蛋白质含量测定法考马斯亮蓝法

蛋白质含量测定法——考马斯亮蓝法[实验目的]学习、掌握考马斯亮蓝法（Bradford 法）测定蛋白质含量的方法[实验原理]（蓝色）变为氨基酸芳香族碱性染料考马斯亮蓝磷酸nm G 595250m ax λ−−→−+-[器材与试剂]器材722型可见光分光光度计、漩涡混合器、试管16支 试剂1.标准蛋白质溶液，用牛血清清蛋白（BSA ），配制成1.00mg/ml 。

2.考马斯亮蓝G-250染料试剂：称100mg 考马斯亮蓝，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85% 的磷酸，用水稀释至1升。

[实验方法]标准方法1.取10支试管，分别编号后按 表1 剂量依次加入标准蛋白（或未知蛋白）、去离子水和考马斯亮蓝染料。

每支试管加完后，立即在漩涡混合器上混合。

2.加完染料20min 后，使用722分光光度计，塑料比色皿，在595nm 处测量吸光度A 595。

3.用标准蛋白浓度（mg/ml ）为横坐标，用A 595为纵坐标，进行直线拟合，得到标准曲线。

根据测得的未知样品的A 595，代入公式即可求得未知样品的蛋白质含量。

根据所测样品的吸光度,在标准曲线上查得相应的蛋白质含量,按下式计算: 样品蛋白质含量(μg/g 鲜重)=）测定时提取液体积（）样品重（）提取液总体积（）查得的蛋白质（ml g ml g g ⨯⨯/μ以蛋白标准溶液浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

计算出回归方程。

如Y=aX+b让后把待测样品的吸光值代入回归方程，算出待测样品浓度 SDS 干扰实验1.取5支试管，分别编号后按表2剂量依次加入标准蛋白、SDS 、去离子水和考马斯亮蓝染料。

每支试管加完后，立即在漩涡混合器上混合。

2.加完染料20min 后，使用753分光光度计，塑料比色皿，在595nm 处测量吸光度A 595。

[实验数据与结果分析]（一）标准方法的数据和图表1 考马斯亮蓝标准法实验表格根据表1，以A595为纵坐标，标准蛋白质量/（μg）为横坐标，作图1。

实验名称：蛋白质的定量测定---考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度【实验原理】考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质-燃料结合的原理。

考马斯亮蓝G-250染料，在酸性溶液时呈茶棕色，最大吸收峰在465nm。

当与蛋白质结合后变成深蓝色，最大吸收峰转至595nm，且其光吸收值与蛋白质含量（10~100μg/ml蛋白质浓度）成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。

【实验准备】一、材料（1）血清二、试剂（1）考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝G-250 100mg溶于50ml 95%乙醇中，加入100ml 85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000ml。

(2)标准蛋白质溶液：结晶牛血清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根基其纯度用0.15mol/L NaCl配置成1.0mg/ml蛋白溶液。

（3）0.9% NaCl溶液。

三、器材（1）试管和试管架（2）722型分光光度计（3）吸量管（4）移液枪【实验步骤】一、制作标准曲线取6支干燥洁净的试管，编号按下表加入试剂光度值（A595值）。

以吸光度值为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘出标准曲线。

二、血清蛋白质浓度测定测定方法同上。

1mL稀释血清加2.5mL考马斯亮蓝试剂，血清用0.9%NaCl稀释200倍，使其测定值在标准曲线的直线范围内。

用上述0号管调零，测出血清的A595值。

【实验结果】以吸光度A595（2）根据所测血清的值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，乘以稀释倍数，从而计算出血清的蛋白质浓度（mg/ml）0.26 mg/ml【实验讨论】①必须在试剂加入后的5~20min内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。

②测定中蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，测定完后可用乙醇将比色杯洗干净。

③不要将标准蛋白质和待测蛋白质搞混，以免造成实验结果的改变。

④考马斯亮蓝（ＣＢＢ）显色法测定蛋白质含量的主要缺点之一是线性关系差．通过研究显色液组分对线性关系的影响，发现显色液Ｈ＋浓度是影响线性关系的主要因素【1】。

考马斯亮蓝法测定蛋白质含量1. 前言嘿，朋友们，今天咱们聊聊一个有趣的话题——考马斯亮蓝法，听起来挺高大上的吧？其实这玩意儿就是用来测定蛋白质含量的，简单来说，就是看看你的食物里到底有多少“肌肉”的成分。

