.15mol/L
称取牛血清蛋白100ug，溶解于0.15mol/L的nacl中。

4.标准曲线的制作
5.样品的测定：、
同标准曲线的制作，样品稀释时用0.15mol/L的nacl。

6．注意事项：
(1)比色杯用酒精清洗干净。

(2)测定的是总蛋白的含量。

附：戴坤标准曲线y=188.6x-39.9 Y是蛋白浓度ug/ML, X是吸光度。