想象一下，咱们吃的肉、蛋、豆腐，都是富含蛋白质的食物，咱们用这个方法可以精确地知道它们含有多少蛋白质，绝对是个好玩的实验，来吧，跟我一起揭开它的神秘面纱。

2. 什么是考马斯亮蓝法？2.1 简单介绍首先，咱们来聊聊什么是考马斯亮蓝法。

它其实是一种颜色变化的实验，听起来是不是有点像魔法？你只要把样品（比如说一小块肉或者一勺蛋白质粉）放在试管里，加点特殊的染料，这染料就叫考马斯亮蓝，之后再加点酸溶液，哇，你会发现颜色发生了变化。

更厉害的是，颜色的深浅就能告诉你蛋白质的含量，简直像变魔术一样！这就是为什么它受到许多科学家和实验室的青睐。

2.2 原理揭秘那么，这个颜色变化的背后，究竟有什么科学原理呢？嘿，别着急，听我慢慢说。

考马斯亮蓝这种染料会和蛋白质中的氨基酸发生反应，形成一种稳定的复合物。

这就像是小伙伴们在一起聚会，越多人参加，气氛就越热烈。

随着蛋白质的浓度增加，复合物的数量也就随之增加，所以颜色也会越来越深。

只要用仪器测量一下颜色的深度，咱们就能算出蛋白质的含量，真是既简单又方便。

3. 实验步骤3.1 准备工作想要在家里试一试这个方法，当然得先做好准备。

首先，你得准备好一些材料：考马斯亮蓝染料、酸性溶液（一般用盐酸就可以）、待测样品（不妨试试豆腐或者鸡肉），还有一些基本的实验器材，比如试管、比色皿、量筒等。

别小看这些东西，有时候实验的成功与否就看这些小玩意儿了。

3.2 操作步骤接下来，就是真正的实验时刻了！首先，咱们把待测样品处理一下，比如切成小块，然后用水萃取出蛋白质。

接着，把提取液倒入试管，加入考马斯亮蓝染料，搅拌均匀。

再倒入酸性溶液，注意，这里要控制好比例，不然可就要出乱子了。

然后，静置几分钟，让颜色充分反应。

标准曲线制作—考马斯亮蓝法测蛋白质含量欧阳学文一、标准曲线一般用分光光度法测物质的含量，先要制作标准曲线，然后根据标准曲线查出所测物质的含量。

因此，制作标准曲线是生物检测分析的一项基本技术。

二、蛋白质含量测定方法1、凯氏定氮法2、双缩脲法3、Folin酚试剂法4、紫外吸收法5、考马斯亮蓝法三、考马斯亮蓝法测定蛋白质含量—标准曲线制作（一）、试剂：1、考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝G—250 100mg溶于50ml 95%乙醇，加入100ml 85% H3PO4，用蒸馏水稀释至1000ml,滤纸过滤。

最终试剂中含0.01%（W/V）考马斯亮蓝G—250,4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）H3PO4。

2、标准蛋白质溶液：纯的牛血清血蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度同0.15mol/LNaCl配制成100ug/ml蛋白溶液。

（二）、器材：1、722S型分光光度计使用及原理（）。

2、移液管使用（）。

（三）、标准曲线制作：1、A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标（六个点为10ug、20 ug、30 ug、40 ug、50 ug、60 ug），在坐标轴上绘制标准曲线。

1）、利用标准曲线查出回归方程。

2）、用公式计算回归方程。

3）、或用origin作图，测出回归线性方程。

即A595nm=a×X( )+6一般相关系数应过0.999以上，至少2个9以上。

4）、绘图时近两使点在一条直线上，在直线上的点应该在直线两侧。

（四）、蛋白质含量的测定：样品即所测蛋白质含量样品（含量应处理在所测范围内），依照操作步骤1操作，测出样品的A595nm，然后利用标准曲线或回归方程求出样品蛋白质含量。

一般被测样品的A595nm值在0.1—0.05之间，所以上述样品如果A595nm值太大，可以稀释后再测A595nm值，然后再计算。

（五）、注意事项：1、玻璃仪器要洗涤干净。

2、取量要准确。

3、玻璃仪器要干燥，避免温度变化。

标准曲线制作—考马斯亮蓝法测蛋白质含量一、标准曲线一般用分光光度法测物质得含量,先要制作标准曲线,然后根据标准曲线查出所测物质得含量。

因此,制作标准曲线就是生物检测分析得一项基本技术。

二、蛋白质含量测定方法1、凯氏定氮法2、双缩脲法3、Folin-酚试剂法4、紫外吸收法5、考马斯亮蓝法三、考马斯亮蓝法测定蛋白质含量—标准曲线制作(一)、试剂:1、考马斯亮蓝试剂:考马斯亮蓝G—250 100mg溶于50ml 95%乙醇,加入100ml 85% H3PO4,用蒸馏水稀释至1000ml,滤纸过滤。

最终试剂中含0、01%(W/V)考马斯亮蓝G—250,4、7%(W/V)乙醇,8、5%(W/V)H3PO4。

2、标准蛋白质溶液:纯得牛血清血蛋白,预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量,根据其纯度同0、15mol/LNaCl配制成100ug/ml蛋白溶液。

(二)、器材:1、722S型分光光度计使用及原理()。

2、移液管使用()。

(三)、标准曲线制作:1、2、以A595nm为纵坐标,标准蛋白含量为横坐标(六个点为10ug、20 ug、30 ug、40 ug、50 ug、60 ug),在坐标轴上绘制标准曲线。

1)、利用标准曲线查出回归方程。

2)、用公式计算回归方程。

3)、或用origin作图,测出回归线性方程。

即A595nm=a×X( )+6一般相关系数应过0、999以上,至少2个9以上。

4)、绘图时近两使点在一条直线上,在直线上得点应该在直线两侧。

(四)、蛋白质含量得测定:样品即所测蛋白质含量样品(含量应处理在所测范围内),依照操作步骤1操作,测出样品得A595nm,然后利用标准曲线或回归方程求出样品蛋白质含量。

一般被测样品得A595nm值在0、1—0、05之间,所以上述样品如果A595nm值太大,可以稀释后再测A595nm值,然后再计算。

(五)、注意事项:1、玻璃仪器要洗涤干净。

2、取量要准确。

3、玻璃仪器要干燥,避免温度变化。

考马斯亮蓝法测蛋白质含量原理考马斯亮蓝法是一种常用的蛋白质含量测定方法，其原理是利用考马斯亮蓝与蛋白质结合形成蓝色络合物，通过比色测定蛋白质含量。

这种方法具有操作简便、灵敏度高、结果稳定等优点，被广泛应用于蛋白质含量的测定。

首先，将待测样品与考马斯亮蓝溶液充分混合，使蛋白质与考马斯亮蓝发生络合反应。

考马斯亮蓝与蛋白质结合后，形成蓝色络合物，其吸光度与蛋白质的含量成正比。

然后，利用分光光度计测定络合物的吸光度，根据标准曲线或计算公式，可以精确地计算出待测样品中蛋白质的含量。

在进行考马斯亮蓝法测定蛋白质含量时，需要注意一些关键操作。

首先，样品的制备要求精确，必须保证待测样品中蛋白质的完全溶解和混合均匀。

其次，在与考马斯亮蓝溶液混合后，需要充分反应一定时间，以保证蛋白质与考马斯亮蓝充分结合形成稳定的络合物。

最后，在测定吸光度时，应选择合适的波长，并进行零点校正，确保测定结果的准确性。

考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的优点之一是操作简便。

相比于其他方法，考马斯亮蓝法无需复杂的仪器和操作步骤，只需常见的实验设备和基本的化学品即可完成测定。

另外，该方法的灵敏度高，可以测定微量的蛋白质，适用于各种类型的样品。

此外，考马斯亮蓝法的结果稳定可靠，具有较高的重复性和准确性，被广泛用于生物化学、分子生物学等领域的蛋白质研究中。

总的来说，考马斯亮蓝法是一种简便、灵敏、稳定的蛋白质含量测定方法，其原理是利用考马斯亮蓝与蛋白质形成络合物，通过比色测定蛋白质含量。

在进行测定时，需要注意样品制备、反应时间和吸光度测定等关键操作，以确保测定结果的准确性和可靠性。

考马斯亮蓝法已成为蛋白质研究中常用的技术手段，为科研工作者提供了重要的实验数据支持。